簡少芬 ，龔舒，馬延紅，劉天開，龔記熠，乙引*，劉文華*

（1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

佛手（bergamot）可指兩個物種，一是主產(chǎn)于我國的佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）[1]；二是盛產(chǎn)于意大利、印度等地的佛手柑（Citrus bergamia，Risso et Poiteau）[2-3]，均為蕓香科柑橘屬植物，容易被混淆。本文概述產(chǎn)于我國的佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）。因佛手果實(shí)成熟時各心皮分離，形成細(xì)長彎曲的果瓣，狀如手指，故得此名[4]，又稱五指香櫞、佛手柑、五指橘等[5]。佛手主要分布在廣東、福建、浙江、四川等地，分別稱為廣佛手、閩佛手、金佛手、川佛手[6]，不同產(chǎn)地佛手果的化學(xué)成分存在一定差異[7]。佛手果不僅具有疏肝理氣、止痛和胃[8]、抗氧化、抗腫瘤[9]、消腫降痰、抗菌消炎[10]等多種藥用功效，還可以加工成佛手糖、果脯蜜餞[11]、佛手果酒[12]、佛手酥[13]、佛手酸奶等保健食品。佛手果中含有黃酮類、揮發(fā)油、多糖類、香豆素類等活性成分，其中黃酮類化合物是佛手的主要活性成分[14]，黃酮類化合物具抗氧化[15]、鎮(zhèn)痛抗炎、保護(hù)消化系統(tǒng)[16]、降低血清膽固醇[17]、抗心血管疾病[18]、抗腫瘤[19]、抗菌[20]等作用，有治療和保健功效，已成為研究熱點(diǎn)。本文依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，對佛手中黃酮類化合物提取、分離、生理活性與保健功能等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納和總結(jié)，為佛手黃酮的研究開發(fā)提供科學(xué)參考。

1 佛手黃酮類化合物

佛手含有豐富的黃酮類化合物，目前已從佛手果中分離、鑒定的黃酮苷元如表1所示。

表1 佛手果中已分離、鑒定的黃酮苷元Table 1 Flavonoids aglycones contained in bergamot

續(xù)表1 佛手果中已分離、鑒定的黃酮苷元Continue table 1 Flavonoids aglycones contained in bergamot

不同產(chǎn)地的佛手果其黃酮類化合物的成分和含量有所差異。張璐等[26]采用高效液相色譜法對廣東、廣西、四川、浙江、福建、云南共6個產(chǎn)地的佛手藥材進(jìn)行橙皮苷定量測定，發(fā)現(xiàn)云南、廣東、廣西和四川佛手的橙皮苷含量較高，而浙江、福建佛手的橙皮苷含量相對較低。張振霞等[27]的研究結(jié)果表明廣佛手的橙皮苷含量明顯高于浙江金華佛手。鐘艷梅等[7]采用超高效液相色譜儀聯(lián)用四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，對10個不同產(chǎn)地佛手藥材的化學(xué)成分（主要是黃酮類和香豆素類化合物）進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)其中9個產(chǎn)地的佛手可分為3個相似組，即福建、安徽與江蘇產(chǎn)佛手；四川、云南與廣西產(chǎn)佛手；廣東梅州、廣東潮州與廣東肇慶產(chǎn)佛手；各組內(nèi)不同產(chǎn)地佛手化學(xué)成分相似度較高，而浙江佛手化學(xué)成分與其他9個產(chǎn)地的差異較大。

2 佛手黃酮類化合物的提取工藝

佛手黃酮類化合物的提取方法主要有超聲輔助提取法、微波輔助提取法、乙醇提取法以及酶提取法。

2.1 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法主要是利用超聲波破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，促進(jìn)黃酮類化合物的釋放[28]。采用超聲輔助技術(shù)提取植物有效成分具有時間短、效率高、成本低、能耗低和不破壞化合物分子結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)[29-31]。

