貝翠平 ，柳艷霞 *，趙改名 ，張麗萍 ，張憶臻

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

美拉德反應(yīng)是一種非酶促褐變反應(yīng)，發(fā)生在食品的烹調(diào)、加工以及儲藏過程中，并對其風(fēng)味、顏色、質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)等性質(zhì)產(chǎn)生重要的影響[1-2]。除了對高溫條件的美拉德反應(yīng)的研究外[3-6]，部分學(xué)者開始對溫和美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物展開了一系列研究[7-8]。溫和美拉德反應(yīng)在發(fā)酵肉制品成熟過程中具有重要作用，其反應(yīng)過程、反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)和反應(yīng)溫度、時間、pH值等有關(guān)[9]，美拉德反應(yīng)生成的產(chǎn)物非常復(fù)雜[10]，要建立單一模擬反應(yīng)再對其反應(yīng)物的性質(zhì)及形成機(jī)理等方面進(jìn)行研究[11]。精氨酸是堿性氨基酸，對香味形成有很大貢獻(xiàn)[12]，有研究報道金華火腿中的游離精氨酸可以和葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)[13]，反應(yīng)產(chǎn)物對火腿風(fēng)味的形成具有很大的影響?，F(xiàn)在精氨酸的研究大多都是對美拉德產(chǎn)物抗氧化性的研究[14-15]，而對于溫和條件下精氨酸-美拉德反應(yīng)揮發(fā)性風(fēng)味的變化研究較少。因此本文選取精氨酸和葡萄糖為反應(yīng)底物，構(gòu)建溫和條件下精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系。

固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和電子鼻技術(shù)是研究食品中揮發(fā)性物質(zhì)常用的檢測方法。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）主要用于揮發(fā)性物質(zhì)的定性和半定量分析[16]，電子鼻技術(shù)是一種用途廣泛、實(shí)時快速無損的風(fēng)味物質(zhì)分析檢測方法[17]；該技術(shù)已用于肉制品[18]、食用油[19]、酒[20]、水果[21-22]、牛奶[23]等食品的風(fēng)味分析中。把GC-MS和電子鼻相結(jié)合研究溫和條件下精氨酸-美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)報道較少。為此，本研究以金華火腿成熟時最高溫度40℃為反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間為10 d至60 d等6個時間點(diǎn)，采用電子鼻和GCMS技術(shù)對精氨酸-葡萄糖體系樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）建立揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的評價模型，為研究溫和條件下精氨酸美拉德反應(yīng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-（+）-葡萄糖（純度≥99.50%）、L-精氨酸：美國Sigma-Aldrich公司；2-甲基-3-庚酮（內(nèi)標(biāo)化合物）：艾吉析科技（上海）有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.0）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm濾菌膜：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)制備有限公司；PEN3便攜式電子鼻系統(tǒng)：德國Airsense公司；75μmCAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；7890A/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

模擬體系的制備：將D-（+）-葡萄糖和L-精氨酸分別溶解于pH6.0、濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，經(jīng)0.22 μm濾菌膜過濾除菌后分別移取一定體積葡萄糖和氨基酸溶液于15 mL的頂空瓶中混合均勻，置于40℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。反應(yīng)時間設(shè)置為10、20、30、40、50、60 d，樣品反應(yīng)結(jié)束后置于-25 ℃冰箱終止反應(yīng)，測定揮發(fā)性產(chǎn)物。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 揮發(fā)性產(chǎn)物GC-MS分析

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精確稱取2-甲基-3-庚酮25 mg溶于10.0 mL甲醇中，制成濃度為1.25 mg/mL的2-甲基-3-庚酮內(nèi)標(biāo)溶液，置于4℃冰箱備用。

