李進(jìn)丹，王 瑞，楊 軍，羅玥媛，郭效賓，廖承德

(云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院放射科，云南 昆明 650118)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)最常見(jiàn)惡性腫瘤，惡性程度及致死率均高。大腦血腦屏障(blood brain barrier, BBB)是臨床治療膠質(zhì)瘤困難的主要原因。聚焦超聲(focused ultrasound, FUS)與超聲造影劑微泡(microbubbles, MB)相結(jié)合，可局部、無(wú)創(chuàng)地暫時(shí)開(kāi)放BBB。近年來(lái)，以程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)為代表的免疫治療用于多種腫瘤展現(xiàn)出極大潛能。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察FUS與PD-1單抗協(xié)同治療膠質(zhì)瘤的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 50只6～8周齡雄性SD大鼠購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(滇)K2015-0002]，體質(zhì)量80～100 g。C6細(xì)胞株購(gòu)自昆明動(dòng)物所，培養(yǎng)后經(jīng)胰酶消化制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度約2～5×105個(gè)/ml)。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào)：kmmu2021006)。

1.2 測(cè)試FUS安全性及BBB開(kāi)放 隨機(jī)選取10只大鼠測(cè)試FUS安全性及BBB開(kāi)放情況，見(jiàn)圖1A。經(jīng)尾靜脈注射MB(六氟化硫微泡，聲諾維?，上海博萊科信誼藥業(yè))0.2 ml/100 g體質(zhì)量，以低功率聚焦超聲實(shí)驗(yàn)裝置(重慶融海超聲醫(yī)學(xué)工程研究中心有限公司，重慶)行FUS輻照，條件分別為4 W/200 s、4 W/150 s、4 W/250 s；之后經(jīng)尾靜脈注射伊文藍(lán)(Evan blue, EB)0.2 ml/100 g體質(zhì)量。

1.3 制作膠質(zhì)瘤模型 將其余40只大鼠麻醉后俯臥保定于顱腦定位儀，暴露術(shù)區(qū)顱骨,于冠狀縫前1 mm、矢狀縫右3 mm，沿顱骨鉆孔注射5 μl C6細(xì)胞懸液制成膠質(zhì)瘤模型。

1.4 MR檢查 采用Philips Ingenia 3.0T MR掃描儀，專用動(dòng)物線圈(GC-MUC44-H300-AP，辰光醫(yī)療，上海)，于造模后第9天及第17天行頭部掃描，采集T2WI、對(duì)比動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI(dynamic contrast enhanced MRI, DCE-MRI)及增強(qiáng)T1WI。由2名具有5年頭部影像學(xué)診斷經(jīng)驗(yàn)的主治醫(yī)師觀察病灶MRI表現(xiàn)，測(cè)量病灶體積，意見(jiàn)不一致時(shí)經(jīng)討論決定。采用數(shù)據(jù)處理軟件(Omni-Kinetics Version, V2.0.10，上海通用藥業(yè)公司)分析造模后第17天MRI，于增強(qiáng)T1WI腫瘤最大層面及對(duì)側(cè)放置3對(duì)約0.3 cm2ROI，測(cè)量其血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括容積轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(Ktrans)、速率常數(shù)(Kep)、血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)(Ve)及血漿內(nèi)容積分?jǐn)?shù)(Vp)，取結(jié)果的平均值進(jìn)行分析，計(jì)算相對(duì)Ktrans(rKtrans)、相對(duì)Kep(rKep)、相對(duì)Ve(rVe)及相對(duì)Vp(rVp)，相對(duì)參數(shù)值=損傷側(cè)參數(shù)值/對(duì)側(cè)參數(shù)值。