姜立春等[32]通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計，對超聲波輔助提取川佛手果實(shí)總黃酮的最佳提取工藝進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，用 70%的乙醇，料液比 1∶15（g/mL），超聲功率420 W，在60℃條件下提取40 min，并提取2次，黃酮得率可達(dá)5.12%，提取得率最高，重現(xiàn)性較好。章斌等[33]采用超聲波輔助法提取佛手果總黃酮，并通過響應(yīng)面法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，料液比1∶15（g/mL），超聲功率167 W，在 42℃條件下提取40 min，黃酮得率3.22%，提取效果最佳。陳潔等[34]通過單因素以及正交試驗(yàn)對金佛手果實(shí)總黃酮進(jìn)行了超聲波提取的工藝研究，研究表明，用60%的乙醇，料液比1 g∶10 mL，在35℃條件下提取15 min，所得總黃酮含量為36.75 mg/g，提取效果最佳。以上研究均采用超聲波輔助法提取佛手果黃酮，超聲提取溫度在35℃～60 ℃，提取時間 15 min～40 min，料液比 1∶10（g/mL）～1∶50（g/mL），在此條件范圍下提取佛手果黃酮均得到較好的提取效果，佛手黃酮得率較高。因此，可以作為超聲輔助法提取佛手黃酮工藝的參考條件范圍，以便優(yōu)化提取工藝，獲得更好的提取效果。

2.2 微波輔助提取法

微波輔助提取法主要是利用微波穿透并作用于細(xì)胞內(nèi)的水等極性物質(zhì)后，細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速上升，水汽化將細(xì)胞漲破，使目標(biāo)成分進(jìn)入提取溶劑并溶解，達(dá)到分離和提取的效果[35-36]。利用微波輔助技術(shù)提取植物中的化合物成分可以縮短萃取時間、減少溶劑用量，提高收率和純度，并降低生產(chǎn)成本[37-38]。

趙麗麗等[39]通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計，分別研究了表面活性劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率和微波時間對金佛手果總黃酮提取量的影響，結(jié)果顯示，用0.6%的 SDS，料液比 1 ∶20（g/mL），在 50 W 的微波功率下提取30 s，所得黃酮含量為18.71 mg/g，提取效果最佳。李勇等[40]在研究不同中藥材炮制方法對佛手總黃酮提取量的影響時，發(fā)現(xiàn)微波輔助法提取得到的佛手黃酮含量較高，研究中還發(fā)現(xiàn)當(dāng)微波加熱時間超過90 s時，藥材會出現(xiàn)部分碳化，這可能是導(dǎo)致黃酮類成分損失的主要原因，因此微波輔助提取黃酮類化合物時應(yīng)嚴(yán)格控制微波加熱時間。

2.3 乙醇提取法

根據(jù)相似相溶原理，常用乙醇作為提取劑進(jìn)行黃酮類化合物的提取[41]。乙醇提取效率較高，而且成本低、易回收、毒性小，具有一定的經(jīng)濟(jì)性和可行性[42]。超聲輔助法提取黃酮時會用到乙醇溶液進(jìn)行物料前處理，但主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出獲得黃酮化合物。相對于超聲輔助法提取規(guī)模較小，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)的不足之處，直接利用乙醇溶液浸取物料提取黃酮類化合物的方法，更適合大規(guī)模生產(chǎn)[43]。

劉玉芬等[44]以乙醇溶液為提取溶劑從佛手中提取總黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以佛手黃酮提取率為指標(biāo)，選擇提取溫度、提取時間和料液比3個因素進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，對佛手果實(shí)黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。研究顯示，用60%的乙醇，料液比1∶32（g/mL），在 69℃的條件下提取 1.9 h，提取 2次，黃酮得率0.57%，提取效果最佳。王晉等[45]通過乙醇回流法提取佛手總黃酮，結(jié)果表明，用73%的乙醇，料液比 1∶31（g/mL），在 80℃的條件下提取 90 min，黃酮得率1.34%，提取效果最好。

2.4 酶輔助提取法

酶輔助提取法是指在提取過程中加入合適的酶，利用酶催化作用的高選擇性對植物組織進(jìn)行分解，保留提取物中的有效成分，達(dá)到快速有效提取[46]。利用酶提取黃酮類化合物不僅可以提高化合物的純度，而且較好地保護(hù)了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，更重要的是，酶提取法不需要在高溫條件下進(jìn)行，方便簡單[47]。目前，植物黃酮類化合物的提取主要使用纖維素酶，纖維素酶可以迅速降解纖維素，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而加快黃酮類化合物的釋放，提高黃酮類化合物的產(chǎn)量[48]。

