李陽，朱晨輝，范代娣

（1 陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點實驗室，西北大學化工學院，陜西西安710069；2 陜西省生物材料與發(fā)酵工程技術研究中心,西北大學化工學院，陜西西安710069；3 西北大學生物醫(yī)藥研究院，陜西西安710069）

膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)，存在于皮膚、軟骨、肌腱等中[1-2]，占體內(nèi)所有蛋白的30%[3-5]，其三維螺旋結構為人體提供結構支持以及調(diào)控局部的生物響應，在組織和器官的形成中扮演極其重要的角色。膠原蛋白以其優(yōu)異的生物相容性、可降解性和安全性廣泛應用在生物醫(yī)藥及組織工程領域，如藥物基因傳送系統(tǒng)[6]、細胞培養(yǎng)[7-8]、人工血管[9]、肌腱，骨[10-11]、皮膚支架[12]、止血材料[13]等。但是，從動物組織提取的膠原蛋白成分復雜且單體分離較難，還可能攜帶病毒存在安全隱患，產(chǎn)量較低不能滿足人們對膠原蛋白的巨大需求。此外，從動物組織提取膠原蛋白不符合倫理道德，且有可能觸犯法律[14]。

功能蛋白作為一種活性、功能材料廣泛應用于國防、醫(yī)藥研究等領域，關系國家安全、民生等問題，成為《中國制造2025》的重點領域。針對從動物組織提取的膠原蛋白來源受限、原料批次不均一、目標蛋白難分離、再加工困難等問題，生物綠色制造可獲得單一組分、并具有定向可控等優(yōu)勢，是理想的制造途徑。將膠原蛋白的DNA 序列轉(zhuǎn)入不同宿主（微生物、動物、植物）通過發(fā)酵、分離純化獲得重組膠原蛋白（圖1）。植物細胞構建體系中，Shoseyov 等[15]通過煙草發(fā)酵合成重組人源Ⅰ型膠原蛋白，Wang 等[16]通過轉(zhuǎn)基因玉米發(fā)酵合成重組人Ⅰ型膠原蛋白α1，Glatz 等[17]通過玉米發(fā)酵重組人Ⅰ型膠原蛋白α1。動物細胞構建體系中，Platenburg 等[18]通過小鼠乳腺細胞發(fā)酵合成重組人源Ⅰ型膠原蛋白，Tomita 等[19]通過蠶中部絲腺發(fā)酵合成人Ⅰ型膠原蛋白α1。微生物體系中，Olsen等[20]通過畢赤酵母發(fā)酵合成人源型明膠，Hennet等[21]通過大腸桿菌發(fā)酵合成羥基化重組膠原蛋白。范代娣團隊[25]通過大腸桿菌發(fā)酵表達類人膠原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[22-24]以及全長重組膠原蛋白，通過酵母表達體系發(fā)酵重組人Ⅰ及Ⅲ型膠原α1 鏈蛋白[26-27]。微生物發(fā)酵體系成本低、周期短、培養(yǎng)較容易、更易于商業(yè)化生產(chǎn)，而動植物體系培養(yǎng)基昂貴、培養(yǎng)難度大、周期長，很難商業(yè)化生產(chǎn)，目前只限于實驗室規(guī)模。因此，國內(nèi)外對于重組蛋白的研究更多集中在微生物體系。

圖1 綠色生物制造過程

重組膠原蛋白的合成過程主要包括表達體系的構建、發(fā)酵以及純化三個過程。體系構建中，將目的基因和載體連接后導入到不同的宿主細胞內(nèi)，包括微生物、動物和植物內(nèi)，再進行發(fā)酵誘導表達重組膠原蛋白。

1 重組膠原蛋白的綠色制造

1.1 重組膠原蛋白發(fā)酵中不同表達體系的構建

1.1.1 微生物表達體系的構建

（1）大腸桿菌表達體系的構建 大腸桿菌是基因工程技術生產(chǎn)重組蛋白的主要表達系統(tǒng)，盡管其他表達系統(tǒng)也得到一定發(fā)展，但因其生長周期短、生產(chǎn)成本低，大腸桿菌表達仍然占臨床使用中醫(yī)用重組蛋白（＞400）的40%[28]。Bentley 等[29]將脂蛋白表達在大腸桿菌中生產(chǎn)重組蛋白，并探討了生產(chǎn)重組蛋白過程中的工藝條件，為萊姆病的治療提供了可能。大腸桿菌表達重組膠原蛋白是指將設計好的膠原蛋白目的基因及載體導入大腸桿菌內(nèi)誘導表達目的蛋白，常見的載體包括pGE、pET 系列。Rutschmann等[21]在大腸桿菌中表達了羥化重組Ⅲ型類人膠原蛋白，獲得的重組蛋白具有良好的生物相容性，可以促進臍內(nèi)皮細胞的生長。張珊珊[30]表達重組細菌膠原蛋白VCL，該重組膠原蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達（0.1～0.12g/L），且無免疫原性、無細胞毒性，可以有效促進骨缺損，成為一種潛在的生物材料。王皓[31]利用基因工程構建重組膠原蛋白，表達量為34.2%，具有優(yōu)異的抗氧化活性，對羥基自由基以及超氧陰離子有很好的清除能力。范代娣課題組表達的利用大腸桿菌發(fā)酵獲得的重組類人膠原蛋白[32]和膠原蛋白相比具有組分單一、過程可控、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)物可控、無病毒隱患等特征（見表1），并將其應用于人工血管[33]、止血材料[34]、皮膚創(chuàng)傷修復[35]等醫(yī)學領域，同時通過大腸桿菌表達全長重組膠原蛋白α1鏈[25]。

