李 卿，居 漪，唐麗萍，金中淦，孫賀偉

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

載脂蛋白（apolipoprotein，apo） B是致動脈粥樣硬化性脂蛋白的成分之一，其含量可體現(xiàn)低密度脂蛋白的顆粒數，尤其在評價伴有代謝綜合征和糖尿病的動脈粥樣硬化性心血管疾病時有重要的臨床意義[1]。apo A1作為抗動脈粥樣硬化的標志物，與apo B的比值可用于特定人群的風險評估和臨床決策[2]。

目前，apo A1和apo B的檢測主要采用免疫透射比濁法（immunoturbidimetry，ITA）。試劑盒中的抗體對apo抗原親和力的差異、抗原決定簇的異質性、apoA-I和apoB在不同脂蛋白中的結構等因素，造成不同品牌試劑盒檢測結果存在差異。實驗室在采用質譜技術對人血清apo進行絕對定量方面已經積累了一定的經驗[3-4]。apo A1和apo B的質譜定量方法一般為同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質譜（isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS）技術，即采用同位素標記多肽，結合可溯源的血清校準品，對apo A1和apo B進行絕對定量[5]。目前尚未見ID-LC-MS/MS技術應用于apo A1和apo B室間質量評價（external quality assessment，EQA）的報道。本研究在前期建立相關技術平臺的基礎上，結合EQA結果，探討ID-LC-MS/MS賦值作為EQA靶值的應用潛力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本 血清樣本質譜法定量所使用的校準品為人血清制品，由荷蘭萊頓大學醫(yī)學中心提供；apo A1和apo B由美國西北脂類代謝和糖尿病研究實驗室賦值，分別溯源至世界衛(wèi)生組織參考物質SP1-01和SP3-08；5份EQA樣本為人血清制品（編號分別為EQA1、EQA2、EQA3、EQA4和EQA5），購自上海伊華醫(yī)學科技有限公司，用于上海市臨床檢驗中心組織的2017年EQA活動。樣本經過均勻性和穩(wěn)定性檢驗，符合要求。

1.1.2 同位素標記物質和試劑 合成肽段VQPYLDDFQK和肽段TEVIPPLIENR中的亮氨酸（L）為同位素標記的氨基酸（13C15N）[吉爾生化（上海）有限公司]，二硫鍵還原劑三膦鹽酸鹽（美國Thermo Fisher公司），碘乙酰胺、脫氧膽酸鈉、Tris緩沖液、甲醇、甲酸（美國Sigma-Aldrich公司），Promega胰蛋白酶（測序級，上海普洛麥格生物產品有限公司）。

1.1.3 儀器 Agilent 1290 超高效液相系統(tǒng)（美國Agilent公司），AB5500 QTRAP三重串聯(lián)四級桿質譜儀（美國AB Sciex公司）。稱量使用賽多利斯型分析天平（美國Sartorius公司）。色譜柱使用Zorbax eclipse SB-C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 目標肽選擇 定量肽段用于定量apo A1和apo B的絕對含量。定性肽段用于確認和排除干擾。肽段選擇見表1。

表1 apo A1和apo B的肽段及母離子/子離子對

1.2.2 樣本前處理 用胰蛋白酶酶解5份人血清EQA樣本，所有的溶液均為新鮮配制，按照文獻[6]進行操作。（1）變性：樣本20倍稀釋后，使用0.523%脫氧膽酸鈉Tris溶液增溶，加入還原劑三膦鹽酸鹽，使其在反應體系中的終濃度為0.46%，56 °C 變性30 min，打開二硫鍵。（2）烷基化：取出變性樣本放置于室溫冷卻。每支樣本加入4.6 mmol/L碘乙酰胺20 μL，室溫避光放置30 min。（3）酶解：每支樣本加入胰蛋白酶酶液24 μL，37 ℃酶解3 h，加入終止液（4.7%甲醇和0.6%甲酸的水溶液）終止。

1.2.3 ID-LC-MS/MS分析 （1）液相色譜部分。流動相A為5%甲醇和0.05%甲酸水溶液，流動相B為95%甲醇和0.05%甲酸水溶液，流速為0.3 mL/min。洗脫梯度：流動相B為0.0～6.0 min 15%～85%；6.0～8.0 min 85%；8.0～8.1 min 85%～100%；8.1～10.0 min 100%；10.1～15.0 min 100%～15%。（2）質譜部分。使用正離子模式和多反應監(jiān)測方法，母離子/子離子對的選擇見表1。

1.2.4 ITA分析 EQA參加者按照試劑盒說明書進行操作，采用ITA分析5份EQA樣本。

1.3 統(tǒng)計學方法

建立ID-LC-MS/MS校準方程，以待測樣品的未標記定量肽和同位素標記定量肽的比值為自變量，通過校準方程計算含量并進行校準。使用統(tǒng)計軟件JMP 13.2繪制箱線圖。采用Minitab 18.0軟件進行Deming回歸分析。

