（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000）

紅棗是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物棗樹（Ziziphus jujuba Mill.）的成熟果實，在我國有著悠久的種植歷史。紅棗中含有多糖、多酚、皂苷、色素、超氧化物歧化酶和各種維生素等活性成分，其中紅棗多糖是紅棗中最重要的活性成分之一[1]。大量研究已經(jīng)證實紅棗多糖具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和促進淋巴細胞增殖等功效[2]。紅棗中多糖提取是紅棗產(chǎn)業(yè)中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。因此，尋找綠色高效提取技術(shù)從紅棗中提取多糖是當(dāng)前研究的熱點。

目前，紅棗多糖提取主要采用傳統(tǒng)的溶劑提取，但該方式存在耗時長、效率低和溶劑消耗量大等問題[3]，已經(jīng)不能滿足當(dāng)前紅棗產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需求。超聲輔助提取作為一種新型的物理提取技術(shù)，利用超聲所產(chǎn)生的“機械效應(yīng)”、“空化效應(yīng)”和“熱效應(yīng)”，加速植物細胞壁的破裂，降低多糖由內(nèi)向外的傳遞阻力，進而有效提高多糖得率[4]。植物細胞壁主要成分為纖維素、半纖維素和果膠，利用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶可以降解植物細胞壁，提高傳質(zhì)和擴散系數(shù)，從而提高多糖得率[5]。因此，利用超聲輔助復(fù)合酶（纖維素酶 ∶果膠酶 ∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，質(zhì)量比）提?。╱ltrasonic assisted complex enzyme extraction，UACEE）紅棗多糖是一種新穎的提取技術(shù)，目前，利用UACEE紅棗多糖的研究鮮見報道。除提取技術(shù)外，紅棗多糖得率還取決于許多其它因素，如萃取溫度、萃取時間、固液比、復(fù)合酶添加量和超聲功率等參數(shù)。因此，優(yōu)化紅棗多糖的提取條件是提高紅棗多糖得率的關(guān)鍵。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法，常被應(yīng)用于提取工藝優(yōu)化，但RSM對試驗點的選擇有很高的要求，如果試驗點選取不當(dāng)，很難得到較為理想的優(yōu)化結(jié)果[6]。遺傳算法（genetic algorithms，GA）具有全局尋優(yōu)的特點，能取得較好的預(yù)測和優(yōu)化效果。將RSM與GA相結(jié)合，既能避免RSM的缺陷，又能充分發(fā)揮GA在全局優(yōu)化中的優(yōu)勢。目前，采用RSM耦合GA法對紅棗多糖的提取條件進行優(yōu)化的研究鮮見報道。

鑒于此，本研究采用UACEE技術(shù)對紅棗多糖進行提取，探究超聲功率、提取溫度、復(fù)合酶添加量、料液比和提取時間對紅棗多糖得率的影響；通過RSM耦合GA優(yōu)化其提取工藝，并對比研究不同提取方式對紅棗多糖得率的影響，以期確定最佳的提取技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗：柳林縣達滋食品有限責(zé)任公司；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99.0%）：河北貞田食品添加劑有限公司；纖維素酶（2 000 U/g）、果膠酶（2 300 U/g）、木瓜蛋白酶（2 300 U/g）：上海金穗生物科技有限公司；苯酚：南京匯景石油化工有限公司；硫酸：杭州法瑪化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YM-1000CT超聲波提取儀：上海豫明儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DK-98-IIA型恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；TG18K-Ⅱ型高速離心機：上海趙迪生物科技有限公司；UV759紫外可見分光光度計：青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司；FA1004分析天平：紹興萬力儀器有限公司；MSC-100恒溫振蕩器：上海利聞科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機：江蘇天翎儀器有限公司；MCT200烘干機：上海爭巧科學(xué)儀器有限公司；JJ-2植物粉碎機：常州市萬豐儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

將新鮮的紅棗用清水沖洗干凈，然后用刀子剔除棗核并切成絲狀，置于60℃干燥機中將其烘干，然后用植物粉碎機將其粉碎，過40目篩，將制得的紅棗粉末密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 UACEE紅棗多糖