表1 天然膠原蛋白與重組類人膠原蛋白的對比[32]

（2）酵母表達體系的構建 大腸桿菌原核表達缺乏真核翻譯后系統(tǒng)，過量表達的動物蛋白的不溶性，胞內(nèi)表達較難純化等不足促進了酵母、動植物等表達系統(tǒng)的發(fā)展。酵母表達因其成本較低、易高細胞密度發(fā)酵、不產(chǎn)生內(nèi)毒素而簡化了純化及滅菌過程等受到研究者的關注[36]，上百種原核生物、真核生物以及病毒中的蛋白已成功在酵母中表達[37-38]。Xi 等[39]在畢赤酵母中成功表達了雞Ⅱ型膠原蛋白。Kivirikko 等[40]在畢赤酵母菌中成功高效表達了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型重組膠原蛋白，獲得的重組蛋白具有穩(wěn)定的結構及熱力學穩(wěn)定性。Toman 等[41]在酵母中表達Ⅰ型重組膠原蛋白。徐立群[42]表達了重組Ⅵ型膠原蛋白，為其活性功能的探討及其生產(chǎn)奠定基礎。劉斌[43]以人膠原蛋白為模板，在酵母細胞中表達類人膠原蛋白，最高表達量達3.81g/L。范代娣課題組[27]實現(xiàn)了人Ⅲ型膠原α1 鏈蛋白和羥脯氨酸的高效表達。

1.1.2 植物表達體系的構建

植物作為宿主被用于表達膠原蛋白時，無動物病原體，易于結合外源基因[44]。植物發(fā)酵中，主要以轉(zhuǎn)基因煙草和玉米為宿主表達重組膠原蛋白。Wang 等[16]在玉米中表達了羥基化重組人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈。Zhang等[45]在玉米中表達了重組人Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將合成的載體導入玉米幼胚中，然后進行再生，獲得轉(zhuǎn)基因植株。Theisen 等[46]在煙草中表達了羥化人Ⅰ型膠原蛋白。Makinen 等[47]在以大麥種子為宿主表達了重組全長Ⅰ型α1 膠原蛋白以及45-kDa 的膠原蛋白片段。

1.1.3 動物表達體系的構建

動物細胞主要以小鼠及蠶為宿主表達重組膠原蛋白。Bulleid等[48]在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中表達了完全羥基化的重組膠原蛋白。Toman 等[18]在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺內(nèi)成功表達了人Ⅰ型原膠原同源三聚體，表達量高達8mg/mL。Qi 等[49]在幼蠶中構建多基因表達系統(tǒng)合成了人Ⅱ型膠原蛋白，從每個幼蠶皮膚中可純化出1mg 具有活性的重組膠原蛋白。Yoshizato等[50]在蠶繭中表達了重組人Ⅲ型膠原蛋白。

不同表達體系有不同的優(yōu)缺點（見表2），動植物體系，發(fā)酵培養(yǎng)及純化成本較高，且產(chǎn)量較低，不適宜于大規(guī)模生產(chǎn)，目前僅限于實驗室水平。相比較而言，微生物體系培養(yǎng)成本較低，遺傳背景清晰，可操作性強，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。

表2 不同表達體系的優(yōu)缺點

1.2 微生物表達體系的發(fā)酵調(diào)控

動植物表達重組膠原蛋白因培養(yǎng)難度大、成本較高且表達量較低等原因目前僅限于實驗室規(guī)模生產(chǎn)，因此一般都選擇微生物進行發(fā)酵表達重組膠原蛋白。下文綜述討論了大腸桿菌和酵母兩種微生物體系的發(fā)酵和純化工藝。

1.2.1 大腸桿菌表達體系的發(fā)酵調(diào)控

高密度發(fā)酵水平?jīng)Q定了重組膠原蛋白的產(chǎn)量，通過多尺度發(fā)酵工藝優(yōu)化與放大研究，探索蛋白質(zhì)細胞工廠的高密度發(fā)酵工程控制策略，從而明晰影響過程放大的關鍵因素與變量，揭示規(guī)模生產(chǎn)條件下重組蛋白的高效轉(zhuǎn)化機制與調(diào)控規(guī)律，實現(xiàn)高生物量下的高目標產(chǎn)物表達。

