劉 敏，劉宇杰，付寧寧，徐 強(qiáng)，劉玉山，任利利，駱有慶

(北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083)

紅脂大小蠹DendroctonusvalensLeConte，又稱強(qiáng)大小蠹，屬鞘翅目Coleoptera小蠹科Scolytidae，原產(chǎn)于北美洲，傳入我國(guó)后，對(duì)油松Pinustabuliformis造成嚴(yán)重危害，是一種重大的外來入侵生物。紅脂大小蠹在北美洲原產(chǎn)地分布在北緯15°～55°，包括美國(guó)、加拿大和墨西哥、洪都拉斯和危地馬拉(苗振旺等，2000；高寶嘉等，2003；Yanetal., 2005)。在原產(chǎn)地屬于次期性害蟲，主要侵害長(zhǎng)勢(shì)衰弱或被其他病蟲害危害過的樹木(潘杰等，2011)，受害針葉樹包括松科的松屬Pinus、云杉屬Picea、黃杉屬Pseudotsuga、冷杉屬Abies和落葉松屬Larix等35種以上的針葉樹(趙建興等，2008)。

目前，已知紅脂大小蠹在我國(guó)的分布地區(qū)包括山西、陜西、河北、河南、北京等省(市)的大部分區(qū)域，以及甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古等省的個(gè)別縣市(常寶山等，2001；苗振旺等，2001；劉滿光等，2004；賈洪敏等，2008)。紅脂大小蠹傳入我國(guó)后轉(zhuǎn)為初期性害蟲，主要侵害胸徑10 cm以上或樹齡超過30年的健康油松(閆爭(zhēng)亮等，2004；潘杰等，2011；Sunetal., 2013)。在山西還發(fā)現(xiàn)其危害白皮松Pinusbungeana，偶見侵害華山松PinusarmandiiFranch、云杉Piceameyeri、樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica(張歷燕等，2002；Yanetal.，2005；趙建興，2006)，但因危害不嚴(yán)重未引起重視。2017年，在內(nèi)蒙古赤峰市喀喇沁旗旺業(yè)甸林場(chǎng)40年生的樟子松與油松混交林內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)樟子松受紅脂大小蠹的嚴(yán)重危害，而油松受害相對(duì)較輕，紅脂大小蠹優(yōu)先選擇樟子松。

紅脂大小蠹在我國(guó)屬高危險(xiǎn)有害生物，分析該蟲在新的分布地偏好為害寄主發(fā)生變化的原因及潛在的受害寄主，對(duì)于其防控具有重要意義。寄主揮發(fā)物在紅脂大小蠹的行為選擇中起重要作用，從樹木中釋放出來的揮發(fā)物可以為小蠹提供長(zhǎng)距離和/或短距離的信息素，并且在某些情況下，可以協(xié)同小蠹的聚集信息素發(fā)揮作用(Erbilginetal., 2000；Miller and Borden, 2000; Chenetal., 2013)。Schlyter等提出了小蠹寄主選擇依次經(jīng)歷棲境、寄主樹種、寄主個(gè)體3個(gè)水平的抉擇(Schlyter and Birgersson,1999)。而無論棲境抉擇或樹種抉擇，紅脂大小蠹都需要依靠寄主釋放的萜烯類揮發(fā)物對(duì)寄主做出判斷(段焰青等，2006；姚劍等，2011)。以往我國(guó)相關(guān)研究圍繞油松展開，在新發(fā)生地其偏好寄主發(fā)生變化，寄主揮發(fā)物對(duì)紅脂大小蠹的吸引作用是否也發(fā)生變化有待研究。本文選擇我國(guó)7種主要的針葉樹(包括油松、樟子松、華山松、白皮松、馬尾松、紅松、落葉松)展開試驗(yàn)。根據(jù)上述文獻(xiàn)資料及我們前期調(diào)查紅脂大小蠹在野外的危害情況，本文將7個(gè)樹種劃分為三類：(a)主要危害及偏好危害樹種：油松、樟子松；(b)受害且未造成大面積死亡的樹種：華山松、白皮松；(c)尚未發(fā)現(xiàn)受害的樹種：馬尾松、紅松、落葉松。采集7種樹種木段的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，篩選其中主要萜烯類化合物進(jìn)行紅脂大小蠹的行為選擇反應(yīng)。以期明確寄主樹種主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)新侵入地區(qū)內(nèi)紅脂大小蠹的吸引作用，為理解植物揮發(fā)物對(duì)紅脂大小蠹寄主選擇偏好的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試寄主樹種