稱取（10.00±0.05）g紅棗粉末置于具塞三角瓶中，加入300 mL的蒸餾水，然后加入不同劑量的復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，質(zhì)量比），用玻璃棒攪拌使其充分混合，將其置于超聲提取設(shè)備中，通過儀器控制面板，設(shè)置超聲時間、超聲溫度，待提取結(jié)束后，將提取物置于離心機中以7 000 r/min離心15 min，真空抽濾獲得濾液，殘渣重復(fù)上述操作，合并濾液，濾液在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，取出濃縮液加入無水乙醇，置于4℃冰箱中過夜醇沉，將醇沉物離心，并置于真空冷凍干燥機中凍干，獲得紅棗粗多糖。

1.3.3 顯色反應(yīng)

將質(zhì)量濃度為25 mg/L D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 mL紅棗多糖溶液進行充分混合，置于具塞管中，然后加入1 mL質(zhì)量濃度為5%苯酚溶液及5 mL濃硫酸，置于40℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，待反應(yīng)結(jié)束后，將其置于冰水浴中冷卻，采用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描，樣品最大吸收波長為491 nm。

1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及多糖得率的計算

將D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成質(zhì)量濃度為0、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別取2 mL置于具塞管中，進行顯色反應(yīng)，在491 nm處測定樣品吸光度y，以樣品吸光度y為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，利用Origin9.0軟件進行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.016 1x+0.107 1。

稱取0.1 g紅棗粗多糖，配制成一定濃度的多糖溶液，將其稀釋一定的倍數(shù)，按照1.3.3進行顯色反應(yīng)，測定每個樣品的吸光度，依據(jù)下列公式計算多糖得率。

式中：V為待測樣品的體積，L；ρ為紅棗多糖溶液的質(zhì)量濃度，mg/L；W1為紅棗粉末質(zhì)量，g；W2為紅棗粗多糖質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗

選擇UACEE法作為紅棗多糖的提取方法，操作同1.3.2。以10 g紅棗粉末為提取對象，對超聲功率、提取溫度、復(fù)合酶添加量、料液比和提取時間5個因素進行單因素試驗，討論試驗因素對樣品多糖得率的影響。超聲功率為 100、200、300*、400、500 W，提取溫度為 30、35、40*、45、50℃，復(fù)合酶添加量為 0.2%、0.4%、0.6%*、0.8%、1.0%，料液比為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30*、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），提取時間為 10、20、30*、40、50 min（*代表當(dāng)一個單因素在變化的時候其它單因素的取值）。每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.6 響應(yīng)面法試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以超聲功率（X1）、提取溫度（X2）、復(fù)合酶添加量（X3）和料液比（X4）為自變量，以多糖得率（Y）為響應(yīng)值。根據(jù)Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken試驗設(shè)計原理設(shè)計組合試驗，因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1 試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Experimental design factors and levels

1.3.7 遺傳算法設(shè)計

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取超聲功率（X1）、提取溫度（X2）、復(fù)合酶添加量（X3）和料液比（X4）4 個因素為決策變量，即：

紅棗多糖得率目標(biāo)函數(shù)

式中：f（x）為RSM模型得到的紅棗多糖得率的目標(biāo)函數(shù)；n為自變量個數(shù)；XiL和XiU分別為X的上限和下限。

遺傳算法優(yōu)化的約束條件：選擇各因素水平的上下限，多糖得率最優(yōu)的約束條件如式（7）所示。

1.4 不同提取方式對多糖得率的影響

1.4.1 回流法提取紅棗多糖

稱取10 g紅棗粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸餾水，提取溫度40℃，提取3次，每次提取2 h，其余操作同1.3.2，依據(jù)式（2）計算多糖得率。

1.4.2 超聲輔助法提取紅棗多糖

稱取10 g紅棗粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸餾水，密閉置于超聲提取儀中，提取條件為：超聲功率310 W，提取溫度40℃和提取時間30 min，提取結(jié)束后，其余操作同1.3.2，依據(jù)式（2）計算多糖得率。

