刁艷君，楊 柳，蘇明權，郝曉柯，劉家云

（空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710032）

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）可引起新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），目前已在全球范圍內廣泛流行。疫情暴發(fā)初期，因發(fā)展迅速，對疑似患者進行快速確診是防治COVID-19的關鍵，部分獲批的核酸檢測試劑研發(fā)時間短，存在性能確認倉促、試劑優(yōu)化不充分以及批間差異大等問題；各臨床實驗室在開展核酸檢測過程的各個環(huán)節(jié)中存在的問題也可能影響核酸檢測結果的準確性。本文將圍繞目前SARS-CoV-2核酸檢測中的關鍵環(huán)節(jié)及要點進行評述，并對實驗室核酸檢測與臨床不符假陰性和復檢陽性的問題進行分析。

1 SARS-CoV-2核酸檢測的原理

SARS-CoV-2是一種RNA病毒，基因組序列約29 kb，擁有10個基因，可有效編碼10個蛋白。病毒由RNA和蛋白構成，最外層是由脂質和糖蛋白組成的包膜外衣，里面蛋白衣殼將RNA包裹在其中，從而使容易降解的RNA得到保護（圖1）。病毒通過特定細胞表面受體入侵細胞造成感染，并利用宿主細胞進行復制。病毒核酸檢測的原理就是通過細胞裂解液，讓病毒的RNA裸露出來，然后用實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）進行檢測。檢測原理最關鍵的是利用引物和探針來實現(xiàn)核酸序列的“靶向匹配”，即尋找SARS-CoV-2約3萬個堿基中區(qū)別于其他病毒的核酸序列（與其他病毒核酸相似度“低”的區(qū)域），設計引物和探針。引物和探針與SARSCoV-2核酸特定區(qū)域高度匹配，即特異性很強，一但待檢樣本實時熒光RT-PCR擴增結果為陽性，則證明該樣本中存在SARS-CoV-2。見圖2。

圖1 SARS-CoV-2病毒結構示意

圖2 SARS-CoV-2核酸測定（實時熒光RT-PCR）的步驟

2 核酸檢測對于SARS-CoV-2檢測的意義

依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]要求，臨床疑似病例應具備以下病原學或血清學證據(jù)之一：實時熒光RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性；病毒基因測序與已知的SARS-CoV-2高度同源；血清SARS-CoV-2特異性IgM抗體和IgG抗體陽性；血清SARSCoV-2特異性IgG抗體由陰性轉為陽性，或恢復期較急性期升高4倍及以上。因此，SARSCoV-2核酸檢測（實時熒光RT-PCR）結果陽性是確診感染的重要證據(jù)之一；但如果檢測結果為“陰性”，不能作為判斷患者未被感染的標準。有研究結果顯示，1 100例COVID-19患者在入院時接受電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）檢查時，有76.4%的患者呈現(xiàn)出肺炎表現(xiàn)，主要為毛玻璃樣陰影（50.0%）和雙肺斑片狀陰影（46.4%），絕大多數(shù)重癥患者都能以此確診[2]。而根據(jù)此前專家表述的“確診患者中，核酸檢測的陽性率僅為30%～50%”來看[3]，COVID-19患者核酸檢測假陰性的比例并不低。因此核酸檢測不能作為確診感染的唯一方法。

3 實驗室進行SARS-CoV-2核酸檢測的條件和要求

臨床實驗室需要符合國家衛(wèi)生健康委辦公廳頒布的《關于醫(yī)療機構開展新型冠狀病毒核酸檢測有關要求的通知》[4]的要求，達到二級以上實驗室生物安全防護及三級個人生物安全防護規(guī)范并經(jīng)衛(wèi)生行政相關部門批準，方可開展SARS-CoV-2核酸檢測。核酸檢測實驗室為負壓環(huán)境最為理想，應注意壓力監(jiān)測，保持空氣流動，排除氣溶膠。核酸檢測人員必須具備相應資質，接受聚合酶鏈反應相關培訓并考核合格。實驗室應嚴格管理，分區(qū)到位，嚴格禁止無關人員進入。清潔區(qū)應保持通風，消毒到位。相關物品分區(qū)放置，潔污分離，按時更換，洗消到位。常規(guī)消毒：較大面積以含氯消毒液為主，小面積可以用75%酒精。處理氣溶膠的良好方式是開窗通風，也可通過紫外線、過濾、空氣消毒機等方式進行空氣消毒。