本試驗(yàn)中7個(gè)樹種的采集地點(diǎn)詳見表1。在不同的采集地點(diǎn)，選取胸徑15 cm、長(zhǎng)勢(shì)較好的健康松樹，伐倒后截為1 m長(zhǎng)的木段，對(duì)木段兩端進(jìn)行封蠟保濕，裝入防水密封包裝袋中運(yùn)輸至內(nèi)蒙古赤峰市黑里河林場(chǎng)。

表1 供試樹種

1.2 供試蟲源

試驗(yàn)所用的紅脂大小蠹，均采自內(nèi)蒙古赤峰市寧城縣黑里河林場(chǎng)油松林，采集后通過是否可以聽到其摩擦發(fā)聲辨別雌雄(閆爭(zhēng)亮等，2004; Liuetal., 2006)，分性別放置在養(yǎng)蟲盒內(nèi)，供給新鮮油松樹皮韌皮部飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲盒存放于溫度25℃、相對(duì)濕度55%、光周期為14 L ∶10 D的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，以備嗅覺行為研究。

1.3 樹干揮發(fā)物的收集鑒定

采用動(dòng)態(tài)頂空氣體法收集7種寄主樹種的樹干揮發(fā)物，在待測(cè)松樹木段距底端20～75 cm處采集。將樹皮表面附屬物清理干凈，用聚乙烯食品級(jí)烘烤袋(406 mm×444 mm，Reynolds，Richmond，VA)包裹樹干并做好密封，填充有Tenax TA (60/80 mesh，Supelco，Bellefonte，DE，USA)的鋼制密封管作為吸附管，通過聚四氟乙烯(PVC)軟管鏈接收集袋和吸附管。使用QC-1S大氣采樣儀(北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所)將袋內(nèi)空氣抽走，泵入活性炭過濾后的凈化空氣，氣體流量為500 mL/min，密閉循環(huán)采氣120 min。每種寄主樹種隨機(jī)采集3段重復(fù)。

在北京林業(yè)大學(xué)大型儀器中心，將采集好的吸附管經(jīng)熱脫附吹掃捕集-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(TCT-GC/MS，PE，CP 4020-Trace 2000/voyager；Perkin Elmer；Finnigan，ThermoQuest，San Jose，CA，USA)分析，色譜條件：毛細(xì)管柱Elite -5 ms，載氣(He)流速2 mL/min，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.25 μm，采取兩級(jí)程序升溫方法，初始溫度40℃保持2 min，第1級(jí)升溫速率為6℃/min升至180℃保持0 min；第2級(jí)升溫速率15℃/min，至270℃保持3 min，共用時(shí)34.33 min；質(zhì)譜條件：溶劑延遲1 min，掃描質(zhì)核比范圍29～500 amu。采用TurboMass Ver 6.4.2軟件，通過NIST2017譜圖庫檢索，結(jié)合人工讀圖解析揮發(fā)物的組成成分。

1.4 紅脂大小蠹對(duì)不同揮發(fā)物的行為選擇

根據(jù)GC-MS分析結(jié)果并參考以往研究結(jié)果，選擇相對(duì)含量較高的7種化合物作為刺激樣品于室內(nèi)進(jìn)行紅脂大小蠹的行為選擇試驗(yàn)，以正己烷作為溶劑，將7種化合物單體分別稀釋為3個(gè)濃度梯度: 10-4、10-2和1 mg/mL(張龍娃等，2009；張蕾蕾，2010)。試驗(yàn)所用化合物及純度：(1R)-(+)-α-蒎烯(98%)，莰烯(90%)，(-)-β-蒎烯(94%)，月桂烯(90%)，(+)-3-蒈烯(95%)，(S)-(-)-檸檬烯(95%)，萜品油烯(85%)，以上樣品均采購自Sigma試劑公司(美國(guó))。

