陳大嵩，黃 鴻，吳 華，李健雄，戴建青

(廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260)

蓖麻蠶Samiaricini，又叫惠利蠶、木薯蠶，大蠶蛾科Saturniidae樗蠶屬的馴養(yǎng)絹絲與食用的非滯育經(jīng)濟(jì)型昆蟲。原產(chǎn)于印度東北部的阿薩姆邦，由寬帶樗蠶Samiacanningi馴化而來(lái)(Peigler & Calhoun, 2013)。我國(guó)自1951年，由中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)生物研究所朱洗教授引進(jìn)飼養(yǎng)蓖麻蠶。蓖麻蠶繭殼奶白色，可用于生產(chǎn)絹紡原料，為全世界僅次于家蠶與柞蠶的第三大絹絲昆蟲，其蠶絲質(zhì)量?jī)H次于家蠶BombyxmoriLinnaeus并優(yōu)于柞蠶AnthereapernyiGuerin-Meneville (van Beeketal., 2000)，蠶絲可設(shè)計(jì)成優(yōu)良的生物材料與細(xì)胞支撐介質(zhì)(Paletal., 2013)，其熟蠶與蛹亦是優(yōu)質(zhì)昆蟲食品(Longvahetal., 2011)，蠶蛹油脂可提煉優(yōu)質(zhì)健康的食用油(王衛(wèi)飛等, 2018)，卵可繁殖多種寄生蜂(莫現(xiàn)會(huì)等, 2016)。蓖麻蠶即可室內(nèi)飼養(yǎng)亦可放養(yǎng)，除家蠶外，為僅有的幾種可以在室內(nèi)大量圈養(yǎng)的絹絲昆蟲。蓖麻蠶的寄主植物相較家蠶與柞蠶更廣，一般以大戟科的蓖麻與木薯做飼料大量飼養(yǎng)，替代寄主包括大戟科的烏桕Sapiumsebiferum(L.)Roxb.、夾竹桃科的雞蛋花Plumeriarubra、苦木科的臭椿Ajugalupulina、馬?？岂R桑CoriarianepalensisWall.、蕓香科吳茱萸Euodiaruticarpa、菊科的蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.和萵苣LactucasativaL. var. angustanaIrish.等。以蓖麻-蓖麻蠶與木薯-蓖麻蠶的形式進(jìn)行栽培-養(yǎng)殖的聯(lián)合增加了蓖麻與木薯的產(chǎn)值，是帶動(dòng)蓖麻與木薯種植業(yè)的重要因素之一。

蓖麻蠶生產(chǎn)上可能遭受侵害的毀滅性病害包括蓖麻蠶微粒子病(劉士賢等, 1964；謝偉東, 1989)、膿病(葉育昌, 1982；李敏棠等, 1985)、軟化病等(吳汝章, 1987)，甚至同時(shí)感染多個(gè)疾病。此外，被污染的蠶室、蠶具、蠶卵很易殘留病原，且隨著累代對(duì)病原物的不停積累，蠶病會(huì)呈現(xiàn)愈發(fā)嚴(yán)重的趨勢(shì)并且病原物亦愈發(fā)難以清除。目前常用的分子生物學(xué)檢測(cè)蠶病病原手段包括PCR、實(shí)時(shí)熒光qPCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP、巢式PCR等方法。隨著高通量測(cè)序方法的發(fā)展，測(cè)序成本的不斷降低，高通量檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用在各種病原的檢測(cè)中。在各高通量測(cè)序平臺(tái)中，牛津納米孔公司Oxford Nanopore的掌上納米孔測(cè)序儀MinION是一款便攜式測(cè)序儀，能夠直接進(jìn)行DNA和RNA測(cè)序，擁有超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)、實(shí)時(shí)測(cè)序、隨時(shí)終止等特性，被廣泛應(yīng)用在檢測(cè)多種病原體中(Warwick Dugdaleetal., 2019；Wongsurawatetal., 2019)。本文通過(guò)利用MinION測(cè)序儀對(duì)蓖麻蠶病蠶組織樣品的DNA進(jìn)行測(cè)序，鑒定病蠶感染的病原物，以實(shí)現(xiàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)蓖麻蠶疾病進(jìn)行監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 DNA提取