魏瑋[51]探討了pH、溫度和溶解氧對大腸桿菌發(fā)酵蛋白表達量的影響，不同pH、溫度和溶解氧對蛋白表達量的影響較大，因此在發(fā)酵過程中要調(diào)控各個參數(shù)到最優(yōu)。在大腸桿菌高密度表達中，穩(wěn)定的pH 是使菌體保持最佳生長狀態(tài)的必要條件，外界pH會影響菌體的胞內(nèi)pH，從而影響細菌的代謝反應，因此發(fā)酵過程中pH 的改變會影響細胞的生物量以及重組膠原蛋白的合成，當pH為6.5時，外源蛋白含量最高，達到33.31%。溫度是影響大腸桿菌生長以及誘導重組蛋白表達的最主要因素之一，因為任何生物化學的酶促反應都與溫度變化密切相關。隨著培養(yǎng)溫度的下降，菌體濃度（OD600）小幅降低，但膠原蛋白表達量明顯升高，30℃時外源蛋白表達率高達30.5%。這歸因于在誘導后低溫培養(yǎng)降低了菌體比生長速率，更多的營養(yǎng)源用來合成目的蛋白；低于30℃時重組蛋白表達率也隨之降低，可能由于培養(yǎng)溫度過低，嚴重抑制菌體比生長速率，導致菌體密度過小而降低蛋白表達。溶解氧（DO）是發(fā)酵過程中影響菌體生長的另一重要因素，DO 過高或過低都會影響大腸肝菌的代謝和目的蛋白的表達。DO分別為10%、20%、30%和40%時，OD600分別為27.6、37.32、40.72和41，膠原蛋白表達量分別為16.90%、28.4%、33.28%和33.1%，當DO 為40%時，菌體會過早地到達平穩(wěn)期從而導致蛋白表達期過短，影響膠原蛋白的合成。DO 為10%時，菌體呼吸強度偏弱，容易進入?yún)捬醮x途徑積累有機酸，因此最適DO 為30%。因此，pH、溫度以及溶解氧是影響重組膠原蛋白表達量以及菌體生長的重要因素，過高或過低均不利于發(fā)酵產(chǎn)物的表達，在微生物大腸桿菌表達體系發(fā)酵調(diào)控過程中，需選取適宜的pH、溫度以及溶解氧參數(shù)。

葡萄糖和氮源濃度是大腸桿菌細胞發(fā)酵過程必不可少的兩部分，魏瑋[51]以葡萄糖為碳源，有機氮源和無機氮源為混合氮源，考察不同濃度下菌體生長和膠原蛋白表達情況。葡萄糖濃度和氮濃度對菌體生長和膠原蛋白表達量的影響是顯著的，葡萄糖濃度為10g/L 時，重組菌的細胞密度和蛋白表達量分別達到4.5 和15.55%。蛋白胨作為有機氮源時，在濃度為15g/L 時，細胞密度達到最大值4.62，但是蛋白表達率在蛋白胨濃度為10g/L 時已經(jīng)達到峰值（15.97%），因此混合氮源為10～15g/L時，細胞密度和蛋白表達量均達到最高。葡萄糖和氮作為兩種營養(yǎng)源直接影響細菌生長狀態(tài)以及蛋白表達量，因此需要尋找合適的葡萄糖濃度以及氮源濃度。

乙酸是大腸桿菌發(fā)酵過程的副產(chǎn)物，會抑制細胞生長和膠原蛋白生成，因此需要不斷從培養(yǎng)液中移去乙酸，但是乙酸去除過程也伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的損失。事實上，乙酸被部分氧化代謝，屬于一種潛在的碳源和能源，因此使大腸桿菌同化乙酸來控制乙酸含量是一種可行新穎的方法。通過切斷糖供應使其處于饑餓狀態(tài)可以有效地避免乙酸積累。如圖2所示，在分批培養(yǎng)結束后、分批補料培養(yǎng)誘導前和誘導后三個階段不同階段斷糖使饑餓，細胞干重、蛋白濃度和乙酸濃度都是不同的，研究結果表明，在誘導后糖饑餓，蛋白濃度最低（1.5g/L），細胞干重也較低，而在誘導前斷糖，蛋白濃度（13.2g/L）和細胞干重均最大，乙酸濃度最低[52]。因此，選擇合適的時間糖饑餓可以有效地控制重組蛋白表達量。

圖2 不同時間糖饑餓對大腸桿菌發(fā)酵的影響［52］

CO2對許多好氧和厭氧發(fā)酵過程都有重要影響，微生物代謝產(chǎn)生的CO2對于微生物細胞自身的生長和生產(chǎn)都可能起到抑制或促進作用。為了研究CO2對大腸桿菌表達重組膠原蛋白培養(yǎng)系統(tǒng)的影響，對大腸桿菌細胞采用CO2脈沖注入的方法進行分批補料培養(yǎng)。通過在細胞生長不同階段，注入不同濃度的CO2脈沖，考察對細胞生長和表達的影響。當在分批培養(yǎng)階段引入CO2脈沖時，對細胞生長有明顯的抑制作用，當在分批補料培養(yǎng)階段引入CO2脈沖時，對細胞生長有輕微的促進作用，只有在表達階段引入CO2脈沖時對表達有抑制作用（16g/L），而其他階段引入CO2的脈沖則對表達基本無影響[53]。因此，在微生物發(fā)酵調(diào)控中，CO2濃度以及注入時段均影響著發(fā)酵產(chǎn)物的表達以及菌體的生長。