揮發(fā)性產(chǎn)物固相微萃?。簩⒐滔辔⑤腿⊙b置中的萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口250℃處老化0.5 h。萃取頭插入15 mL頂空瓶并緩慢推出吸附纖維頭（注意不能碰到任何物質(zhì)），50℃恒溫吸附45 min，隨即緩慢收回萃取頭后插入氣相色譜儀，進(jìn)樣口溫度250℃處解析5 min。

色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm），載氣 He，流速 1 mL/min、不分流，恒流。進(jìn)樣口和接口溫度250℃，升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0℃保持3 min；以5℃/min升溫至60℃，以8℃/min升溫至180℃，以10℃/min升溫至240℃，保持6 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，燈絲電流 100 μA，掃描質(zhì)量范圍：33～400 m/z。

數(shù)據(jù)分析：將GC-MS分析圖譜經(jīng)計算機(jī)和人工把檢出的每個峰與NISTDEMO圖譜庫進(jìn)行比較，相似指數(shù)（similarity index，SI）在800以上者為確定的化合物；通過計算待測揮發(fā)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比求得其濃度，計算公式如下。

濃度/（ng/g）=峰面積比（揮發(fā)物/內(nèi)標(biāo)物）×1.25 μg（內(nèi)標(biāo)物）×1 000/6g（樣品質(zhì)量）

1.3.2.2 揮發(fā)性產(chǎn)物電子鼻分析

電子鼻由10種金屬氧化物傳感器構(gòu)成，每種傳感器對不同種類物質(zhì)的敏感性存在差異，具體性能如表1 所示[24]。

表1 化學(xué)傳感器及相應(yīng)的敏感物質(zhì)類型Table 1 Chemical sensors and the corresponding types of volatile substances

參照黨亞麗[25]的試驗(yàn)方法，將15 mL頂空瓶用3層保鮮膜封口，將樣品在50℃恒溫水浴鍋中平衡30 min，干燥空氣作為載氣，采樣時間間隔為1 s，清洗時間120 s，歸零時間5 s，樣品測定時間80 s，進(jìn)樣流速為300 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采Origin2018和SPSS25進(jìn)行處理與統(tǒng)計分析，并采用Origin2018軟件繪制聚類熱圖和傳感器堆積圖。

電子鼻數(shù)據(jù)分析：采用SPSS25進(jìn)行PCA和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）分析，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后確定特征根、特征向量，根據(jù)各主成分值和主成分貢獻(xiàn)率得出各個反應(yīng)時間揮發(fā)性成分的評價模型，計算出不同反應(yīng)時間樣品的綜合得分。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系電子鼻分析

2.1.1 PCA分析

PCA是將電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，將主要信息保留在幾個不相關(guān)的主成分中[26]。一般前2個主成分包含了原始數(shù)據(jù)的主要信息[27]。旋轉(zhuǎn)后的載荷因子見表2。

表2 旋轉(zhuǎn)后的載荷因子Table 2 Load factor after rotation

由表2可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系第1主成分主要反映氮氧化物和硫化合物等化合物信息，第2主成分主要反映芳烴化合物、硫的有機(jī)化合物和氫化物等信息，此結(jié)果和張鳳梅等[28]的研究結(jié)果存在差異，可能是由氨基酸的種類和性質(zhì)不同造成的。精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性產(chǎn)物主成分分析見圖1。

圖1 精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性產(chǎn)物主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile products in Maillard reaction system of arginine-glucose

由圖1可知，主成分1的貢獻(xiàn)率為69.242%，主成分2的貢獻(xiàn)率為19.84%，累計貢獻(xiàn)率為89.082%，因此，應(yīng)選用前2個主成分的數(shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。10 d和20 d、30 d和40 d、50 d和60 d 3組相鄰的時間點(diǎn)數(shù)據(jù)在主成分2上較為接近，但在主成分1上差異明顯，說明在20 d和30 d之間、40 d和50 d之間反應(yīng)生成的物質(zhì)發(fā)生了明顯的變化。

2.1.2 LDA分析

LDA是利用所有傳感器的信號研究樣品所屬類別的一種統(tǒng)計方法。精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性產(chǎn)物L(fēng)DA分析見圖2。

