趙艷萍，呂國(guó)榮，李麗雅，鄭博林，曾雅婷，張 穎

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，4.放射科，福建 泉州 362000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院，3.母嬰健康服務(wù)應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 泉州 362000)

胎兒腸管強(qiáng)回聲(echogenic bowel, EB)為產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)染色體異常的軟指標(biāo)之一[1]，指胎兒腸管回聲接近或高于周邊骨組織。目前胎兒EB形成機(jī)制尚未明確，可能與宮內(nèi)感染、胎糞淤積等有關(guān)。腸道菌群與許多疾病息息相關(guān)，早期腸道菌群定植尤為重要[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外眾多研究[3-4]表明，腸道菌群定植始于胎兒時(shí)期。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)中孕期EB胎兒與正常胎兒出生后腸道菌群，探討胎兒EB與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2019年2月—6月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受中孕期產(chǎn)前檢查的13胎正常胎兒和7胎EB胎兒。檢查前孕婦或家屬均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：正常組，①單胎、經(jīng)陰道分娩、足月新生兒；②胎兒產(chǎn)前超聲均無(wú)未見(jiàn)EB及其他異常，超聲孕齡與實(shí)際孕齡相符；③孕婦平素月經(jīng)規(guī)律，身體健康，妊娠之前3個(gè)月及孕期未接受抗生素，無(wú)吸煙、嗜酒史，無(wú)糖尿病、心臟病等病史，生化檢查、TORCH篩查等未見(jiàn)異常。EB組，按照文獻(xiàn)[5]超聲分級(jí)方法分級(jí)結(jié)果為EB 2級(jí)及以上，未見(jiàn)其他異常，超聲孕齡與實(shí)際孕齡相符；余與正常組納入標(biāo)準(zhǔn)①③同。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦于分娩前1個(gè)月內(nèi)服用益生菌制劑；②采集糞便前已開(kāi)奶；③已參加其他臨床試驗(yàn)。

1.2 儀器及方法 采用GE Voluson E8、GE Voluson E10多普勒診斷儀，C5-1腹部探頭，頻率2.3～5.0 MHz，產(chǎn)科OB檢查模式，對(duì)胎兒行常規(guī)產(chǎn)前超聲檢查，評(píng)估胎兒整體情況。使胎兒腸管與髂嵴置于同一深度水平，焦點(diǎn)置于胎兒腹部深方，增益70%～90%，將腸管回聲等于或強(qiáng)于同幅聲像圖中髂骨回聲診斷為EB(圖1)。由2名均具有3年以上產(chǎn)科超聲經(jīng)驗(yàn)的超聲科醫(yī)師已雙盲法完成檢查并進(jìn)行診斷，意見(jiàn)不一時(shí)提請(qǐng)1名產(chǎn)前超聲專業(yè)主任醫(yī)師會(huì)診，得出最終診斷結(jié)果。

圖1 孕婦28歲，孕23周，胎兒EB 超聲聲像圖示胎兒局部腸管回聲增強(qiáng)，回聲強(qiáng)度與髂嵴相似

1.3 糞便采集及檢測(cè) 用無(wú)菌棉簽采集新生兒出生后2 h內(nèi)自然排出的胎糞約黃豆大小(3～5 g)，裝入2 ml無(wú)菌凍存管，放入-80℃冰箱保存。提取所有樣本細(xì)菌DNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，對(duì)樣本16S V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，添加標(biāo)簽序列，定量混合樣本文庫(kù)并控制文庫(kù)質(zhì)量，采用Miseq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Fisher精確概率法比較組間差異。采用R3.4.3軟件繪制稀釋曲線，以Bray-Curtis距離法計(jì)算2組微生物群落組成差異，以PCoA主坐標(biāo)分析加以說(shuō)明。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母體及新生兒基本信息 2組母體及新生兒一般資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 聚類及物種注釋 經(jīng)測(cè)序所有樣本共產(chǎn)生720 293條優(yōu)質(zhì)序列，以相似度0.97進(jìn)行聚類，共獲得539 988個(gè)運(yùn)算分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。繪制稀釋曲線(圖2)，顯示每個(gè)樣本均已進(jìn)入平臺(tái)期,表明測(cè)序已基本覆蓋所有物種。

2.3 2組新生兒腸道細(xì)菌多樣性比較 2組腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、觀察物種數(shù)目指數(shù)(observed species)、辛普森指數(shù)(Simpson)及Chao 1指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖2～5。

表1 母體及新生兒基本資料比較

圖2 香農(nóng)指數(shù)圖 圖3 觀察物種數(shù)目指數(shù)圖 圖4 辛普森指數(shù)示意圖 圖5 Chao 1指數(shù)示意圖

2.4 2組腸道細(xì)菌分布相似度與差異度比較 2組新生兒腸道細(xì)菌整體分布具有相似性(圖6)。

2.5 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)比較 門(mén)水平上，EB組厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和克雷伯菌門(mén)(Klebsiella)豐度均顯著高于正常組(P均<0.05)，梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)豐度顯著低于正常組(P<0.05)。屬水平上，EB組位于前三位的菌種為鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)及鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas),正常組分別為埃希菌/志賀菌屬(Escherichia/Shigella)、擬桿菌屬(Bacterium)及梭菌屬(Clostridium)。EB組葡萄球菌屬及彎曲桿菌屬(Campylobacter)豐度均顯著高于正常組(P均<0.05)，其埃希菌/志賀菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬及腸桿菌屬(Enterobacter)豐度均顯著低于正常組(P均<0.05)。見(jiàn)圖7、8。