章斌等[49]采用復(fù)合酶法（纖維素酶量∶果膠酶量=3∶1，質(zhì)量比）提取廣佛手果總黃酮。并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對佛手果黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，結(jié)果顯示，用1.0%（酶與底物質(zhì)量比E/S）的酶量，pH 4.5，在45℃下酶解120 min，黃酮得率4.10%，提取效果最佳。

3 佛手黃酮類化合物的生理活性和保健功能

3.1 抗氧化作用

趙麗麗等[39]研究發(fā)現(xiàn)金佛手黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和 2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azinobis （3-ethylbenzothi azoline-6）-sulfonic acid，ABTS＋]自由基清除率分別為 79.15%和65.25%，其抗氧化活性略低于槲皮素，表明金佛手黃酮具有顯著抗氧化活性。王晉等[45]研究發(fā)現(xiàn)佛手黃酮對DPPH自由基和ABTS＋自由基均有一定的清除作用，且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其中DPPH自由基清除率的IC50為0.8mg/mL，ABTS＋自由基清除率的 IC50為 0.07mg/mL，總抗氧化能力為20.18 μmol TE/g，表明佛手黃酮是一種良好的天然抗氧化劑。黃小梅等[50]對川佛手黃酮粗提物、黃酮純化物、維生素C和蘆丁進(jìn)行了抗氧化比較研究，發(fā)現(xiàn)川佛手黃酮純化物對DPPH自由基和羥自由基的清除率分別可達(dá)到82.22%和69.46%，其清除率略高于維生素C和蘆丁，表明川佛手黃酮純化物具有較好的清除自由基能力和較強(qiáng)的抗氧化活性。

佛手黃酮的抗氧化作用可能與其所含的多種黃酮苷元的抗氧化活性有關(guān)。Olaleye等[51]研究了蘆丁和槲皮素對高鹽飲食喂養(yǎng)的大鼠血壓和抗氧化防御系統(tǒng)的影響。發(fā)現(xiàn)高鹽飲食后的小鼠出現(xiàn)平均動脈血壓升高、抗氧化酶的活性降低、總膽固醇濃度顯著增加等現(xiàn)象，而蘆丁和槲皮素的治療能夠改善高鹽飲食對這些生化指標(biāo)的不良影響，且效果強(qiáng)于硝苯地平，表明蘆丁和槲皮素具有一定的抗氧化活性和降壓特性。Patil等[52]研究了蘆丁和槲皮素對全身γ射線照射的瑞士白化小鼠的輻射防護(hù)作用，小鼠連續(xù)5 d口服蘆丁10 mg/（kg·d）或槲皮素20 mg/（kg·d），再經(jīng)10 Gy的γ射線照射，30 d后對照組小鼠存活率為0，而給藥組的存活率提高到50%左右，進(jìn)一步研究表明這與蘆丁和槲皮素的抗氧化以及抗脂質(zhì)過氧化活性有關(guān)。Cho[53]使用無細(xì)胞生物測定系統(tǒng)和原代培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞，對橙皮苷及橙皮素的抗氧化和神經(jīng)保護(hù)活性進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)橙皮素可以抑制大鼠腦勻漿中由Fe2+和L-抗壞血酸引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)原代培養(yǎng)的皮層細(xì)胞免受H2O2、黃嘌呤或黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的氧化損傷，而橙皮苷的抗氧化活性相對較小。

3.2 降血脂作用

夏雨等[54]通過測定樣品對膽酸鹽的吸附能力來表征其降血脂活性，結(jié)果表明佛手黃酮、多酚和多糖都有一定的體外結(jié)合膽酸鹽的能力，且佛手黃酮、佛手多酚的效果要好于佛手多糖，說明佛手黃酮具有一定的降血脂能力。鄧德城等[21]探討了主要活性成分為新橙皮苷、柚皮苷等黃酮類化合物的佛手提取物對膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的限速酶——膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1） 表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明佛手提取物能上調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞中CYP7A1及其轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體α、肝細(xì)胞核因子4α的表達(dá)水平，說明佛手提取物具有一定的降脂作用。