4 SARS-CoV-2核酸測定（實時熒光RT-PCR）的關鍵環(huán)節(jié)和參數(shù)

盡管實驗室一般會很關注核酸“檢測”環(huán)節(jié)，但實際上核酸“提取”也是檢測成功的關鍵環(huán)節(jié)之一，其與病毒樣本的采集和保存密切相關。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》[5]中，所提到的樣本類型包含呼吸道樣本、血液樣本、糞便樣本等。對于高風險的樣本，在核酸提取和擴增前需要對樣本先行病毒滅活，包括（60～65）℃孵育（20～30）min，或者用試劑盒自帶的采樣液滅活和保存病毒。目前應用最廣泛的呼吸道樣本，如鼻咽拭子等均采用第2種方式，即以核酸提取裂解液為基礎配制的滅活（保存）液。這種病毒保存液一方面可讓病毒的蛋白變性，失去活性，不再有傳染性，提高運輸和檢測階段的安全性；另一方面又可直接裂解病毒釋放核酸，消除核酸分解酶，防止病毒的RNA降解。以核酸提取裂解液為基礎配制的病毒采樣液，主要成分為平衡鹽類、乙二胺四乙酸螯合劑、胍鹽（異硫氰酸胍、鹽酸胍等）、陰離子表面活性劑（十二烷基硫酸鈉）、陽離子表面活性劑（十四烷基三甲基草酸銨）、苯酚、8-羥基喹啉、二硫蘇糖醇、蛋白酶K等幾種或多種組分。目前，核酸提取的試劑盒種類繁多，采用的核酸提取純化試劑各不相同，即使是采用相同的核酸提取純化試劑，各試劑盒的提取程序也有所不同。

截至2020年3月6日，我國國家藥品監(jiān)督管理局共應急批準SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒11個，其中實時熒光RT-PCR方法10個[6]。目前批準的產(chǎn)品均基于SARS-CoV-2基因組中ORF1ab、E和N基因進行選擇。不同產(chǎn)品的檢測原理基本一致，但是其引物、探針設計不同，有單靶區(qū)段（ORF1ab）、雙靶區(qū)段（ORF1ab、N或E）、三靶區(qū)段（ORF1ab、N和E）的檢測和判讀差別，核酸提取和實時熒光RT-PCR反應體系應參考相關試劑盒說明書，并建議使用者嚴格按照試劑盒說明書規(guī)定的判讀方式進行判讀。實時熒光RT-PCR擴增的常見區(qū)域及引物和探針序列如圖3所示。

圖3 SARS-CoV-2擴增子靶標在基因組上的定位及引物和探針序列

5 SARS-CoV-2核酸測定（實時熒光RT-PCR）結果判讀

《新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案（第二版）》[7]首次明確了單個基因擴增結果的判斷標準：無Ct或Ct≥40為陰性；Ct＜37為陽性；Ct值37～40為灰度區(qū)，建議重復實驗，若重做結果Ct＜40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。之后的第三版指南[8]、第四版指南[9]延續(xù)了上述標準，但是由于商品化試劑盒選用的靶標有所不同，上述3版指南并未給出靶標的組合判斷標準，強調以廠家提供的說明書為準。從第五版指南[10]開始，明確了2個靶標，尤其是比較難判斷的單靶標陽性的判斷標準，即實驗室要確認某個病例為SARSCoV-2核酸檢測陽性，需滿足以下2個條件中的1個：（1）同一份樣本中SARS-CoV-2 2個靶標（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性，如果出現(xiàn)單個靶標陽性的檢測結果則需要重新采樣并重新檢測，如果檢測結果仍然為單靶標陽性，則判定為陽性；（2）2種樣本實時熒光RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標陽性或同種類型樣本2次采樣檢測均出現(xiàn)單個靶標陽性的檢測結果，可判定為陽性。但是，指南同時強調核酸檢測的陰性結果不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括樣本質量差（口咽等部位的呼吸道樣本）、樣本收集過早或過晚、沒有正確保存、運輸和處理樣本、技術本身存在問題（病毒變異、PCR抑制）等。