1.5 分組及干預(yù) 造模第9天MR檢查結(jié)束后隨機(jī)取8只模型鼠行病理檢查，以隨機(jī)數(shù)字法將其余32只大鼠均分為FUS組、PD-1單抗組、FUS+PD-1單抗聯(lián)合治療組(簡(jiǎn)稱“聯(lián)合治療組”)及對(duì)照組，每組8只；于造模后第9天MR檢查后對(duì)前3組施加干預(yù)，隔天1次，共4次，對(duì)照組不予干預(yù)。FUS組：經(jīng)尾靜脈注入MB 0.2 ml/100 g體質(zhì)量后行FUS輻照，輸出頻率650 kHz±10%，輸出功率4 W，持續(xù)時(shí)間200 s。PD-1單抗組：將PD-1單抗(PD-1-IN-1, MedChemExpress公司)與生理鹽水混合稀釋成濃度1 mg/ml的PD-1溶液，緩慢注入腹腔1 mg/100 g體質(zhì)量。聯(lián)合治療組：超聲輻照條件同前，輻照結(jié)束后經(jīng)腹腔緩慢注入PD-1單抗溶液1 mg/100 g體質(zhì)量。

1.6 病理檢查 注射EB后3～4 h予過(guò)量麻醉，以心臟灌注處死動(dòng)物，取腦組織標(biāo)本。對(duì)造模第9天MR檢查結(jié)束后隨機(jī)選取的8只動(dòng)物腦組織標(biāo)本行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色；對(duì)造模第17天4組大鼠腦組織行半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)及CD4、CD8免疫組織化學(xué)染色。由1名具有5年以上病理診斷經(jīng)驗(yàn)的主治醫(yī)師以盲法觀察切片，隨機(jī)選取8個(gè)不重疊高倍視野進(jìn)行分析，以Image Pro軟件計(jì)算Caspase-3活化細(xì)胞百分比、CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0及Graphpad prim 8統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FUS安全性及BBB開(kāi)放情況 僅FUS輻照后腦組織見(jiàn)少量出血；功率4 W,輻照時(shí)間分別為150、200、250 s條件下，腦組織可見(jiàn)EB藍(lán)染而未見(jiàn)出血，見(jiàn)圖1。

圖1 測(cè)試FUS安全性及BBB開(kāi)放情況 A.經(jīng)尾靜脈注射MB后行FUS輻照； B.EB藍(lán)染結(jié)果(黑色虛線為切片位置，下排為上排切面圖)：僅以4 W/200 s條件對(duì)左側(cè)大腦半球行FUS輻照后可見(jiàn)腦組織少量出血(白箭)，4 W/200 s FUS輻照和MB條件下右側(cè)大腦半球BBB開(kāi)放，腦組織見(jiàn)EB藍(lán)染(黑箭)； 4 W/150 s(左側(cè)大腦半球)和4 W/250 s(右側(cè)大腦半球)FUS輻照和MB條件下BBB開(kāi)放，腦組織見(jiàn)EB藍(lán)染(黑箭)

圖2 造模第9天大鼠膠質(zhì)瘤模型HE染色病理圖(右下圖示病理取材部位) A.正常腦組織(右上粉色區(qū)域)與腫瘤組織(左下藍(lán)色深染區(qū)域)交界處； B.腫瘤組織

表1 造模后第17天組間MRI血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(±s)

表1 造模后第17天組間MRI血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(±s)

組別rKtransrKeprVerVpFUS組105.32±20.18169.02±38.23600.16±69.1212.32±2.23PD-1單抗組54.31±6.03107.34±55.04539.33±59.8411.60±3.31聯(lián)合治療組102.61±15.03138.33±41.43521.12±53.306.53±2.15對(duì)照組34.70±9.95127.85±36.85519.48±50.869.23±4.58F值7.160.240.030.45P值0.010.770.210.53