圖2 精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性產(chǎn)物L(fēng)DA分析Fig.2 LDA analysis of volatile products in the Maillard reaction system of arginine-glucose

由圖2可知，LDA1和LDA2的貢獻(xiàn)率分別為66.9%和28.4%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到95.3%基本代表原始變量的絕大部分信息。在LDA1上50 d和60 d與其它時間點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，說明在反應(yīng)過程中揮發(fā)性物質(zhì)豐度逐漸減小。而30 d與40 d樣品在LDA1上距離較近，但在LDA2上則可完全分開。通過電子鼻對不同反應(yīng)時間的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PCA和LDA均能很好地區(qū)分30 d和40 d的樣品。但利用LDA不能很好地區(qū)分其它反應(yīng)時間之間的揮發(fā)性成分，PCA則能進(jìn)行明顯區(qū)分，說明PCA是辨別不同反應(yīng)時間精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性成分差異的有效分析方法。

2.2 精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性產(chǎn)物GCMS分析

2.2.1 揮發(fā)性成分種類及含量分析

揮發(fā)性成分種類及含量分析見表3和表4。

表3 精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系不同反應(yīng)時間揮發(fā)性化合物分析結(jié)果Table 3 Analysis results of volatile compounds in the Maillard reaction system of arginine-glucose at different reaction times

續(xù)表3 精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系不同反應(yīng)時間揮發(fā)性化合物分析結(jié)果Continue table 3 Analysis results of volatile compounds in the Maillard reaction system of arginine-glucose at different reaction times

表4 不同反應(yīng)時間精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性成分種類數(shù)與含量Table 4 Number and content of volatile components in Maillard reaction system of arginine-glucose with different reaction times

由表3和表4可知，6個反應(yīng)時間點(diǎn)共檢測出50種揮發(fā)性物質(zhì)，大致可分為6大類，分別是醇類、醛類、酮類、酯類、烴類、其它。10、20、30、40、50 d 和 60 d 中分別檢測到 27、19、23、19、23 種和 18 種化合物。20 d 時總揮發(fā)性成分含量最高（1 989.1 ng/g），其次是10 d（1 848.5 ng/g）、60 d（1 472.39 ng/g）、40 d（1 442.7 ng/g）、30 d（1 373.5 ng/g）及 50 d（942.07 ng/g）。其中含量最高的是酯類，主要包含乙酸乙酯、亞硝酸仲丁酯和己酸-2-苯乙酯；其他類物質(zhì)次之，主要包含乙二醇二乙醚和乙醚。由表4可知，10 d生成的揮發(fā)性化合物種類最多（27種），其次是30 d和50 d（23種）。

醇類是精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性物質(zhì)中含量排名第三的物質(zhì)，其前體物質(zhì)主要是多不飽和脂肪酸[29]。在20 d中醇類物質(zhì)含量最高到可達(dá)到389.7ng/g，其中乙醇是主要揮發(fā)性物質(zhì)（185.04 ng/g），其次是（3-叔丁基-5-羥基甲基-環(huán)己-2-烯基）-甲醇和1-環(huán)己基-2-丁烯-1-醇。30 d醇類含量達(dá)到226.48 ng/g，僅次于 20 d。

醛類物質(zhì)氣味閾值較低，具有脂香氣味，是肉類香氣的指標(biāo)[30]。但是精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系中醛類含量較少，對總體揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)暫不能確定。但有研究表明許多Strecker醛本身及其反應(yīng)產(chǎn)物對于食品香料有著非常重要的作用[31]。醛類物質(zhì)在10 d到20 d呈上升趨勢，隨著反應(yīng)時間的延長含量卻減少，可能是醛類和后續(xù)生成的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致醛類含量的下降。糠醛含量是表征食品變質(zhì)程度、食品儲藏時間長短的一項(xiàng)重要指標(biāo)[32]，其中甘氨酸對半胱氨酸-木糖[33]反應(yīng)也檢測到了糠醛的存在。己醛[34]具有青草味、香脂，最高含量達(dá)到111.96 ng/g，而鄧仕彬[35]的研究中也檢測到己醛的存在，含量達(dá)到2.12 ng/mL，兩者因?yàn)轶w系不同導(dǎo)致己醛含量也不盡相同。