蠶病取自江蘇省南京市蠶農(nóng)的蠶室，接種于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)的蓖麻蠶1齡幼蟲，接種后至2～3齡幼蟲集體發(fā)病，幼蟲脫離寄主、拒食、拉稀，死后呈現(xiàn)發(fā)黑、軟化等癥狀，死后蠶體整體用于DNA提取以獲得足夠量的起始DNA濃度。待測(cè)蠶體首先在80℃孵育5 min以殺滅病原以防交叉污染，每1 g蠶體組織放于10 mL CTAB裂解液(2% CTAB，100 mM Tris (pH 8.0)，20 mM EDTA，1.4 M NaCl，3%疏基乙醇)中研磨，65℃水浴2 h。待降溫至室溫，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 ∶24 ∶1)萃取，震蕩10 s后離心10 min，取上清液重復(fù)上一步再次加入等體積的酚氯仿異戊醇萃取。上清液加入等體積的異丙醇沉淀DNA，顛倒混勻后，離心10 min。棄上清留取DNA沉淀，加入適量70%乙醇清洗DNA，離心5 min后棄上清并用移液器吸干液體，晾干DNA后加入100 μL無(wú)菌水溶解DNA。

1.2 納米孔測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

DNA溶液經(jīng)過(guò)微量分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量，取2 μg DNA溶液加入Covaris g-TUBE打斷管上部，8 500 r/min離心1 min將DNA溶液離心到下部，顛倒后8 500 r/min離心1 min將DNA溶液重新離心到上部，DNA溶液取出1 μL加入微量分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量并保證1 μg以上的DNA用于下一步實(shí)驗(yàn)。利用末端修復(fù)試劑盒(NEBNext End repair / dA-tailing Module，E7546)對(duì)打斷的DNA進(jìn)行末端修復(fù)，利用磁珠(AMPure XP beads)對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行回收，取1 μL文庫(kù)加入微量分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量并保證700 ng以上的DNA用于測(cè)序。利用末端連接試劑盒(NEB Blunt/TA Ligase Master Mix，M0367)把連接測(cè)序試劑盒(1D Genomic DNA by ligation，SQK-LSK108)中的接頭連接到DNA上，并用AMPure XP磁珠回收DNA文庫(kù)，取1 μL文庫(kù)加入微量分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量并保證430 ng以上的DNA用于測(cè)序。DNA測(cè)序芯片(Flow Cells R.9.4.1)放入MinION測(cè)序儀并連接電腦，對(duì)機(jī)器與芯片進(jìn)行質(zhì)檢并保證芯片有800以上的可用納米孔，從芯片priming port孔取出20～30 μL緩沖液以去除氣泡，從priming port加入800 μL測(cè)序緩沖液并靜置5 min。打開sample port孔，再次從priming port加入200 μL測(cè)序緩沖液，DNA文庫(kù)與連接測(cè)序試劑盒中的測(cè)序珠(LLB)與緩沖液(RBF)混合，一滴一滴加入到sample port孔，關(guān)閉sample port與priming port。

1.3 納米孔測(cè)序與分析

MinION測(cè)序儀運(yùn)行48 h，合并獲得fastq文件，測(cè)序原始數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)可信計(jì)算平臺(tái)(項(xiàng)目編號(hào)：CNP0001421，測(cè)序編號(hào)：CNR0339720)。從公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI下載各微孢子、各核多角體病毒、白僵菌、柞蠶腸球菌基因組，作為病原體序列數(shù)據(jù)庫(kù)，利用minimap2(v2.17)把測(cè)序序列比對(duì)到病原體數(shù)據(jù)庫(kù)中，以檢測(cè)測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)MinION測(cè)序儀獲得2 116 314條DNA序列約1.87 G個(gè)堿基，最長(zhǎng)53 282 bp，中位數(shù)563，均值884，序列長(zhǎng)度大多超過(guò)300 bp且集中在 300～1 500 bp長(zhǎng)度(圖1)。其中，4 476條序列(占總序列2.1‰)被minimap2比對(duì)到病原數(shù)據(jù)庫(kù)(圖2)，且與比對(duì)到蓖麻蠶基因組類似，序列長(zhǎng)度與比對(duì)堿基數(shù)量的散點(diǎn)圖集中在一片V字區(qū)域，并沒(méi)有線性關(guān)系。比對(duì)長(zhǎng)度超過(guò)800 pb的序列中157條序列比對(duì)到家蠶微粒子Nosemabombycis基因組，139條序列比對(duì)到柞蠶腸球菌Enterococcuspernyi基因組(部分比對(duì)結(jié)果見表1)，比對(duì)長(zhǎng)度超過(guò)300 bp的序列分別有206和313條序列比對(duì)到家蠶微粒子和柞蠶腸球菌基因組(圖3)，這說(shuō)明樣品組織已經(jīng)感染兩種病原體。

圖1 MinION測(cè)序序列長(zhǎng)度分布圖Fig.1 Distribution of the sequence lengths obtained by MinION

圖2 序列比對(duì)結(jié)果散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot of mapping result注：A圖，序列與蓖麻蠶基因組比對(duì)結(jié)果；B圖，序列與病原數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果。Note：A, mapping results to genome; B, mapping results to pathogen database.