經(jīng)過探討，認為溫度、pH、溶解氧、葡萄糖和氮源對于蛋白表達量最為重要，乙酸濃度和葡萄糖濃度相關，CO2和溶解氧相關，亦會間接影響蛋白表達量。

1.2.2 酵母表達體系的發(fā)酵調(diào)控

畢赤酵母表達系統(tǒng)是近些年發(fā)展起來的一種真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母生長快，分子遺傳學操作較為容易。其細胞內(nèi)的過氧化物酶體中含有甲醇代謝途徑的必需酶，其中，醇氧化酶基因的啟動子具有強誘導性和強啟動性，可有效調(diào)控外源基因的高效表達。畢赤酵母具有強烈的好氧生長偏愛性，因此可進行細胞高密度培養(yǎng)，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。此外，其分泌表達外源蛋白，發(fā)酵產(chǎn)物的累積不會對其產(chǎn)生毒副作用，純化也更為方便。因此，畢赤酵母在重組技術中被廣泛使用。

郭紅麗[54]探討了畢赤酵母發(fā)酵類人膠原蛋白的影響因素，甲醇添加量、初始pH 以及溫度均是影響重組類人膠原蛋白表達量的關鍵因素。當pH 為4.69，誘導溫度為28.23℃，甲醇添加量為2.13%/24h 時，類人膠原蛋白表達量最大，理論值為27.84mg/L。

甲醇做碳源時可誘導畢赤酵母表達外源基因，但甲醇流加不足或過量都會影響到畢赤酵母表達外源蛋白的水平，高濃度的甲醇抑制細胞的生長和產(chǎn)物表達，因此控制甲醇流加是提高外源蛋白表達量的關鍵，通常根據(jù)溶氧控制甲醇流加。但如果某一時刻甲醇流加過量導致細胞的生長受到抑制，菌體的耗氧速率下降，誤以為是甲醇濃度較低，從而增大流加速率使甲醇濃度越來越高，因此利用溶氧控制畢赤酵母發(fā)酵過程中甲醇的流加不是一種有效的方法。范代娣課題組[55]探討了甲醇和甘油混合流加的方法對蛋白表達的影響。當甘油/甲醇比變化時，膠原蛋白的最大表達量是不一樣的，且隨著甘油/甲醇比的增加，不同誘導時間的表達量是不一樣的，最終的蛋白表達量高達508.46mg/L。

微生物發(fā)酵過程中，pH、DO等參數(shù)反映碳源的消耗情況。當碳源消耗完，DO 會上升，如果再加入碳源，由于微生物利用碳源消耗氧，使DO下降。利用這個原理可根據(jù)DO的變化控制畢赤酵母發(fā)酵過程中甲醇的流加。梁鑫課題組[56]探討了在畢赤酵母發(fā)酵中甲醇濃度對重組人Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，當甲醇體積分數(shù)增加到0.4%時，重組膠原蛋白出現(xiàn)大量降解，菌體量也出現(xiàn)下降，甲醇體積分數(shù)為0.2%時，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達量達到最大值（8g/L），菌體量也達到0.45g/mL，該結果證明畢赤酵母表達重組人Ⅲ型膠原蛋白時需要補充大量的甲醇碳源，但甲醇濃度不能大于0.4%。

在酵母高密度發(fā)酵體系中，溫度、pH、溶解氧仍然是影響蛋白表達量的關鍵因素。楊樹林和范代娣課題組均研究證明了影響發(fā)酵的關鍵因素為溫度，初始誘導pH和甲醇添加量[57]。圖3展示了影響酵母發(fā)酵因素的響應面探討。根據(jù)優(yōu)化后的發(fā)酵條件，實際取誘導溫度28.22℃，誘導初始pH 為4.98，甲醇添加量1.35%/24h，其他條件不變，試驗重復三次，得到重組人Ⅲ型膠原α1 鏈蛋白表達量的實際平均值為508.46mg/L。

在酵母發(fā)酵過程中，甲醇誘導階段甲醇作為營養(yǎng)源的添加量是影響目的蛋白表達量的重要因素。同時，溫度、pH 和溶解氧均直接影響膠原蛋白的表達量以及菌體濃度。因此，為了使重組膠原蛋白表達量最大化，需精確調(diào)控甲醇含量、溫度、pH以及溶解氧各個參數(shù)到最優(yōu)值。

1.3 微生物表達體系中產(chǎn)物的分離純化

圖3 pH、溫度及甲醇含量對畢赤酵母發(fā)酵重組人Ⅲ型膠原α1鏈蛋白的的影響［57］

經(jīng)微生物表達體系高密度發(fā)酵之后，發(fā)酵產(chǎn)物為細胞、胞外和胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、殘存底物及惰性組分組成的混合體，為了獲得較純的膠原蛋白需要對發(fā)酵產(chǎn)物進行提取純化。大腸桿菌發(fā)酵中，重組蛋白表達在胞內(nèi)，因此為了獲得純膠原蛋白首先需要將細胞破碎使胞內(nèi)物質(zhì)釋放，再進行上清液的處理。而酵母發(fā)酵中，重組膠原蛋白有可能是胞內(nèi)表達，也有可能是分泌表達。分泌表達時目的蛋白存在于發(fā)酵液中，因此直接對發(fā)酵液上清進行處理。圖4展示了重組蛋白的分離純化流程圖。常見的純化方法有粗純和精純兩種，粗純一般根據(jù)分子大小、溶解度和等電點差別進行分離，如透析、超濾、鹽沉、有機溶劑沉淀等方法進行濃縮脫鹽，而精純一般根據(jù)目標蛋白的電荷性質(zhì)和等電點及配體特性進行分析，一般用到各種層析方法，例如離子交換層析、親和層析和凝膠過濾層析等等，使目標產(chǎn)物純度和回收率都能達到最佳水平。