6 SARS-CoV-2檢測出現(xiàn)假陰性的原因

目前被關注的核酸檢測“假陰性”概念，往往是指核酸檢測結果與臨床表現(xiàn)不符的“假陰性”，即臨床癥狀及影像學結果高度疑似COVID-19，但核酸檢測多次始終為“陰性”。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心對SARS-CoV-2檢測“假陰性”進行了解釋[11]。（1）被感染者的細胞中有一定量的病毒?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示機體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進而到達肺泡，感染者會經(jīng)歷潛伏期、輕度癥狀、再到嚴重癥狀的過程，不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同。從細胞種類的病毒載量看，肺泡上皮細胞（下呼吸道）＞氣道上皮細胞（上呼吸道）＞成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞等；從樣本類型來看，肺泡灌洗液（最優(yōu)）＞深咳痰＞鼻咽拭子＞口咽拭子＞血液。此外，糞便中也能檢出病毒。但是考慮操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床常用的樣本順序是口咽部拭子＞鼻咽部拭子＞支氣管灌洗液（操作復雜）和深痰（常為干咳，難得到）。因此某些患者口咽部或鼻咽部細胞中病毒量較少或極低，如果只取口咽部或鼻咽部樣本檢測，病毒核酸就檢測不到。（2）樣本采集時未采集到含有病毒的細胞，或未有效保存病毒核酸。①采集部位不當，如采集口咽拭子時，采集深度不夠，采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，可能采集到的細胞絕大部分都是不含病毒的細胞；②采樣拭子使用錯誤，如拭子頭的材料推薦使用PE纖維、聚酯纖維、聚丙烯纖維等合成纖維，實際操作中使用了棉花等天然纖維（對蛋白質的吸附較強，不易洗脫）和尼龍類的纖維（吸水性不佳，導致采樣量不足）；③病毒保存管使用錯誤，如誤用了易吸附核酸（DNA/RNA）的聚丙烯或聚乙烯塑料保存管，導致保存液中核酸濃度下降。實際操作中推薦使用聚乙烯-丙烯聚合物塑膠與某些特殊處理的聚丙烯塑膠容器儲存病毒核酸。（3）體外診斷試劑性能不佳。部分品牌的試劑由于研發(fā)時間短，也沒有使用已知臨床樣本進行必要的性能確認，可能存在對試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題。此外，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2020年3月16—24日開展的SARS-CoV-2核酸檢測室間質量評價[12]發(fā)現(xiàn)，各“檢測”試劑均存在與多個核酸“提取”試劑搭配使用的情況，這也是導致假陰性結果的主要原因。即使采用同一核酸檢測試劑，由于核酸提取試劑的不同，分析敏感性也必然會存在差異。（4）臨床實驗室操作不規(guī)范。樣本運輸保存條件、臨床實驗室的規(guī)范操作、結果判讀和質量控制等是保證檢測結果準確、可靠的關鍵因素。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2020年3月16—24日開展的室間質量評價結果顯示，收到有效結果的844家實驗室中，701家（83.1%）合格，143家（16.9%）不合格，實驗室總體檢測情況良好[13]，但不同實驗室在人員操作能力、單靶標陽性樣本解讀能力以及質量控制方面仍存在差異。

