周麗芳，潘 順，唐振華

[上海交通大學(xué)附屬國際和平婦幼保健院檢驗(yàn)科 上海胚胎源性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市臨床重點(diǎn)?？疲ńㄔO(shè)項(xiàng)目）-強(qiáng)主體婦產(chǎn)科，上海 200030]

目前，妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）的診斷多采用口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）[1]，但OGTT需要多次采血，診斷敏感性為80%～85%，且影響因素較多，易導(dǎo)致漏診或誤診[2]。拉曼光譜是分子或晶格振動(dòng)能級(jí)光子產(chǎn)生的非彈性散射光譜。由于分子中不同化學(xué)鍵的振動(dòng)模式會(huì)導(dǎo)致拉曼光譜特征峰的強(qiáng)度和線寬發(fā)生變化，因此從所獲得的拉曼光譜可以推斷物質(zhì)中分子的結(jié)構(gòu)和組成[3]。由于拉曼光譜適用于液體基質(zhì)檢測，因此已有將其用于2型糖尿病等疾病診斷的報(bào)道[4]。但目前尚未見拉曼光譜應(yīng)用于GDM的報(bào)道。因此，本研究擬探討拉曼光譜在GDM中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年10月—2019年4月上海交通大學(xué)附屬國際和平婦幼保健院GDM患者42例[年齡（29.84±6.53）歲，GDM組]、正常妊娠婦女29例[年齡（28.96±7.81）歲，正常妊娠組]、非孕體檢健康者29名[年齡（30.86±6.85）歲，正常對(duì)照組]，用于方法學(xué)建立。另選取同期上海交通大學(xué)附屬國際和平婦幼保健院78例GDM患者[年齡（29.28±5.96）歲]和70名女性體檢健康者[年齡（28.71±7.93）歲]用于方法學(xué)評(píng)價(jià)。所有的GDM患者均采用國際糖尿病與妊娠研究組（the International Association of the Diabetes and Pregnancy Study Groups，IADPSG）推薦方法[5]確診。

1.2 方法

采集所有對(duì)象空腹靜脈血，離心分離血清后采用XploRA PLUS全自動(dòng)共聚焦拉曼光譜儀（日本HORIBA公司）進(jìn)行檢測。拉曼光譜儀的檢測原理見圖2。測定條件：激光波長785 nm，激光功率90 mW。操作步驟：取3 μL血清樣本滴加在鋁板上，自然干燥后，每個(gè)樣本選擇5個(gè)點(diǎn)，使用XploRA PLUS全自動(dòng)共聚焦拉曼光譜儀測定。每個(gè)點(diǎn)的時(shí)間積分為15 s，每份樣本采集3～5個(gè)光譜數(shù)據(jù)。

圖1 拉曼光譜儀檢測原理

1.3 拉曼光譜的處理

獲得的拉曼光譜先去除背景熒光，然后使用Origin 8.0和Raman基線軟件對(duì)光譜進(jìn)行基線校正和平均化，分析800～1 800 cm-1范圍內(nèi)的拉曼波數(shù)（共計(jì)1 026個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)）。根據(jù)文獻(xiàn)[6]對(duì)拉曼峰進(jìn)行歸屬指認(rèn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在MATLAB R2015b軟件平臺(tái)上用采用正交偏最小二乘回歸（orthogonal Partial least squares regression，OPLS）、主成分分析（principal component analysis，PCA）-支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）及PCA-隱含狄利克雷分布（latent dirichlet allocation，LDA）3種分類模型對(duì)得到的拉曼光譜進(jìn)行分類，篩選出拉曼光譜特征峰，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)3種模型的分類能力，計(jì)算準(zhǔn)確度、敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。