2.2 各組膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)情況 造模第9天腫瘤呈T1WI低信號(hào)、T2WI稍高信號(hào)，增強(qiáng)后明顯強(qiáng)化。HE染色片示大鼠腫瘤細(xì)胞分布密集，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)較多異形細(xì)胞(圖2)。造模第17天，4組腫瘤體積較第9天不同程度增大,呈T1WI低信號(hào)、T2WI混雜信號(hào)，其內(nèi)可見(jiàn)壞死區(qū)域，瘤周見(jiàn)片狀水腫信號(hào)，增強(qiáng)后病灶明顯強(qiáng)化(圖3)；腫瘤體積：對(duì)照組(62.12±3.32) mm2，PD-1單抗組(54.66±3.97) mm2，F(xiàn)US組(46.27±7.95) mm2，聯(lián)合治療組(20.28±3.92) mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.27，P<0.01)；兩兩比較，聯(lián)合治療組腫瘤體積小于其余各組(P均<0.01)，對(duì)照組與PD-1單抗組(P=0.01)及對(duì)照組與FUS組(P<0.01)間腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而FUS組與PD-1單抗組腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.50)。

2.3 組間MRI血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 造模后第17天，4組間rKtrans值總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.16，P=0.01)，rVe、rKep、rVp差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表1。兩兩比較，F(xiàn)US組與聯(lián)合治療組間rKtrans值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.79)，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4 病理 造模第17天4組間CD8+T細(xì)胞總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=389.90，P<0.01)；兩兩比較，聯(lián)合治療組CD8+T細(xì)胞較其余各組均增加(P均<0.05)，余各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。4組間CD4+T細(xì)胞總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=254.10，P<0.01)；兩兩比較，聯(lián)合治療組CD4+T細(xì)胞較其余各組減少(P均<0.05)，余各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。4組間Caspase-3活化細(xì)胞百分比總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.73，P均<0.01)，兩兩比較，聯(lián)合治療組Caspase-3活化細(xì)胞百分比高于其余3組(P均<0.05),其余各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)圖4、5。

圖3 造模第17天各組MRI顯示大鼠膠質(zhì)瘤 A.對(duì)照組T2WI； B.FUS組增強(qiáng)T1WI； C.PD-1單抗組增強(qiáng)T1WI； D.聯(lián)合治療組增強(qiáng)T1WI

圖4 造模后第17天大鼠腦組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果柱狀圖 A.CD8+ T細(xì)胞數(shù)量； B.CD4+ T細(xì)胞數(shù)量； C.Caspase-3活化細(xì)胞百分比 *為組間比較P<0.05

圖5 造模后第17天大鼠腦膠質(zhì)瘤病理圖(Caspase-3染色，×40) A.對(duì)照組； B.FUS組； C.PD-1單抗組； D.聯(lián)合治療組