7 如何降低SARS-CoV-2核酸檢測假陰性

降低核酸檢測假陰性應相對應地從產(chǎn)生假陰性的4個方面進行優(yōu)化。（1）被感染者的細胞中有一定量的病毒。疑似感染者不同時期，在身體不同部位，病毒濃度會有差異，如咽部沒有，可能支氣管灌洗液或糞便中有，若能同時或在疾病進展的不同階段采集多種類型樣本進行檢測，會有助于避免假陰性的出現(xiàn)。（2）樣本采集時要采集到含有病毒的細胞。通過加強對樣本采集人員的培訓，可以在很大程度上解決該問題。（3）可靠的體外診斷試劑。通過從國家層面開展試劑的檢測性能評價研究，探討存在的問題，可以進一步改進試劑檢測效能，提高分析敏感性。（4）臨床實驗室規(guī)范操作。通過加強對實驗室人員的培訓，不斷完善實驗室質量管理體系、保證合理的分區(qū)、提高人員檢測的能力，可以減少因實驗室操作不當出現(xiàn)的假陰性。

8 康復出院患者SARS-CoV-2核酸檢測復檢陽性的原因

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]中明確規(guī)定，COVID-19患者治愈出院的標準之一就是連續(xù)2次痰、鼻咽拭子等呼吸道標本核酸檢測陰性（采樣時間至少間隔24 h），但有極少數(shù)出院患者再次出現(xiàn)SARSCoV-2核酸檢測陽性，其原因是多樣的。（1）SARS-CoV-2是一個新病毒，對其致病機制、引發(fā)的疾病全貌和病程特點還需要進一步了解，所以一方面要加強對出院患者的管理，進行14 d的醫(yī)學觀察，并進行跟蹤隨訪、健康監(jiān)測和健康指導，以對疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸的全過程加深認識。（2）患者有再次感染病毒的可能。鐘南山院士說：由于治愈的患者體內有抗體，因此SARS-CoV-2再次入侵時可被抗體消滅，再次感染的幾率不大，但“不大”并不代表“不會感染”，再次感染有多方面的原因，可能是康復患者自身的原因，也可能與病毒的變異有關，甚至可能是實驗室檢測的原因。如果是病毒自身的原因，SARS-CoV-2變異可能導致康復患者自身產(chǎn)生的抗體對變異病毒無效，若患者再次感染變異病毒，則核酸檢測可能再次陽性。（3）就實驗室檢測方法而言，每種檢測方法都有其局限性。SARSCoV-2核酸檢測因基因序列的選擇、試劑的組成、方法的敏感程度等原因，導致現(xiàn)有的試劑盒均有各自的檢測下限。當患者經(jīng)過治療后，體內病毒減少，待檢樣本中病毒載量低于檢測下限時即會出現(xiàn)“陰性”結果，但此結果并不意味著體內病毒完全消失，病毒有可能在停止治療后“死灰復燃”，繼續(xù)復制。因此，建議出院2～4周內，每周復查1次。（4）核酸為病毒的遺傳物質，患者經(jīng)過抗病毒治療后病毒被殺滅，但殘留的病毒RNA片段仍然在人體內存留，并沒有完全從體內排出，有時在特定的環(huán)境下，可以存留較長的時間，而在這時進行核酸檢測，會出現(xiàn)“一過性”陽性。隨著患者恢復時間的延長，在體內殘留的RNA片段逐漸排盡后，核酸檢測結果可轉為陰性。（5）SARSCoV-2的核酸檢測結果只是證明病毒RNA的存在與否，不能證明病毒活性以及病毒是否具有傳播性。要證明核酸檢測再次陽性的患者是否會再次成為傳染源，要對其臨床樣本進行病毒培養(yǎng)，培養(yǎng)出“活的”病毒才能證明其具有傳染性。

9 總結

綜上所述，SARS-CoV-2核酸檢測假陰性、復檢陽性等與臨床表現(xiàn)不符的情況無法完全避免，在實際篩查和檢測中，建議聯(lián)合臨床癥狀、影像學檢查（CT）及實驗室檢測（核酸檢測+病毒特異性抗體檢測）結果進行綜合診斷，以防漏診、誤診。如發(fā)現(xiàn)檢測結果與臨床表現(xiàn)明顯不符，建議對整個檢測環(huán)節(jié)（樣本的采集、流轉及處理等環(huán)節(jié)）進行綜合分析，以排除SARS-CoV-2病毒早期感染、復發(fā)感染或合并其他呼吸道病毒感染等可能。如條件允許，建議采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的樣本進行復檢。