2 結(jié)果

2.1 GDM組、正常妊娠組及正常對(duì)照組的拉曼光譜分析

GDM組、正常對(duì)照組和正常妊娠組的拉曼光譜形狀和趨勢相似，但在強(qiáng)度上有一定差異。在856.61和1 034.47 cm-1處，GDM組的拉曼光譜峰強(qiáng)度低于正常妊娠組及正常對(duì)照組。在1 005.86、1 128.39和1 657.00 cm-1處，GDM組的拉曼光譜峰強(qiáng)度均高于正常對(duì)照組，但低于正常妊娠組。在1 159.66、1 442.32和1 523.06 cm-1處，GDM組拉曼光譜峰強(qiáng)度高于正常妊娠組和正常對(duì)照組。在1 343.69和1 523.06 cm-1處，GDM組有明顯的小拉曼光譜峰，而正常妊娠組和正常對(duì)照組在此處無明顯的拉曼光譜峰。

與正常對(duì)照組比較，GDM組有2個(gè)拉曼光譜峰出現(xiàn)左移（1 004.00 cm-1左移為1 005.86 cm-1，1 442.32 cm-1左移為1 445.00 cm-1），2個(gè)拉曼光譜峰右移（1 159.66 cm-1右移至1 157.00 cm-1，1 657.00 cm-1右移為1 655.00 cm-1）。見圖2。拉曼光譜峰歸屬指認(rèn)結(jié)果見表1。

圖2 GDM組、正常妊娠組及正常對(duì)照組的原始拉曼光譜圖

表1 各組拉曼光譜峰歸屬指認(rèn)表

2.2 PCA-SVM、PCA-LDA和OPLS 3種模型對(duì)拉曼光譜分類能力的評(píng)價(jià)

采用PCA-SVM、PCA-LDA和OPLS 3種模型對(duì)所得拉曼光譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，GDM組、正常妊娠組及正常對(duì)照組在1 005.86、1 034.47、1 128.39和1 343.69 cm-1處有明顯差異，見圖3。PCA模型可以區(qū)分GDM組和正常妊娠組、正常對(duì)照組，但無法區(qū)分正常妊娠組與正常對(duì)照組。OPLS模型對(duì)GDM組、正常對(duì)照及正常妊娠組的區(qū)分能力更強(qiáng)，見圖4。

圖3 PCA模型區(qū)分GDM組、正常對(duì)照組及正常妊娠組的散點(diǎn)圖

圖4 OPLS模型區(qū)分GDM組、正常對(duì)照組及正常妊娠組的散點(diǎn)圖

ROC曲線分析結(jié)果顯示，PCA-SVM模型、PCA-LDA模型和OPLS模型區(qū)分拉曼光譜的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.91、0.97、0.97，準(zhǔn)確度分別為90.34%、91.16%、96.09%，敏感性分別為91.33%、93.00%、100.00%，特異性分別為88.00%、88.50%、90.50%，陽性預(yù)測值分別為92.29%、92.98%、94.29%，陰性預(yù)測值分別為91.81%、92.00%、100.00%，見表2、圖5。

表2 PCA-SVM模型、PCA-LDA模型和OPLS模型對(duì)拉曼光譜分類能力的評(píng)價(jià) %

圖5 PCA-LDA模型、PCA-SVM模型和OPLS模型判斷拉曼光譜分類能力的ROC曲線

2.3 拉曼光譜診斷GDM的價(jià)值

采用OPLS模型對(duì)GDM患者的拉曼光譜進(jìn)行區(qū)分，并與OGTT進(jìn)行比較。在78例GDM患者和70名正常對(duì)照者中，OGTT有2例假陽性、7例假陰性，敏感性為91.03%，特異性為97.14%，準(zhǔn)確度為93.92%，陽性預(yù)測值為97.26%，陰性預(yù)測值為90.67%；拉曼光譜有5例假陽性、2例假陰性，敏感性為97.43%，特異性為92.86%，準(zhǔn)確度為95.27%，陽性預(yù)測值為93.83%，陰性預(yù)測值為97.01%。

