◎ 許競思

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350000）

隨著人們對生活質(zhì)量要求的提高，食品安全問題在人們心中的關(guān)注度不斷提升，這在一定程度上促進(jìn)了我國食品安全檢查部門在工作上的調(diào)整與發(fā)展。采用更加先進(jìn)的技術(shù)進(jìn)行食品安全檢測，能夠進(jìn)一步保證食品質(zhì)量，確保消費(fèi)者能夠購買到放心的食品。相對于其他微生物檢測技術(shù)，PCR檢測技術(shù)依靠其高精準(zhǔn)性和高效率等特點(diǎn)脫穎而出，在一定程度上給食品檢測部門的食品微生物檢測工作帶來了巨大便利。通過該技術(shù)的應(yīng)用，能夠在更短的時間內(nèi)檢測出食品中的致病菌情況，例如某地出現(xiàn)食物中毒群體事件，通過PCR檢測技術(shù)快速檢出食物中的病原微生物種類，及時為患者的救治提供方向；并且PCR檢測技術(shù)能夠通過實(shí)驗(yàn)的方式推斷出食品在生產(chǎn)后階段內(nèi)微生物的繁殖速度與最大繁殖量，能夠在具有預(yù)見性的基礎(chǔ)上對食品安全進(jìn)行有效檢查。

1 PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測中的作用

1.1 PCR技術(shù)原理

PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測的原理可簡要概括為：經(jīng)高溫變形、低溫退火及中溫延伸等3步不同環(huán)節(jié)反復(fù)操作，從而檢測微生物的核酸序列，通過利用單個核酸分子序列完成復(fù)制，達(dá)到擴(kuò)增的目的。具體分析PCR技術(shù)的應(yīng)用原理，需根據(jù)溫度不同整合信息，即高溫變形[1]。被檢測食品微生物處于雙鏈狀態(tài)的DNA序列于溫度高達(dá)94 ℃狀況下變性，成功解鏈，以雙鏈形式存在，低溫退火。55 ℃下，被檢測微生物特異性引物與處于單鏈狀態(tài)的DNA進(jìn)行融合，中溫延伸。72 ℃下，需以被檢測微生物引物的引導(dǎo)延伸為條件進(jìn)行復(fù)制，檢測微生物的DNA序列。以上所述3點(diǎn)，PCR的應(yīng)用需反復(fù)操作，直至獲取足量被檢測微生物的DNA序列，以達(dá)到PCR技術(shù)檢測要求。

1.2 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR技術(shù)是食品進(jìn)行微生物檢測中的主要技術(shù)手段，其主要依靠的是熒光傳遞技術(shù)對微生物基因進(jìn)行標(biāo)記，并通過記錄不同時間內(nèi)被標(biāo)記DNA的數(shù)量，檢測微生物的繁殖能力。在該技術(shù)的具體實(shí)施中，主要是依賴受體發(fā)色團(tuán)之間的偶極—負(fù)極之間的相互影響與相互聯(lián)系實(shí)現(xiàn)的，并結(jié)合能量進(jìn)行轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行檢測，供體發(fā)色基因-受體發(fā)色基因會表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的熒光，并且熒光的強(qiáng)度與DNA的產(chǎn)生數(shù)量呈正比關(guān)系[2]。所以在進(jìn)行實(shí)際檢測的過程中，可以將該技術(shù)應(yīng)用其中，通過記錄靶序列初始濃度，檢測反應(yīng)過程中熒光實(shí)際濃度來得到所需要的檢測結(jié)果。在該檢測技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用中，能夠?qū)κ称分兴械奈⑸镞M(jìn)行基因標(biāo)記和基因復(fù)制，即使食品中含有的微生物數(shù)量較少，同樣可以通過標(biāo)記與記錄初始濃度的方式進(jìn)行食品微生物檢測。該檢測方式具有自動化高，操作簡單、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，適用于我國當(dāng)前的食品環(huán)境市場。因此，該檢測技術(shù)在實(shí)際檢測中得到諸多應(yīng)用，有著極高的發(fā)展與普及速度。