1.3.1 細胞破碎

常見的細胞破碎方法有高壓勻漿法，超聲破碎法以及酶溶法。范代娣課題組比較了這三種方法[58]，如表3 所示。從表3 可看出，高壓勻漿法細胞破碎率最高，膠原蛋白釋放率最高，而且當達到一定破碎率所需的時間最少。酶溶法中，膠原蛋白釋放量在三者之間居中，但是酶價格比較昂貴，且對后面的進一步分離純化會帶來麻煩。綜合考慮選用高壓勻漿法進行細胞破碎。

圖4 微生物表達重組膠原蛋白純化流程

表3 不同細胞破碎方法的比較[58]

1.3.2 粗純

（1）鹽析 鹽沉淀法是最常用的蛋白沉淀方法，其原理是利用鹽離子的水化作用使蛋白表面的水化層破壞，疏水區(qū)暴露，蛋白由于疏水作用而發(fā)生沉淀。不同的蛋白在不同鹽濃度下析出，因而可以通過緩慢改變鹽的濃度使不同的蛋白分級沉淀，達到分離純化的目的[59]。在重組膠原蛋白鹽沉淀方法中，最常用于沉淀的鹽是硫酸銨，其優(yōu)點是價格便宜、溶解度大、溫度影響小、對蛋白的活性影響小。在酵母表達中，經(jīng)常用到硫酸銨沉淀，而且目標蛋白儲存在硫酸銨里，會抑制細菌生長以及保持蛋白酶的活性[60]。利用硫酸銨鹽析可以從重組酵母的發(fā)酵液上清中初步分離純化出重組膠原蛋白的粗品，在硫酸銨一定飽和度的范圍進行鹽析得到的粗品含有大部分目標蛋白且純度較高，有利于后續(xù)的精純化。范代娣課題組[57]通過硫酸銨分級沉淀粗純重組人Ⅲ型膠原α 1鏈蛋白，20%硫酸銨分級沉淀效果最好，可以把分子量大于4.5×104的蛋白沉淀下來，而分子量小于4.5×104的蛋白則存在于上清中，同時可以看出目的蛋白損失率較小。造成這種現(xiàn)象的原因可能是，在硫酸銨分級沉淀的攪拌過程中，分子量大于4.5×104的蛋白疏水性較強，多肽鏈間原來無規(guī)則卷曲的結構逐步折疊成一定規(guī)則的結構，疏水基團暴露出來，而親水基團被包裹在蛋白內(nèi)部，因此蛋白聚集而沉淀。在動植物發(fā)酵體系中也常利用硫酸銨沉淀純化蛋白質(zhì)[61-62]。

NaCl 鹽析沉淀也是常見的沉淀法，動植物體內(nèi)表達重組蛋白時經(jīng)常用到NaCl。在微生物發(fā)酵體系中，范代娣課題組[58]在沉淀重組膠原蛋白時，利用其在偏酸性溶液中穩(wěn)定存在，而其他雜質(zhì)蛋白會在較低pH 中沉淀的原理，采用低濃度的中性鹽增加膠原蛋白的溶解度使其擴散得更加均勻從而提高分離效果。

（2）有機溶劑沉淀 有機沉淀法是利用有機溶劑降低水活度，破壞蛋白表面水化膜從而引起蛋白的沉淀，該方法的優(yōu)點是有機溶劑易分離，能使蛋白快速脫鹽與濃縮，但是容易升溫造成蛋白變性，因此需要在低溫下操作[59]。有機溶劑沉淀中常用到乙醇、甲醇和丙酮沉淀。高立虎[63]采用丙酮分級沉淀純化重組膠原蛋白。相比較而言，硫酸按鹽析法具有更高的純度，有利于下一步的精純化，而丙酮沉淀具有更高的回收率，有利于重組酵母生產(chǎn)的類人膠原蛋白的充分回收。

（3）超濾 超濾是膜分離技術的一種，以壓力差為推動力，利用多孔膜的攔截能力，通過物理截留將溶液中的大小不同的物質(zhì)顆粒分開，從而達到純化和濃縮、篩分溶液中不同組分的目的。范代娣課題組[58]探討了超濾對于重組膠原蛋白的影響，將鹽析沉淀獲得的粗蛋白，利用pH為6.0的0.1mol/L的PBS溶液對其進行溶解，充分溶解后使用一定分子量的超濾膜對粗蛋白溶液進行濃縮處理，同時可以起到除鹽的功效。