表1 部分序列比對(duì)結(jié)果

圖3 比對(duì)到病原基因組且比對(duì)長(zhǎng)度超過(guò)300 bp的序列長(zhǎng)度分布小提琴圖Fig.3 Violin plot of the sequence length mapped to pathology genomes with more than 300 pb mapping length 注：小提琴圖寬度代表序列的數(shù)量。Note：Widths of violin plot represent the sequence amount.

3 結(jié)論與討論

昆蟲組織具有高蛋白質(zhì)、高脂肪的特性，并且在被病原體感染后，壞死組織的DNA被降解，然而高通量測(cè)序?qū)NA提取的質(zhì)量有較高的要求并且起始建庫(kù)的DNA須達(dá)到足夠數(shù)量，因此昆蟲DNA的提取質(zhì)量決定了最終測(cè)序結(jié)果的優(yōu)劣。本研究采用提高裂解液與增加萃取次數(shù)的方式提高DNA的提取純度與數(shù)量，為昆蟲構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)提供參考。

單分子納米孔測(cè)序技術(shù)具有高通量、超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、可以直接檢測(cè)堿基甲基化修飾、無(wú)需PCR擴(kuò)增和體積較小便于攜帶等優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于動(dòng)植物和微生物基因組測(cè)序、宏基因組測(cè)序、RNA直接測(cè)序、微生物檢測(cè)、DNA與RNA甲基化檢測(cè)、mRNA的polyA長(zhǎng)度定量等研究(曹影等, 2020。然而，單分子納米孔測(cè)序的結(jié)果具有較高的錯(cuò)誤率，是阻礙其應(yīng)用的關(guān)鍵。目前MinION測(cè)序儀的單堿基準(zhǔn)確率約85%，修正后的一致性序列的準(zhǔn)確率可達(dá)97%～99%，因此對(duì)單分子納米孔測(cè)序的分析具有一定的挑戰(zhàn)。在DNA文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，本研究通過(guò)DNA低速離心打斷管以獲取更長(zhǎng)的DNA片段以構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，有利于增加序列比對(duì)的長(zhǎng)度以增加可信度。值得注意的是，minimap2的比對(duì)長(zhǎng)度并未與序列長(zhǎng)度成線性關(guān)系，可能與minimap2的算法有關(guān)，因此本研究選取的置信區(qū)間為最低300 bp的比對(duì)長(zhǎng)度，即比對(duì)長(zhǎng)度超過(guò)300 bp為可信比對(duì)結(jié)果。同時(shí)，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中病原物基因組序列的豐富度與病原物種類的選擇，會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果起關(guān)鍵作用并影響最終鑒定結(jié)果。因此，在選擇病原物種核酸序列時(shí)，應(yīng)盡可能涵蓋所有蠶病病原的基因組序列，降低比對(duì)錯(cuò)誤與假陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)選擇真菌性病害病原、細(xì)菌性病害、微粒子基因組以及所有桿狀病毒基因組序列，盡可能構(gòu)建全面的病原序列數(shù)據(jù)庫(kù)以降低鑒定的誤差，并且通過(guò)過(guò)濾序列本身長(zhǎng)度短且比對(duì)長(zhǎng)度較短的序列，以增加比對(duì)結(jié)果可靠性。

本研究通過(guò)MinION測(cè)序儀對(duì)蓖麻蠶病蠶基因組進(jìn)行測(cè)序，與病原基因組序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，無(wú)需PCR擴(kuò)增步驟，降低了假陽(yáng)性。利用MinION等高通量測(cè)序手段對(duì)病蠶、蠶具或蠶室進(jìn)行檢測(cè)不僅可以一次性準(zhǔn)確的鑒定蠶病，也摒棄了PCR方法可能具備的假陽(yáng)性現(xiàn)象，而且其不需要模板設(shè)計(jì)引物，甚至可以鑒定新病原等的特性，可以與PCR鑒定方法形成互補(bǔ)，對(duì)蠶病的全面監(jiān)測(cè)提供保障。