3 討論

FUS開(kāi)放BBB后，可將大分子藥物如抗體、納米顆粒和阿霉素脂質(zhì)體甚至細(xì)胞因子和靶向免疫細(xì)胞制劑等向腦內(nèi)遞送[1-3]。FUS聯(lián)合MB開(kāi)放BBB可促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)劑向腦內(nèi)輸送，改善腦腫瘤治療中的抗癌免疫反應(yīng)[4-5]。分析其可能機(jī)制，首先，F(xiàn)US產(chǎn)生的脈沖波與靜脈注射的MB發(fā)生穩(wěn)定空化作用，使大腦血管內(nèi)皮機(jī)械壓力增大，導(dǎo)致內(nèi)皮間緊密連接打開(kāi)，BBB開(kāi)放，血管通透性增加，相對(duì)分子質(zhì)量較大物質(zhì)可進(jìn)入大腦微環(huán)境[6]。DCE-MRI能監(jiān)測(cè)BBB破壞后動(dòng)力學(xué)改變[7-8]，Ktrans與BBB通透性高度相關(guān)，本研究中BBB開(kāi)放后腦組織EB藍(lán)染，F(xiàn)US輻照后腦腫瘤rKtrans明顯增高，與既往研究[9-10]結(jié)果相符。其次，腫瘤微環(huán)境中存在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、白細(xì)胞介素13、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等免疫抑制細(xì)胞因子，F(xiàn)US誘導(dǎo)BBB開(kāi)放可增強(qiáng)上述細(xì)胞因子的作用，通過(guò)非特異性免疫增強(qiáng)作用而減少特異性封閉分子/抗體向全身遞送，從而克服由腫瘤引起的免疫抑制作用[11]。CHEN等[11]以C6膠質(zhì)瘤大鼠模型評(píng)估FUS誘導(dǎo)BBB開(kāi)放的效能，發(fā)現(xiàn)FUS-BBB開(kāi)放致白細(xì)胞介素12顯著增加，T細(xì)胞增殖活躍，促進(jìn)干擾素γ產(chǎn)生，增強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞毒性免疫作用及相關(guān)抗癌免疫反應(yīng)[12]。另外，人類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)在腫瘤細(xì)胞往往表達(dá)較弱，呈遞抗原效率較差，免疫過(guò)程中不易監(jiān)視和調(diào)控。FUS誘導(dǎo)BBB開(kāi)放可增強(qiáng)腫瘤組織MHC表達(dá)，提高樹(shù)突狀細(xì)胞抗原呈遞效率。最后，PD-1為免疫抑制性受體，在活化T細(xì)胞、B細(xì)胞中廣泛表達(dá)，F(xiàn)US可激活配體抗原呈遞細(xì)胞的滲透能力，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。FUS有助于改變腫瘤原有微環(huán)境，引發(fā)腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡；而B(niǎo)BB開(kāi)放有利于向大腦輸送免疫調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)抗癌免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，相比FUS組或PD-1單抗組，聯(lián)合治療組腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，體積縮小，提示應(yīng)用FUS和MB開(kāi)放BBB后以PD-1藥物治療膠質(zhì)瘤效果更佳。

SATO等[13]發(fā)現(xiàn)上皮內(nèi)CD8+T細(xì)胞高及CD8+/CD4+比值較高的上皮性卵巢癌患者預(yù)后較好，生存率較高，提示上皮內(nèi)CD8+T細(xì)胞與上皮性卵巢癌預(yù)后相關(guān)，CD4+T細(xì)胞會(huì)影響CD8+T細(xì)胞的有益作用。張勇等[14]報(bào)道，CD4+/CD8+比值異常的鼻咽癌患者5年總生存率(67.95%)顯著低于CD4+/CD8+比值正常者(89.80%)，提示CD4+/CD8+比值低者預(yù)后較差。本研究以Caspase-3活化程度反映細(xì)胞凋亡程度，以CD4、CD8陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量反映腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)浸潤(rùn)程度，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組CD8+T細(xì)胞數(shù)量及Caspase-3活化細(xì)胞百分比均高于其余3組、CD4+T細(xì)胞數(shù)量低于其余3組，提示其抑制腫瘤生長(zhǎng)效果較佳。FUS誘導(dǎo)BBB開(kāi)放對(duì)機(jī)體全身T淋巴細(xì)胞種群無(wú)明顯影響，但觸發(fā)了TIL群體變化[11]。在微環(huán)境中，CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是膠質(zhì)瘤TIL的重要組成部分。CD4+和CD8+T細(xì)胞均需激活才能破壞腫瘤細(xì)胞的有效免疫反應(yīng)，CD4+T細(xì)胞參與調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)過(guò)程，且可能受免疫原性質(zhì)、抗原提呈細(xì)胞激活狀態(tài)及效應(yīng)和記憶CD8+T細(xì)胞所處微環(huán)境等影響[15]。CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)有益于預(yù)后，CD4+T細(xì)胞有助于維持CD8+T細(xì)胞功能，但影響CD8+T細(xì)胞的有益作用，從而影響預(yù)后。腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，CD4+和CD8+T細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)展及預(yù)后存在一定影響，深入了解微環(huán)境免疫細(xì)胞作用機(jī)制對(duì)評(píng)價(jià)疾病預(yù)后極其重要。

綜上，F(xiàn)US與抗PD-1單抗協(xié)同治療有利于延緩大鼠腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展。