1.3.3 精純

（1）離子交換層析 離子交換層析是常用的層析方法之一，它以離子交換劑為固定相，液體為流動相。此方法廣泛應用于很多生化物質(zhì)的分析、制備及純化過程。在使用離子交換劑進行蛋白質(zhì)的純化時，可以選擇利用離子交換劑吸附目標蛋白或者吸附其他雜蛋白。若吸附目標蛋白則需要在吸附后進行洗脫，若吸附雜蛋白則不需要進行洗脫。范代娣課題組[58]按照以下步驟對重組類人膠原蛋白進行純化。利用CM sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂層析對重組人Ⅲ型膠原α1 鏈蛋白進行純化，層析洗脫效果如圖5(a)所示[57]，對流穿峰和洗脫峰對應的蛋白收集進行SDS-PAGE 電泳，如圖5(b)所示。CM sepharose Fast Flow 對目的蛋白純化效果很好，流穿峰1和流穿峰2均為一些分子量低于目的蛋白的粗蛋白，且目的蛋白基本上無損失，洗脫峰1對應的目的蛋白為單一條帶（箭頭所指方向），證明目的蛋白得到了進一步的純化。

圖5 CM sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂柱層析梯度洗脫曲線［57］

（2）凝膠過濾層析 離子交換層析對蛋白質(zhì)的分辨率不高，只適合于初分離，若需提高其分離度還需要用到凝膠過濾層析。用NaCl 溶液溶解離子交換后的樣品，用去離子水進行洗脫，每管收集洗脫液，在一定波長下檢測洗脫液的吸光度，對各個峰的洗脫液進行SDS-PAGE電泳，確定目標蛋白所在峰位置。收集波峰對應的蛋白置于-80℃預凍，再放入真空冷凍干燥機內(nèi)獲得目標產(chǎn)物的純品。徐立群[42]利用凝膠過濾色譜對畢赤酵母發(fā)酵的類人膠原蛋白進行純化，將發(fā)酵菌液經(jīng)過離心后收集上清，用0.45μm 微孔濾膜過濾，而后通過凝膠過濾色譜Sephadex G75將目的蛋白進行純化，經(jīng)凝膠成像儀分析軟件分析，重組蛋白純度達到90%以上。劉斌[43]采用Sephadex G100 凝膠過濾層析，得到重組人源膠原蛋白二聚體，回收率達93.6%，純度達到95.5%。此方案工藝簡單，處理量大，是一種較為理想的重組人源膠原蛋白分離純化方法。李林波[57]利用凝膠過濾色譜純化重組人Ⅲ型膠原α1 鏈蛋白，目的蛋白最終純度為94.6%，回收率達到71.8%。

（3）疏水層析 疏水層析是利用蛋白分子的疏水性不同進行蛋白的純化。疏水層析的填料由化學性質(zhì)穩(wěn)定、機械強度好的載體（瓊脂糖、硅膠等）和疏水配基（C6、C8等）。蛋白質(zhì)表面存在著一些疏水區(qū)域，借助于疏水區(qū)域和疏水配基之間的疏水相互作用力使膠原蛋白吸附在色譜填料的表面，這種相互作用力包括疏水相互作用力、范德華力和靜電相互作用力。因為在高鹽濃度下疏水相互作用力為主導，隨著鹽濃度的降低，疏水相疏水相互作用力變小，所以具有“高鹽吸附、低鹽洗脫”的特點。因此，利用不同蛋白質(zhì)間的疏水性差異，通過改變洗脫時的鹽濃度就可以對蛋白質(zhì)進行有效地分離純化[59]。

（4）親和層析 親和層析利用分子間的特異性相互作用，進行專一而又可逆的結合達到分離純化蛋白的目的。親和色譜純化過程簡單迅速，且分離效率高，適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子，且最終產(chǎn)物純度高。包括生物特異親和層析、金屬螯合親和層析等，大腸桿菌表達中，陳光課題組[31]利用鎳離子親和層析純化類人膠原蛋白，獲得的目的蛋白純度在90%以上。Qi等[49]在動物表達Ⅱ型重組膠原蛋白分離純化時也用到鎳柱層析法分離目的蛋白。

大腸桿菌和畢赤酵母作為原核生物和真核生物的代表，在表達膠原蛋白時發(fā)酵和純化過程有所不同，表4總結了表達兩種體系在發(fā)酵調(diào)控和純化方面的異同。

2 重組膠原蛋白的應用

膠原蛋白作為胞內(nèi)基質(zhì)的主要成分，廣泛存在于體內(nèi)各個組織。近些年來，膠原蛋白已經(jīng)在醫(yī)藥領域取得較大進展，例如皮膚創(chuàng)面敷料、骨支架、肌腱、藥物輸送系統(tǒng)等，在美容領域也取得了較大突破。