酮類的來源一方面可能是由醇類氧化，另一方面可能是脂類分解產(chǎn)生的[36]，短鏈酮類具有脂香和焦香香氣而長鏈酮類則呈現(xiàn)花香氣息[37]。酮類物質(zhì)在20 d和50 d時生成的較多，是美拉德反應(yīng)的重要產(chǎn)物[38]，由表4可知醛類物質(zhì)的含量高于酮類物質(zhì)，由于酮類的閾值一般高于其同分異構(gòu)體的醛類[39]，所以酮類對風(fēng)味的貢獻(xiàn)相對于醛類物質(zhì)作用相對不大。隨著反應(yīng)時間的延長，酮類物質(zhì)的含量20 d和50 d較高，分別為114.51ng/g和104.15 ng/g。丙酮是重要的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其含量在20 d時達(dá)到最高96.52 ng/g，而崔和平[40]的研究因氨基酸種類和處理方式不同導(dǎo)致檢測到丙酮含量達(dá)到 32.05 （μg/L）。N-（4-bromobut-1-yl）piperidin-2-one在反應(yīng)中的不同時間點(diǎn)均有產(chǎn)生，（1S-順）-1-（2，2，6-三甲基環(huán)己基）乙酮只有在 50 d時檢測到，而丙酮在20 d和50 d中檢測到，其中苯乙酮具有杏仁味和堅果味，在袁林等[41]的研究中也有發(fā)現(xiàn)，且相對含量達(dá)到0.95%。有研究表明酸和醇發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生酯類物質(zhì)[42]，且酯類物質(zhì)能夠使食品具有甜香氣味和輕微油脂氣味[43]。由表4可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系中酯類化合物含量最高，此結(jié)果與張佳敏等[44]研究結(jié)果一致。酯類物質(zhì)中含量較高的是乙酸乙酯，具有水果味、甜味[45]。

酯類物質(zhì)在10 d和20 d中含量較多而在50 d時含量最少，可能是隨著反應(yīng)時間的延長，一些復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致了酯類在一定程度上的降解。由表3可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系中共檢測出烴類化合物有11種。隨著反應(yīng)時間的延長，烴類物質(zhì)大致呈現(xiàn)下降趨勢，且在30 d時達(dá)到最低，50 d次之。烴類物質(zhì)在精氨酸-葡萄糖美拉德體系中含量較低但是閾值較高，在整體上對精氨酸-葡萄糖美拉德體系揮發(fā)性成分影響不大。但是有一些烴類也具有獨(dú)特的風(fēng)味，如在50 d中檢測到的（+）-檸檬烯具有新鮮橙子香氣及檸檬香氣[46]。不同反應(yīng)時間聚類熱圖見圖3。

聚類熱圖能直觀地表明6個時間點(diǎn)中各特征香氣濃度的差異。由圖3可知，根據(jù)橫向分析發(fā)現(xiàn)10 d和50 d 特征香氣成分差異明顯，可分為Ⅰ（10d）、Ⅱ（20、30、40、60 d）和Ⅲ（50 d）三大類。根據(jù)縱向分析發(fā)現(xiàn)，可將特征香氣成分分為Ⅰ[AD～J即（+）-檸檬烯～戊醛]、Ⅱ（AF～B即 2，4-二甲基己烷～1-丁醇）、Ⅲ（AC～C即乙基苯～4-氨基-1-戊醇）和Ⅳ（O～A即丙酮～乙醇）4個系列。Ⅰ系列含有戊醛和糠醛，呈現(xiàn)刺激性氣味都是50 d獨(dú)有的物質(zhì)。Ⅱ系列多以醇類酯類為主；Ⅲ系列含有的己醛[34]和乙酸乙酯[47]具有青草味、香脂味和蘋果果皮味，反應(yīng)10 d和20 d的樣品含量最多，可能是隨著反應(yīng)時間較長，生成的物質(zhì)與二者反應(yīng)，使得含量下降。Ⅳ系列含有乙醇和丙酮。