1.4.3 復(fù)合酶法提取紅棗多糖

稱取10 g紅棗粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸餾水，提取條件：提取溫度40℃、提取時間30 min、復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，質(zhì)量比）添加量0.49%，提取結(jié)束后，其余操作同1.3.2，依據(jù)式（2）計算多糖得率。

1.4.4 超聲輔助復(fù)合酶提取

稱取10 g紅棗粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸餾水，密閉置于超聲提取儀中，提取條件為：超聲功率310 W，提取溫度40℃、提取時間30 min、復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，質(zhì)量比）添加量0.49%，提取結(jié)束后，其余操作同1.3.2，依據(jù)式（2）計算多糖得率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Statistix8.0軟件對每組試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；采用SAS8.0軟件分析結(jié)果的顯著差異；采用Matlab2015b優(yōu)化UACEE紅棗多糖工藝參數(shù)；利用Origin9.0進行單因素繪圖；Design-Expert 8.0.6設(shè)計組合試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方式對紅棗多糖得率的影響

不同提取方式對紅棗多糖得率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取方式對紅棗多糖得率的影響Fig.1 Effect of different extraction methods on the yield of jujube polysaccharide

由圖1可知，超聲輔助提取、復(fù)合酶提取和超聲輔助復(fù)合酶提取法所得的紅棗多糖得率均顯著高于回流提?。≒<0.05）。結(jié)果表明超聲輔助和酶均具有強化提取多糖的效果。超聲輔助提取和復(fù)合酶提取法所得的紅棗多糖得率無顯著差異（P>0.05）。超聲輔助復(fù)合酶提取法所得的紅棗多糖得率均顯著高于回流提取、超聲輔助提取和復(fù)合酶提取。因此，本試驗采用超聲輔助復(fù)合酶提取法提取紅棗多糖。

2.2 單因素試驗結(jié)果

單因素對紅棗多糖得率的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知，當(dāng)超聲功率在100 W～300 W時，隨著超聲功率增加多糖得率呈顯著增加的趨勢（P<0.05），當(dāng)超聲功率為300 W時，多糖得率取得最大值（7.12±0.10）%。其原因是隨著超聲功率增加，超聲所產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”破壞細胞壁，降低傳質(zhì)阻力，提高多糖的擴散系數(shù)和溶解速度，有利于多糖的提取[7]。當(dāng)超聲功率超過300 W，多糖得率隨超聲功率增加而呈顯著降低的趨勢（P<0.05）。其原因是較大的超聲功率會增加雜質(zhì)溶解度，并有可能破壞多糖結(jié)構(gòu)，造成多糖得率降低[8]。該研究結(jié)果與Babamoradi等[9]研究超聲輔助提取毛茛花多糖結(jié)果一致。綜合考慮，本試驗選擇超聲功率為200、300、400 W 3個水平進行后續(xù)試驗。

圖2 不同試驗因素對紅棗多糖得率的影響Fig.2 Effect of different experimental factors on the yield of jujube polysaccharide

由圖2B可知，當(dāng)提取溫度低于40℃時，多糖得率隨提取溫度升高呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P<0.05），在提取溫度40℃時，多糖得率取得最大值（7.11±0.12）%。這是由于隨溫度升高，溶劑滲透速度增加，分子運動加快，使得多糖溶解度增加[10]；此外，升高的溫度有利于復(fù)合酶發(fā)揮催化活性，破壞植物細胞壁，有利于多糖從細胞內(nèi)溶出，增加多糖得率[11]。但當(dāng)提取溫度超過40℃，隨提取溫度升高多糖得率反而顯著降低（P<0.05）。其原因一方面是高溫影響多糖穩(wěn)定性，易造成多糖糖鏈的降解。另一方面高溫會使復(fù)合酶活性降低或失活，從而不利于多糖提取[12]。綜合考慮，本試驗選擇提取溫度為30、35、40℃3個水平進行后續(xù)試驗。