佛手所含的柚皮苷和柚皮素等黃酮苷元具有降血脂作用。Kim等[55]為了研究柚皮苷對肝臟膽固醇調(diào)節(jié)的影響，給Sprague-Dawley大鼠喂養(yǎng)添加了柚皮苷的高脂高膽固醇飼料，6周后發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能顯著降低實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿膽甾醇和甘油三酸酯水平，說明柚皮苷可降低肝臟膽固醇的生物合成和血脂水平。徐楠等[56]利用文獻(xiàn)檢索、軟件分析等方法系統(tǒng)評價了柚皮素對血脂水平的影響，結(jié)果表明柚皮素具有降血脂作用，可以治療高血脂癥。

3.3 抗動脈硬化作用

龔正等[57]研究發(fā)現(xiàn)佛手黃酮類提取物可以降低高脂血癥模型兔血清總膽固醇、丙二醛以及炎癥因子白細(xì)胞介素-1β的含量，升高血清一氧化氮水平、肝組織載脂蛋白E表達(dá)水平，提示佛手黃酮可保護(hù)血管內(nèi)皮，促進(jìn)血管舒張功能的恢復(fù)，從而拮抗動脈粥樣硬化進(jìn)程。

佛手所含的槲皮素也具有抗動脈硬化作用。呂麗[58]探討了動脈粥樣硬化大鼠胸主動脈病理變化及機(jī)制，并對體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞用槲皮素進(jìn)行干預(yù)，檢測了PI3K/Akt/NF-κB信號通路的主要蛋白表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素干預(yù)可有效改善動脈粥樣硬化引起的脂代謝紊亂，減輕動脈粥樣硬化病理改變，改善動脈壁結(jié)構(gòu)，同時可顯著抑制動脈粥樣硬化時血管平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖，以及由二者的增殖導(dǎo)致的動脈壁膠原成分增加，延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

4 小結(jié)與展望

佛手是我國傳統(tǒng)藥食兩用藥材，具理氣和胃、平喘止咳、抗氧化等功效，在廣東肇慶、浙江金華等多個地方已形成了一定的種植規(guī)模。但在我國佛手的開發(fā)利用層次仍然較低，果農(nóng)主要通過銷售佛手鮮果和盆景來獲得收益，深加工產(chǎn)品較少[59]。隨著人口老齡化，老年性疾病患者逐漸增加，通過功能性保健食品來提高身體素質(zhì)、預(yù)防疾病、改善生活質(zhì)量已成為發(fā)展趨勢。佛手是傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材，除藥用外，還可用于提取香料、加工成果脯蜜餞、生產(chǎn)飲料和保健食品。因此，對佛手黃酮、多糖、揮發(fā)油等活性成分進(jìn)行多層次的深入研究，開發(fā)佛手中藥材飲片、保健食品、香料精油等系列精深加工產(chǎn)品，對于提高佛手產(chǎn)品附加值以及延伸佛手產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。

黃酮是佛手的主要活性成分，佛手黃酮具有清除自由基、抗氧化、抗動脈硬化、降血脂等多種藥用保健功能。目前，對佛手總黃酮生物活性的系統(tǒng)研究還不多，而對其中一些單體化合物已有較為詳盡的研究報道，如蘆丁具有抗氧化[51-52]、神經(jīng)保護(hù)[60-61]、鎮(zhèn)痛[62]等活性；橙皮苷具有心血管保護(hù)[63]、防輻射[64]、神經(jīng)保護(hù)[65-66]等功效；香葉木苷具有降血糖[67]、抗癌[68-69]、抗細(xì)胞凋亡[70]等活性；槲皮素具有抗炎[71-72]、抗癌[73]等功效。從上述結(jié)果可知，這些單體化合物的功效更為廣泛，其中神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抗細(xì)胞凋亡等活性都還未在佛手總黃酮中得到報道。因此，深入挖掘佛手黃酮的其他潛在價值，拓展佛手的藥用保健功效，對佛手相關(guān)產(chǎn)品的深層次開發(fā)具有重要意義。