表4 原核和真核微生物表達體系發(fā)酵和純化的異同

2.1 骨修復

膠原蛋白具有良好的生物相容性、可降解性、成骨誘導作用，已廣泛應用于骨缺損修復領域。Fahimipour等[64]將膠原蛋白和納米β-磷酸三鈣顆粒復合制備雙層骨修復支架，該支架有效促進了細胞增殖、粘附以及成骨分化。Pulkkinen等[65]將重組人Ⅱ型膠原蛋白用于軟骨修復，具有優(yōu)異的生物相容性以及軟骨修復能力。Hamzah 等[66]將膠原蛋白成功固定在可降解聚乳酸3D 支架上，具有較好的力學性能且有效地促進細胞增殖和粘附，可作為一種潛在的骨移植材料。James等[67]將礦化的DNA-膠原蛋白復合物用于骨組織工程，該復合物具有類似于骨的多孔結構以及較高的成骨效應，可以作為一種潛在的提高骨治療效果的生物材料。Zheng 等[68]將有機相類人膠原蛋白和無機相羥基磷灰石復合構建骨缺損修復支架材料，有利于成骨細胞分化。Liu等[69]將類人膠原蛋白和透明質(zhì)酸以及羥基磷灰石三種材料復合制備雙層軟骨支架，從結構和組分上共同模擬軟骨環(huán)境促進軟骨再生修復骨缺損。張珊珊[30]將重組膠原蛋白（CL）與活性酯聚乙二醇活性酯（NHS-PEG-NHS）以及己二酸二酰肼（ADH）改性后的硫酸軟骨素（ChS-ADH）通過化學交聯(lián)制備的水凝膠應用于顱骨缺損，圖6展示了重組膠原蛋白水凝膠對于骨缺損的修復能力。隨著時間的推移，植入PEG-ChS 水凝膠和PEG-ChS-CL 水凝膠的兩組骨缺損模型及空白對照組的顱骨缺損孔徑均呈逐漸減小的趨勢，術后第56天時，植入PEGChS-CL凝膠的模型組顱骨缺損部位孔徑明顯減小，而植入PEG-ChS 凝膠的模型組顱骨缺損部位孔徑減小程度小于植入PEG-Ch-CL 凝膠的模型組，空白對照組減小程度最不明顯。結果表明PEG-ChS水凝膠和PEG-ChS-CL水凝膠對骨缺損均具有一定的修復效果，但PEG-ChS-CL對骨缺損的修復效果更明顯。

圖6 PEG-ChS-CL水凝膠顱骨缺損修復圖［30］

2.2 皮膚創(chuàng)面修復敷料

近些年來，由于各種原因?qū)е碌钠つw缺損病例越來越多，病人承受著來自身體以及財政方面的壓力。皮膚是人體最大的器官，作為第一道防線保護人們免受病原體的侵入。膠原蛋白作為皮膚的主要成分，在皮膚創(chuàng)面的愈合中尤為重要。Feng等[70]將魚膠原蛋白和海藻酸鈉進行基團接枝通過席夫堿反應制備敷料促進創(chuàng)面愈合，該水凝膠展示了較低的免疫以及較高的生物相容性，促進細胞的增殖和遷移。Rezaii等[71]制備了負載姜黃素的膠原蛋白-殼聚糖復合支架促進皮膚修復，調(diào)控著細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的表達。Cao 等[72]將類人膠原蛋白（HLC）和殼聚糖在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（TG酶）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽雙交聯(lián)下制備皮膚支架修復全層皮膚缺損模型。Pan 等[73]將類人膠原蛋白和聚乙烯醇復合，通過吐溫乳化法制備的大孔水凝膠具有優(yōu)良的力學性能，這些以類人膠原蛋白為原材料的水凝膠創(chuàng)面敷料均具有貫通的孔徑，細胞粘附性，優(yōu)異的生物相容性，可大大促進皮膚創(chuàng)面的修復。Lei 等[74]將重組類人膠原蛋白、透明質(zhì)酸（HA）和殼聚糖（CCS）復合，引入TG 酶和氯化鈉（NaCl）后在低溫4℃下交聯(lián)制備水凝膠將其應用于燒燙傷模型，NaCl 的引入可以增大水凝膠的孔徑有利于吸收滲液以及傷口透氣。相比空白組，在同一時間HLC/HA/CCS組有更完整的表皮組織以及更多的真皮組織再生。

2.3 肌腱修復

肌腱由肌細胞和豐富的胞內(nèi)基質(zhì)組成，連接著骨頭和肌肉，在關節(jié)運動中扮演重要角色，組織工程是肌腱修復的理想治療策略。Zhang等[75]利用膠原蛋白海綿和間葉細胞促進肌腱再生，Yang等[76]利用膠原纖維促進骨髓間葉干細胞肌細胞分化加速肌腱修復，為肌腱組織工程提供了一個潛在的修復材料。Sun等[77]將包含膠原蛋白結合域的基質(zhì)細胞因子-1α（SDF-1α）包裹在膠原蛋白支架里促進肌腱的原位再生，通過SDF1α的可控釋放，提高了纖維細胞的募集以及為肌腱再生提供了微環(huán)境和機械支持。如圖7 免疫組化結果所示，含有CBD 的SDF-1α（CBD-SDF-1α）實驗組較空白對照組以及無膠原蛋白結合域的SDF-1α組（NAT-SDF-1α）在術后4周以及12 周再生肌腱均表達了更多的膠原蛋白，且CBD-SDF-1α膠原蛋白表達量最多，在修復過程中更多的膠原蛋白的表達證明了更好的肌腱修復，證明了膠原蛋白對肌腱再生過程中的促進作用。