由圖2C可知，當(dāng)復(fù)合酶添加量在0.2%～0.6%時，隨復(fù)合酶添加量增加多糖得率呈顯著增加的趨勢（P<0.05），在復(fù)合酶添加量0.6%時，多糖得率取得最大值（6.97±0.11）%。這是由于隨復(fù)合酶添加量增加，酶的催化活性增強，使得植物細胞壁發(fā)生不同程度的降解，多糖傳質(zhì)阻力顯著降低，擴散系數(shù)增加，進而多糖得率增加[13]。當(dāng)復(fù)合酶添加量超過0.6%時，多糖得率隨復(fù)合酶添加量增加反而顯著降低（P<0.05）。該研究結(jié)果與Yin等[14]采用酶輔助提取蘑菇多糖結(jié)果一致。綜合考慮，復(fù)合酶添加量選擇0.4%、0.6%和0.8%3個水平進行后續(xù)試驗。

由圖2D可知，隨溶劑體積的增加多糖得率呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低的趨勢（P<0.05），當(dāng)料液比在1∶30（g/mL）時，多糖得率取得最大值（7.25±0.08）%。其原因是隨溶劑增加，固液界面的濃度梯度增加，濃度梯度作為多糖由內(nèi)向外的傳質(zhì)驅(qū)動力，驅(qū)動多糖擴散，使得多糖得率增加[15]。但如果溶劑過多，會造成大量雜質(zhì)溶解；還增加后期分離純化的成本[16]。綜上考慮，料液比選擇 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）3 個水平進行后續(xù)試驗。

由圖2E可知，當(dāng)提取時間在10 min～30 min時，多糖得率隨提取時間延長呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P<0.05）。其原因是在提取初期，超聲“空化效應(yīng)”促進多糖由內(nèi)向外擴散，增加多糖得率[17]。但當(dāng)提取時間超過30 min時，由于大多數(shù)多糖已經(jīng)被溶出，故延長萃取時間多糖得率無顯著變化（P>0.05）。綜合考慮，本研究選擇提取時間為30 min，后續(xù)不再進行優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)曲面法試驗結(jié)果

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗

通過響應(yīng)面法優(yōu)化UACEE紅棗多糖的工藝，所得的試驗方案和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

以多糖得率（Y）為響應(yīng)值，對試驗所得的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到紅棗多糖得率對超聲功率（X1）、提取溫度（X2）、復(fù)合酶添加量（X3）和料液比（X4）的回歸模型如式（8）所示。

對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

表3 紅棗多糖工藝優(yōu)化回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Significance test of regression model coefficient of jujube polysaccharide process optimization

由表3可知，數(shù)學(xué)模型決定系數(shù)R2=0.902 8，F(xiàn)=9.27，P<0.000 1。結(jié)果表明通過RSM建立的數(shù)學(xué)模型極顯著。該模型失擬項P=0.998 4>0.05，表明模型失擬項不顯著。通過以上數(shù)據(jù)分析表明通過RSM所建立的數(shù)學(xué)模型對試驗數(shù)據(jù)擬合充分，可靠性較好。

利用F值大小可以判斷試驗因素對響應(yīng)值的影響程度，F(xiàn)值越大，說明該因素對響應(yīng)值的影響越顯著。由表 3 可知，F(xiàn)（X1）=1.44、F（X2）=34.18、F（X3）=12.15和F（X4）=4.89，即各試驗因素對紅棗多糖得率的影響順序為提取溫度（X2）>復(fù)合酶添加量（X3）>料液比（X4）>超聲功率（X1），且提取溫度和復(fù)合酶添加量與料液比和超聲功率均對紅棗多糖得率的影響達到極顯著水平。

模型充分性檢驗圖見圖3。

圖3 模型充分性檢驗圖Fig.3 Model adequacy test plot

由圖3A可知，通過試驗測定的多糖得率的真實值與RSM模型預(yù)測的多糖得率值基本一致，結(jié)果表明可以通過RSM模型來預(yù)測不同提取條件下多糖得率。由圖3B可知，在本試驗中所得的多糖得率試驗值均遵循正態(tài)分布，且沒有偏離方差。由圖3C可知，所有試驗點的學(xué)生化外殘差范圍均在±3范圍內(nèi)。此外，由圖3D可知，模型中的Cook′s距離均在1.0范圍之內(nèi)。結(jié)果表明在試驗條件下所得多糖得率沒有異常值。綜上進一步驗證采用RSM模型預(yù)測不同提取條件下多糖得率是準(zhǔn)確可靠的。在此基礎(chǔ)上，進一步采用遺傳算法優(yōu)化UACEE紅棗多糖是合理可行的。