圖3 精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系不同反應(yīng)時間聚類熱圖Fig.3 Clustering heat map of arginine-glucose Maillard system with different reaction times

2.2.2 PCA分析

2.2.2.1 不同反應(yīng)時間的精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性成分PCA

主成分的特征值與貢獻(xiàn)率見表5，主成分的特征向量與載荷矩陣見表6。

表5 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表5可知，第1、第2、第3主成分的貢獻(xiàn)率分別為58.234%、25.638%、11.96%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到95.832%，基本代表原始變量的絕大部分信息。主成分的載荷值的大小代表該主成分對該類物質(zhì)反映程度的大小[48]。

由表6可知，PC1主要反映醇、醛和酮類等指標(biāo)；PC2主要反映的是烴類化合物；PC3主要反映的是酮類化合物。PC1與醇類呈正相關(guān)；PC2與烴類呈正相關(guān)；PC3與酮類呈負(fù)相關(guān)。

表6 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 6 The eigenvectors and loading matrix of the principal components

2.2.2.2 揮發(fā)性成分品質(zhì)評價模型的建立

根據(jù)主成分6類物質(zhì)的特征向量，可以得到各個主成分的得分，分別用Y1、Y2和Y3表示，進(jìn)行揮發(fā)性成分含量的綜合評價，得到精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性成分的線性關(guān)系式分別為：Y1=0.530X1＋0.483 X2＋ 0.438 X3＋ 0.405X4＋0.355 X5-0.068 X6；Y2=-0.067 X1+0.281X2-0.108 X3－ 0.362 X4＋0.414 X5+0.777 X6；Y3=0.063 X1-0.270X2-0.645 X3+0.436 X4+0.558X5-0.080 X6。

6類物質(zhì)的權(quán)重分別為0.582、0.256、0.120。將這6個指標(biāo)分別與權(quán)重相乘，結(jié)果相加得出Y綜合值，建立精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性成分評價模型：F=0.582F1＋ 0.256F2＋ 0.120F3，得到的綜合得分見表7。

由表7可知，20 d的第1主成分得分最高，10 d其次，第2和第3主成分得分最高的均是10 d。由評價模型可得，精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性化合物綜合得分排名依次為 20、10、60、40、30、50 d。所以，反應(yīng)時間為20 d時精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系的揮發(fā)性成分品質(zhì)最好。

表7 標(biāo)準(zhǔn)化后主成分綜合得分Table 7 The comprehensive scores of principal and principal components after standardization

3 結(jié)論

電子鼻結(jié)果與GC-MS的結(jié)果互相映證，得出不同反應(yīng)時間下精氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系樣品揮發(fā)性成分和含量存在差異。PCA可以良好區(qū)分不同反應(yīng)時間的樣品，而LDA僅能較好地區(qū)分30 d和40 d的樣品。利用GC-MS技術(shù)分析了不同反應(yīng)時間揮發(fā)性物質(zhì)的含量與組成，共檢測出50種揮發(fā)性化合物，在10、20、30、40、50 d 和 60 d 中分別檢測到 27、19、23、19、23、18 種化合物，可分為醇類、醛類、酮類、酯類、烷烴類和其它類化合物，其中20 d的揮發(fā)性物質(zhì)含量最高，達(dá)到1 989.1 ng/g。通過PCA建立的揮發(fā)性成分綜合評價模型，得出20 d揮發(fā)性成分含量得分最高。