2 PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的測定方法

PCR技術(shù)在食品檢測中有著十分出眾的表現(xiàn)，并且應(yīng)用范圍廣泛。例如，在食品檢測中最常見的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等，都能夠通過PCR檢測方式進(jìn)行有效檢測。以金黃色葡萄球菌為例，其在水果、蔬菜中繁殖速度很快，如果水果、蔬菜存放時間較久，則果蔬的表面很容易繁殖大量的金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物腸毒素對人體的損傷很大，嚴(yán)重的情況下會導(dǎo)致食用者出現(xiàn)食物中毒情況。因此，在對食品檢查的過程中，就需要對類似菌進(jìn)行科學(xué)檢查，排除其給人體造成的威脅隱患。本文所研究的PCR技術(shù)，就能夠?qū)Ρ粰z測食物樣品中的相關(guān)物質(zhì)及微量元素進(jìn)行檢測，并且檢測精準(zhǔn)度極高，食品生產(chǎn)企業(yè)采用該技術(shù)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，能夠有效避免這些不合格的食品流入市場[3]。在具體檢測中，其主要的檢測手段是對特定蛋白進(jìn)行標(biāo)記，并且通過對蛋白的檢測，間接獲得被檢測微生物的含量。PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用十分廣泛，能夠針對不同被檢測菌展開有效檢測，提高檢測的準(zhǔn)確性。

2.1 常規(guī)PCR檢測法

常規(guī)PCR檢測法是進(jìn)行食品微生物檢測中最常用的檢測手段，其主要是針對測定目標(biāo)物質(zhì)的DNA模板和與其反應(yīng)的引物進(jìn)行混合。在檢測的過程中，在混合后的混合物內(nèi)加入一定量的聚合酶就能夠制作成最基本的檢測樣本。在后期的檢測中，還需要在特定的溫度與反應(yīng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)反應(yīng)。在適合的溫度下，添加了聚合酶的混合物會在聚合酶的作用下促使目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行基于電腦模板序列下的擴(kuò)增，在經(jīng)過多個周期后，模板DNA片段可以不斷地復(fù)制與擴(kuò)增。在實(shí)際檢測工作開展中，測定物上特定DNA能夠反映出被檢測食物在特定時間內(nèi)會產(chǎn)生的物生物種類與數(shù)量。常規(guī)的檢測手段主要是利用了DNA的復(fù)制能力與擴(kuò)增能力，將潛在的、少量的微生物群形成可觀的微生物群，實(shí)現(xiàn)基本的食品微生物檢測。

2.2 多重PCR檢測法

多重PCR檢測法是基于常規(guī)檢測方法上進(jìn)行改變與創(chuàng)新形成的檢測方法。常規(guī)檢測方法采用的是單引物的方式進(jìn)行檢測，而多重PCR檢測手段則是采用多個DNA引物進(jìn)行檢測。例如，在同一個PCR反應(yīng)體系內(nèi)，需要加入兩個或兩個以上的反應(yīng)引物，這些反應(yīng)引物同樣需要在聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。由于在反應(yīng)前加入了多個DNA引物，再通過聚合酶反應(yīng)后，能夠得到多個不同的DNA反應(yīng)片段。因此，多重PCR檢測方式能夠針對微生物的多個致病因子進(jìn)行分析與測定，可以大幅度提高檢測的準(zhǔn)確率與效率。相比較常規(guī)PCR檢測法而言，其所分析出的致病因子更多，可以避免檢測過程中出現(xiàn)被檢測菌遺漏的情況，是提高檢測嚴(yán)謹(jǐn)性的有效方法。因此，在當(dāng)前食品微生物檢測中，除了對具有針對性的致病菌進(jìn)行檢測以外，大多數(shù)情況下會采用多重PCR檢測法進(jìn)行食品微生物檢測，能夠在最大程度上降低檢測內(nèi)容遺漏的情況發(fā)生，有效縮短了檢測時間，提高了檢測的準(zhǔn)確率。并且該檢測法能夠減少樣本的投入量，在一定程度上還具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，在檢測過程中可以直接對多個基因進(jìn)行檢測。

2.3 PR-PCR檢測法

PR-PCR檢測是PCR檢測法的一種變形，其與常規(guī)檢測法存在一定的區(qū)別，但是在食品微生物檢測工作中卻具有一定的優(yōu)勢。該方法的檢測原理主要是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用01igo（dT）或隨機(jī)引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。該檢測法與常規(guī)檢測法的區(qū)別在于將檢測目標(biāo)中的一條RNA先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到與之互補(bǔ)的DNA，并以此目標(biāo)為基礎(chǔ)進(jìn)行后期的復(fù)制和擴(kuò)增。在該技術(shù)實(shí)施中，需要重點(diǎn)注意的是所逆轉(zhuǎn)錄的DNA模板必須是完整的，并且不含有蛋白質(zhì)或者是其他雜質(zhì)，這條基因鏈必須完整。在后期的微生物檢測工作開展中，可以用于微生物檢測的定量分析，如將熒光技術(shù)與數(shù)字技術(shù)結(jié)合的PCR檢測，通過將所測定目標(biāo)中的微生物進(jìn)行定量的方式進(jìn)行相關(guān)檢測，能夠確保檢測過程具有較高的靈敏性，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。在實(shí)際食品微生物檢測工作開展中，運(yùn)用PR-PCR檢測法，能夠具有針對性地檢測微生物，可以確保檢測結(jié)果的精準(zhǔn)度更高。