3 討論

由于拉曼光譜技術(shù)在物質(zhì)檢測方面具有高效、簡便、無破壞性、成本低、樣本量少、樣本無需特殊制備、可重復(fù)性高且不會(huì)對(duì)樣本造成物理和化學(xué)分解等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于化工、刑偵、珠寶鑒定、地質(zhì)勘探、生物制藥以及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域，是目前無損分析檢測領(lǐng)域的熱點(diǎn)[7-9]。近年來，利用拉曼光譜技術(shù)開展的各項(xiàng)病變組織的檢測和疾病診斷分析在醫(yī)學(xué)界被廣泛關(guān)注，并在病原微生物的鑒定、腫瘤的早期鑒別與診斷、藥物動(dòng)力學(xué)的監(jiān)測分析、骨科疾病等多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開展了相應(yīng)的研究[10-13]。由于拉曼光譜比較適用于液體基質(zhì)檢測，國內(nèi)外已經(jīng)有學(xué)者將其應(yīng)用于糖尿病的診斷。LIN等[14]的研究結(jié)果顯示，基于銀納米粒子的Raman-oxyhb-sers方法與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合，對(duì)2型糖尿病的無標(biāo)簽檢測具有很大價(jià)值，其診斷準(zhǔn)確率分別為90.0%（PLS模型）和95.5%（PCA-LDA模型）。BIRECH等[15]利用拉曼光譜研究了亮氨酸和異亮氨酸作為2型糖尿病生物標(biāo)志物的潛力，結(jié)果顯示拉曼光譜在糖尿病的篩查和快速（10 s）診斷方面具有巨大的潛力，該方法還可作為吡格列酮與當(dāng)?shù)厥褂玫目固悄虿≈兴幪崛∥锆熜П容^研究的替代方法。

本研究采用的XploRA PLUS全自動(dòng)共聚焦拉曼光譜儀可以顯著提高空間分辨率（縱向＜2 μm，橫向＜1 μm），并可有效減少熒光干擾。本研究結(jié)果顯示，GDM組的拉曼光譜峰與正常對(duì)照組的拉曼光譜峰有一定差異。在1 005.86、1 034.47、1 087.64和1 128.39 cm-1處均出現(xiàn)較明顯的拉曼光譜峰，通過拉曼位移歸屬指認(rèn)，這4個(gè)拉曼光譜峰均含有糖化基團(tuán)，說明拉曼光譜可以反映血清中糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。在1 005.86、1 034.47、1 128.39和1 343.69 cm-1處，GDM組、正常妊娠組及正常對(duì)照組之間有明顯差異；且在1 343.69 cm-1處，GDM組有明顯的拉曼光譜峰，而正常妊娠組和正常對(duì)照組在此處無明顯的拉曼峰。歸屬指認(rèn)發(fā)現(xiàn)拉曼光譜特征峰1 343.69 cm-1主要代表直鏈淀粉、D-（+）-木糖、檸檬酸、D-果糖-6-磷酸、核黃素。本研究根據(jù)以上拉曼光譜特征峰，分別用PCA-SVM模型、PCA-LDA模型和OPLS模型進(jìn)行分類，結(jié)果顯示OPLS模型對(duì)GDM患者的拉曼光譜具有較好的分類能力。采用OPLS模型區(qū)分拉曼光譜診斷GDM的敏感性、準(zhǔn)確度高于OGTT，但特異性低于OGTT。因此，拉曼光譜在GDM的早期篩查中可能更具優(yōu)勢。另外，與OGTT比較，檢測拉曼光譜只需要采集1次空腹血清，可有效減少孕婦抽血次數(shù)。拉曼光譜還可直接從分子層面判斷糖化基團(tuán)，較少受到時(shí)間等因素的影響，可降低漏診率。

綜上所述，拉曼光譜結(jié)合OPLS模型診斷GDM的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度均較好，或可用于GDM的篩查和診斷。