2.3.2 交互項分析

利用等高線圖形來判斷因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度是否顯著。當(dāng)?shù)雀呔€圖形為橢圓時，代表因素交互作用顯著影響響應(yīng)值變化[18]；當(dāng)?shù)雀呔€圖形為圓形時，代表因素交互作用對響應(yīng)值變化無顯著影響[19]。圖4反應(yīng)各試驗因素交互作用對紅棗多糖得率的影響。

圖4 各試驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

由表 3 方差分析結(jié)果可知，X1X2、X1X3、X2X4和X3X4的交互作用均對紅棗多糖得率無顯著影響（P>0.05），故在此不做分析。X1X4和X2X3的交互作用均能顯著影響紅棗多糖得率（P<0.05）。由圖4可知，紅棗多糖得率均隨超聲功率、提取溫度、復(fù)合酶添加量及料液比增加呈現(xiàn)顯著增加的趨勢，交互作用結(jié)果與單因素試驗結(jié)果一致，且多糖得率均在中心處存在極值點。圖4的等高線均呈橢圓型，表明X1X4和X2X3的交互作用均顯著影響紅棗多糖得率。綜上可知，對紅棗多糖得率影響因素順序為提取溫度（X2）>復(fù)合酶添加量（X3）>料液比（X4）>超聲功率（X1），該結(jié)果也與方差分析的結(jié)果一致。

2.3.3 紅棗多糖提取工藝參數(shù)優(yōu)化

利用Matlab R2018b軟件中的遺傳算法優(yōu)化工具箱進行分析優(yōu)化，迭代75次，紅棗多糖得率取得最大值，此時超聲功率（X1）、提取溫度（X2）、復(fù)合酶添加量（X3）和料液比（X4）水平編碼分別為 0.081、1、-0.282、0.199，即試驗水平分別為308.1 W、40℃、0.487 2%和 1∶31.99（g/mL），在此條件下，所得紅棗多糖得率理論值為7.45%。遺傳算法M文件運行結(jié)果如圖5所示。

圖5 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果Fig.5 The results optimized by the genetic algorithm

2.3.4 驗證試驗

采用遺傳算法優(yōu)化紅棗多糖得率工藝參數(shù)為：超聲功率308.1W、提取溫度40℃、復(fù)合酶添加量0.4872%和料液比1∶31.99（g/mL），所得紅棗多糖得率的理論值為7.45%。為驗證遺傳算法的可靠性，結(jié)合實際情況，將上述工藝參數(shù)修正為：超聲功率308 W、提取溫度40℃、復(fù)合酶添加量0.49%和料液比1∶32（g/mL），按照上述因素水平進行3次重復(fù)試驗，所得紅棗多糖得率為（7.68±0.01）%，試驗值和理論值的相對誤差為3.09%。說明響應(yīng)面耦合遺傳算法可較好地模擬和預(yù)測紅棗多糖得率，進一步證明利用該方法優(yōu)化UACEE紅棗多糖工藝參數(shù)是可行的。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面耦合遺傳算法優(yōu)化超聲輔助復(fù)合酶提取紅棗多糖工藝，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲功率308 W、提取溫度40℃、復(fù)合酶添加量0.49%、料液比1∶32（g/mL）和提取時間30 min，在此條件下，所得紅棗多糖得率為（7.68±0.01）%。試驗值和理論值的相對誤差為3.09%。表明響應(yīng)面耦合遺傳算法可較好地模擬和預(yù)測紅棗多糖得率，且優(yōu)化工藝參數(shù)是可行的。研究結(jié)果為紅棗多糖提取提供一種綠色高效的提取方法。