3 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

PCR技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用到食物、水源的檢測中，其在微生物檢測中占有重要的地位。

3.1 用于食品致病菌的檢測

傳統(tǒng)的食品微生物檢測手段十分落后，不僅檢測過程煩瑣，而且檢測的準(zhǔn)確率難以得到保障。在傳統(tǒng)的檢測手段下進(jìn)行食品微生物檢測，需要對被檢測的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，當(dāng)其數(shù)量在樣品中達(dá)到可檢測水平后才能夠進(jìn)行微生物分離，并對微生物的形態(tài)特征等進(jìn)行鑒定。該種檢測模式不僅需要人工培養(yǎng)微生物，在培養(yǎng)的過程中還容易出現(xiàn)各種突發(fā)情況，導(dǎo)致所培養(yǎng)的微生物并不能夠用于檢測。但相比之下，PCR檢測方式就有著較大的突破，PCR檢測方式能夠針對細(xì)菌中的編碼rRNA進(jìn)行擴(kuò)增和復(fù)制，通過擴(kuò)增方式得到所需要的DNA片段，并通過片段檢測的方式，能夠高效便捷地獲得致病菌的存在情況[4]。另外，PCR檢測方式還能夠?qū)⑷斯o法培養(yǎng)的或培養(yǎng)效果較差的微生物，采用擴(kuò)增的方式獲取DNA片段，彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測手段中的諸多不足。

3.2 用于生活飲用水中指示細(xì)菌的檢測

水質(zhì)是影響人們健康的又一重要影響因素，除了食物安全以外，水質(zhì)的檢測同樣十分重要。水質(zhì)的檢測是以檢測大腸桿菌和人類糞便中污染的大腸桿菌為檢測指標(biāo)。傳統(tǒng)的檢測方法煩瑣，需花費(fèi)幾天的時間。若根據(jù)大腸桿菌能夠利用β-半乳糖苷酶，采用明確的底物進(jìn)行檢測，則可以更加迅速地檢測到大腸桿菌。然而有一些大腸桿菌品系并不表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶，因此偶爾也會出現(xiàn)檢測失敗[5]。而PCR技術(shù)為檢測β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸苷酶基因提供了一個更加靈敏和特異性更強(qiáng)的方法，并且在檢測的過程中還能夠通過擴(kuò)增的方式對多種大腸桿菌的類型進(jìn)行檢測，可以在更短的時間內(nèi)完成更高質(zhì)量的檢測。

3.3 用于乳酸菌的檢測與鑒定

以雙歧桿菌為例，P.KAUFMANN等人比較了雙歧桿菌現(xiàn)有的32個種及相關(guān)種的16S rRNA基因序列后，發(fā)現(xiàn)在其1 412～1 432位的寡核苷酸堿基序列（21個）在所有的雙歧桿菌中相同，能作為雙歧桿菌屬特異的寡核苷酸片斷，可用其作為PCR的引物來擴(kuò)增雙歧桿菌16S rRNA的基因片斷。而模板DNA通過簡單的SDS裂解菌體細(xì)胞，而后用蛋白酶K去除蛋白即可獲得。在此條件下，所有的雙歧桿菌可由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生典型的1.35 kb的核苷酸片斷，而其他細(xì)菌則不產(chǎn)生此帶，故以此作為檢測基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)對乳酸菌種類及數(shù)量的檢測與鑒定。

4 PCR技術(shù)的發(fā)展方向

PCR技術(shù)在目前主要應(yīng)用于食品中微生物的檢測，在后期的發(fā)展中，PCR技術(shù)主要朝著3個方向發(fā)展，分別是不斷完善與提高DNA的模板純度、解決檢測中假陽性問題和與數(shù)字技術(shù)進(jìn)行緊密結(jié)合。PCR技術(shù)在未來的發(fā)展中，會主要以上述3個發(fā)展方向?yàn)橹?，并且在后期會充分與數(shù)字技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)更高效的食品微生物檢測。

5 結(jié)語

食物微生物檢測直接影響到食品安全，目前使用的PCR檢測技術(shù)，在進(jìn)行實(shí)際檢測中有著一定的優(yōu)勢。在后期的發(fā)展中，該技術(shù)也會在食品微生物檢測中逐漸普及與覆蓋，并且會與數(shù)字技術(shù)進(jìn)行緊密結(jié)合，促進(jìn)食品衛(wèi)生檢測的高質(zhì)量發(fā)展。