圖7 肌腱術后修復免疫組化［77］

2.4 藥物輸送

膠原蛋白以海綿、膜、納米粒的形式作為載體可以輸送不同的藥物，抗生素、骨形成蛋白、生長因子等等。近些年來，蛋白例如絲素蛋白、牛血清蛋白被用來合成納米顆粒已經(jīng)獲得廣泛研究[79-82]。Aditya 等[83]制備了膠原蛋白-聚乙烯吡咯烷酮微針輸送藥物，Kluijtmans 等[78]制備了重組膠原蛋白微球包埋骨形成蛋白（圖8）此外，利用膠原蛋白納米顆粒與膠原蛋白結合起來也可以達到可控釋放納米顆粒的效果。Brey Gil 等[84]將包埋有磺胺嘧啶銀和阿達帕林的納米粒負載在膠原蛋白和明膠基質(zhì)里促進皮膚修復。Sun 等[85]將銀納米顆粒分散在膠原蛋白支架里增強抑菌效果促進骨修復。

圖8 重組膠原蛋白載藥微球構建［78］

2.5 美容

隨著年齡的增長以及紫外線的長期照射，皮膚里的膠原蛋白不斷流失。膠原蛋白是皮膚的主要成分，因此許多化妝品里都添加有膠原蛋白成分。動物膠原蛋白和海洋生物膠原蛋白（魚、水母、海綿）通常被用來制作化妝品[86-87]。但動物膠原蛋白可能會攜帶病毒，如瘋牛病，因此通過發(fā)酵獲得的膠原蛋白被廣泛應用在美容行業(yè)。暨南大學張卉[88]進行了重組類人膠原蛋白的過敏性以及毒性實驗，結果證明其無刺激性以及急性毒性。范代娣課題組將其通過基因工程發(fā)酵獲得的重組膠原蛋白開發(fā)成具有不同修復功效的濕性輔料系列產(chǎn)品，已在國內(nèi)30 個省市廣泛應用，受益各類患者1000 余萬例，有效率達95%以上，優(yōu)于其他同類產(chǎn)品，縮短了愈合時間，減輕了患者痛苦，為臨床提供了更好的治療方案和換代產(chǎn)品。基于類人膠原蛋白產(chǎn)品覆蓋于皮膚表面可形成濕潤性閉合環(huán)境，隔離保護創(chuàng)面，增加皮膚含水量鎖住水分，有效修復表皮屏障，提高皮膚免疫能力等，貴州省黔南州中醫(yī)醫(yī)院宋曉娟將可復美類人膠原蛋白敷料對顏面再發(fā)性皮炎進行治療，發(fā)現(xiàn)類人膠原蛋白敷料治療后，顏面再發(fā)性皮炎不良反應少，復發(fā)率低，無任何不良反應，可替換丁酸氫化可的松進行治療[89]。西安交通大學第一附屬醫(yī)院楊光強等[90]利用地氯雷他定干混懸劑聯(lián)合外用糠酸莫米松乳膏及類人膠原蛋白修復敷料治療特應性皮炎，證明含有類人膠原蛋白的敷料（可愈乳膏）治療組臨床療效顯著且病情控制后不易出現(xiàn)復發(fā)，長期使用安全性高。河南省人民醫(yī)院張春陽等[91]利用類人膠原蛋白疤痕修復硅凝膠（可痕）治療增生性瘢痕，療效明確，有效率達90%，治療效果與芭克硅膠軟膏無統(tǒng)計學差異，具有預防和治療增生性瘢痕的作用安全性高，臨床可推廣使用。類人膠原蛋白可以促進自身成纖維細胞合成膠原和其他細胞外間質(zhì)成分，同時，面部水分顯著增高，補充了減少的膠原蛋白從而改善皮膚老化現(xiàn)象。北京軍區(qū)總醫(yī)院激光美容整形中心劉麗紅等[92]通過微針將類人膠原蛋白導入面部，發(fā)現(xiàn)利用微針在皮膚內(nèi)導入類人膠原蛋白原液對面部年輕化有較好療效，為面部年輕化治療提供了新方法。此外，類人膠原蛋白可增強細胞貼壁生長功能從而促進細胞生長，具有粘附上皮細胞、促進潰瘍愈合的功能，興義市人民醫(yī)院住院部口腔科豐秋婧[93]進行了類人膠原蛋白治療復發(fā)性口腔潰瘍的療效觀察，結果證明類人膠原蛋白治療復發(fā)性口腔潰瘍安全有效，能顯著縮短潰瘍愈合時間，值得臨床推廣應用[93]。

3 結語

膠原蛋白以其優(yōu)異的生物相容性和多功能性被廣泛應用在各個領域。膠原蛋白家族有28種之多，其生物功能各不相同。雖然利用重組技術獲得膠原蛋白已經(jīng)取得一些進展，但是目前制備的重組膠原蛋白的產(chǎn)量及純度仍有提升空間。相信隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程技術等分子生物學研究的快速發(fā)展，未來可通過探索影響蛋白高效合成通路和特定修飾的關鍵酶節(jié)點、分子定向設計、基因串聯(lián)及多步純化、發(fā)酵和純化工藝的進一步優(yōu)化等方法有望獲得產(chǎn)量和純度更高、分量及用途不同的類人膠原蛋白，并進一步實現(xiàn)重組膠原蛋白在食品、化妝品、以及生物醫(yī)藥領域的應用價值。同時，相信重組技術的發(fā)展未來在能源、農(nóng)業(yè)、食品生產(chǎn)、工業(yè)化學和藥品制造等方面都取得巨大的成果，解決全世界范圍內(nèi)棘手的問題。