2 結果

2.1 EQA結果

共有340家實驗室使用ITA檢測，apo A1和apo B的EQA結果見表2。

表2 apo A1和apo B的EQA結果

2.2 ID-LC-MS/MS檢測結果

ID-LC-MS/MS檢測結果為重復檢測3次得到的均值。apo A1項目EQA1、EQA2、EQA3、EQA4、EQA5的定量檢測結果分別為2.36、1.71、2.52、0.86和1.47 g/L；apo B項目EQA1、EQA2、EQA3、EQA4、EQA5的定量檢測結果分別為1.36、1.07、1.50、0.57和0.84 g/L。

2.3 ID-LC-MS/MS檢測結果與EQA結果的比較

apo A1項目，EQA2、EQA3、EQA4 IDLC-MS/MS的結果均低于ITA的中位數，EQA1和EQA5 ID-LC-MS/MS的結果高于ITA的中位數；apo B項目，除EQA4外，其他樣本IDLC-MS/MS的結果均低于ITA的中位數；見圖1。考慮到ID-LC-MS/MS和ITA的誤差，采用Deming回歸分析，結果顯示apo A1項目斜率的95%可信區(qū)間為0.977～0.992，截距的95%可信區(qū)間為0.008～0.035；apo B項目斜率的95%可信區(qū)間為0.828～1.054，截距的95%可信區(qū)間為-0.122～0.144。見圖2。

圖1 ID-LC-MS/MS檢測結果和EQA結果箱線圖

圖2 Deming回歸分析結果

3 討論

目前正在運行的apo標準化體系使用的參考物質包括世界衛(wèi)生組織參考物質，編號分別是SP1-01和SP3-08，此二級參考物質由國際臨床化學與檢驗醫(yī)學聯(lián)合會的apo標準化工作組研制，由該工作組的組織方——美國西北脂類代謝和糖尿病研究實驗室賦值，采用免疫法測定。定值所使用的一級參考物質包括BCR-CRM393（純化apo A1）和密度為1.03～1.05的超速離心純化的低密度脂蛋白（用于apo B）。但是免疫法作為參考方法可能會受交叉反應、自身抗體[7]、親和力減弱、抗原表位變性等因素干擾。近年來，有學者嘗試使用質譜來更準確地測定apo A1和apo B[8-9]，其中Cobbaert教授團隊建立的質譜定量方法最為成熟[5]，是國際臨床化學與檢驗醫(yī)學聯(lián)合會apo質譜檢測工作組的指定檢測方法。

ID-LC-MS/MS是對靶向蛋白質絕對定量的重要方法，其將穩(wěn)定同位素標記的內標肽加入到胰酶酶切產生的多肽中，由于內標肽和內源性肽具有相同的序列，因此具有相同的液相色譜保留時間、質譜離子化效率和碎裂模式。通過比較兩者子離子信號強度，可計算出目標蛋白質的量?；贗D-LC-MS的apo參考方法和標準化研究是近年來的研究熱點，但尚未見將該技術應用于EQA樣本定值和評價的研究報道。

對于定義分析質量，2014年米蘭戰(zhàn)略會議提出了3個模型，即基于檢測性能對臨床結果影響的模型1、基于被測量生物變異的模型2和基于現(xiàn)有最高技術水平的模型3[10-11]?！吨袊扇搜惓７乐沃改希?016年修訂版）》（簡稱指南）對apo A1和apo B的偏移規(guī)定為靶值±5%[12]，該指南明確說明“靶值一般指參考（標準）物質定值或參考方法測定值”。因此，當以靶值±5%作為判斷標準時，所有參與者檢測5個EQA樣本的平均合格率分別為61.5%（apo A1）和41.0%（apo B）。從最新的生物變異數據庫中計算偏移[13]，得出apo A1的最低偏移要求為4.6%（適中為3.0%，最優(yōu)為1.5%），與指南規(guī)定的5%接近；而apo B的最低偏移要求為8.1%（適中為5.4%，最優(yōu)為2.7%），比指南規(guī)定的5%要求更松，此時所有參與者檢測5個EQA樣本的平均合格率上升至61.8%。值得注意的是，WS/T 403—2012《臨床生物化學檢驗常規(guī)項目分析質量指標》指出，中等和低等偏移造成錯誤診斷的發(fā)生率分別為14%和32%，但apo A1和apo B的偏移與錯誤診斷發(fā)生率仍需進一步研究。若采用美國病理學家協(xié)會使用的標準，即靶值±15%，所有參與者檢測5個EQA樣本的平均合格率分別為95.1%（apo A1）和89.7%（apo B）。

綜上所述，在需要使用靶值評價的臨床指南或者EQA工作中，基于ID-LC-MS/MS的候選參考方法具有一定的應用潛力。