圖6 2組糞便菌群PCoA主成分分析

3 討論

EB是胎兒染色體異常的軟指標(biāo)之一[6]，其形成可能與胎糞淤積、宮內(nèi)感染、腹腔積液、囊性纖維化及宮內(nèi)出血等相關(guān)[7]。1996年SLOTNICK等[5]對(duì)腸管回聲增強(qiáng)進(jìn)行分級(jí)：正常為0級(jí)，回聲增強(qiáng)但低于周圍骨質(zhì)回聲為1級(jí)，與周圍骨質(zhì)回聲相同為2級(jí)，高于周圍骨質(zhì)回聲為3級(jí)。本研究中EB組胎兒腸管回聲均為 2級(jí)及以上。

近年研究[8]表明，腸道菌群與多種疾病的發(fā)生息息相關(guān)，包括自身免疫性疾病、糖尿病及肥胖等。ZHANG等[9]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的新生仔豬腸道微生物群多樣性較低，其菌群豐度與正常仔豬存在較大差異，使其體質(zhì)量與正常仔豬的差距日趨增大。GUZZARDI等[10]發(fā)現(xiàn)胎兒心臟生長(zhǎng)發(fā)育與其宮內(nèi)腸道菌群定植密切相關(guān)。

腸道菌群多樣性降低被認(rèn)為是腸道發(fā)育不良表現(xiàn)之一，可引發(fā)更多疾病，包括自身免疫性疾病和肥胖等[11]。本研究2組腸道菌群多樣性無(wú)差異，菌群組成群落結(jié)構(gòu)相似，表明EB胎兒腸道功能發(fā)育與正常胎兒無(wú)明顯差異。

本研究2組豐度居于前三的菌門(mén)分別是變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)及放線菌門(mén)，均為構(gòu)成新生兒腸道細(xì)菌的主要菌門(mén)；EB組厚壁菌門(mén)豐度高于正常組，變形菌門(mén)豐度則明顯低于正常組。既往研究[12]表明，厚壁菌門(mén)含量與兒童體質(zhì)量增長(zhǎng)呈正相關(guān)，肥胖兒童厚壁菌門(mén)豐度高于正常兒童，提示厚壁菌門(mén)含量可能是導(dǎo)致兒童肥胖的重要因素，而這也意味著EB胎兒兒童時(shí)期發(fā)生肥胖的風(fēng)險(xiǎn)可能較高。也有研究[13]認(rèn)為變形菌門(mén)低豐度與哮喘、支氣管擴(kuò)張癥及慢性阻塞性肺部疾病等呼吸系統(tǒng)疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，EB胎兒未來(lái)罹患上述疾病的可能性更大，但仍需后續(xù)繼續(xù)隨訪菌群變化進(jìn)一步觀察。

本研究EB組梭桿菌屬及擬桿菌屬的豐度均顯著低于正常組。梭桿菌屬是丁酸梭菌的類群之一，屬于梭菌科的一類梭菌群，通常認(rèn)為其內(nèi)所含為致病性菌屬[14]。梭桿菌屬(主要梭桿菌屬1型)可通過(guò)改變緊密連接和黏液成分而損害腸道屏障功能[15]。有核梭桿菌為新近發(fā)現(xiàn)的病原體，越來(lái)越多的研究[16-17]將其與羊膜內(nèi)感染、結(jié)直腸癌、早產(chǎn)、牙周病等聯(lián)系起來(lái), 認(rèn)為其與廣泛的不良妊娠結(jié)局有關(guān)。另一方面， GORREJA等[18]發(fā)現(xiàn)嬰兒早期腸道中存在一種“先鋒”細(xì)菌，即脆弱擬桿菌，其表面成分多糖A可抑制人原代胎兒小腸細(xì)胞IL-1β誘導(dǎo)的炎癥，減少腸道炎癥。研究[5]表明，腸道回聲增強(qiáng)與部分宮內(nèi)感染密切相關(guān)，如巨細(xì)胞病毒感染等，這意味著正常胎兒與EB胎兒腸道中均存在以上兩種菌群，而正常組中擬桿菌屬的“保護(hù)”作用勝于梭桿菌屬的“破壞”作用，故正常組胎兒腸道并未出現(xiàn)強(qiáng)回聲；EB組胎兒上述兩種菌屬豐度均低于正常組，可能是腸道菌群作用于腸管回聲增強(qiáng)的機(jī)制之一。

本研究的局限性；樣本量較少，未來(lái)需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步觀察。

圖7 2組門(mén)水平菌群分布 圖8 2組屬水平菌群分布

單純性EB胎兒出生后與正常新生兒腸道菌群多樣性及菌群組成群落結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯差異，但腸道微生物數(shù)量、相對(duì)豐度及代謝路徑豐度存在差異，后者可能是導(dǎo)致胎兒期腸管回聲增強(qiáng)的部分原因。