根據(jù)Ren等的方法，使用自制聚四氟乙烯雙向十通道行為儀測(cè)定紅脂大小蠹的行為選擇反應(yīng)(Renetal., 2017)。該行為儀具有10個(gè)平行的測(cè)道，每個(gè)測(cè)道的兩個(gè)末端各插入一個(gè)200 μL的濾芯吸頭，一端吸頭內(nèi)裝有60 μL不同樹種揮發(fā)物的正己烷溶液，另一端吸頭內(nèi)為60 μL正己烷作為對(duì)照。經(jīng)過過濾的濕潤(rùn)空氣經(jīng)由QC-1S大氣采樣儀(北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所)以500 mL/min的流速進(jìn)入行為選擇儀的各個(gè)末端。通過尼康D810相機(jī)(日本)實(shí)時(shí)拍攝整個(gè)行為學(xué)測(cè)試存儲(chǔ)為視頻后，使用實(shí)時(shí)軌跡記錄系統(tǒng)Etho vision XT 14.0(Noldus Information Technology, the Netherlands)識(shí)別并分析，統(tǒng)計(jì)30 min內(nèi)每頭成蟲移動(dòng)的總距離及在各區(qū)帶停留的時(shí)間。行為儀中雌蟲和雄蟲各放入5頭，在7種物質(zhì)不同濃度條件下各測(cè)試1次為一組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)完成后調(diào)換實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的通氣位置，共重復(fù)6組。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過總離子流峰面積歸一化方法定量，計(jì)算揮發(fā)物的相對(duì)含量。使用Duncan檢驗(yàn)分析揮發(fā)性物質(zhì)含量與紅脂大小蠹移動(dòng)總距離的差異性，采用t檢驗(yàn)分析紅脂大小蠹在行為選擇實(shí)驗(yàn)中在各區(qū)帶的停留時(shí)間的差異性。所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 18.0(IBM，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用prism 8.0(Graphpad Software，美國(guó))繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種植物的揮發(fā)性物質(zhì)分析

通過GC-MS分析，從7種針葉樹的揮發(fā)物氣體樣品中共檢測(cè)出包含烯烴類、醇類、酮類、醛類、酯類、酸類、烷烴和芳香烴8類化合物在內(nèi)的54種化合物。其中烯烴類化合物23種，在7個(gè)樹種中相對(duì)含量均為最大(圖1)。樟子松中共鑒定出35種化合物，烯烴類14種，相對(duì)百分含量為50.1%；油松中共鑒定出34種化合物，烯烴類13種，相對(duì)百分含量47.9%；馬尾松中共鑒定出35種化合物，烯烴類16種，相對(duì)百分含量73.8%；白皮松中共鑒定出29種化合物，烯烴類13種，相對(duì)百分含量84.9%，華山松中共鑒定出24種化合物，烯烴類14種，相對(duì)百分含量85.3%；紅松中共鑒定出37種化合物，烯烴類19種，相對(duì)百分含量為69.8%；落葉松共采集鑒定到化合物37種，烯烴類16種，相對(duì)百分含量38.9%。

圖1 不同寄主樹種8類揮發(fā)物相對(duì)含量Fig.1 Relative contents of eight types of volatiles in different tree species

利用平方歐式距離—組之間的鏈接法對(duì)7種樹種的揮發(fā)物進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，在距離>12并且<13處將其分為兩個(gè)集群(A和B)；在距離>9并且<11處，可將A集群進(jìn)一步分為A1和A2組(圖2)。通過主成分分析將7種樹種揮發(fā)物分為3組，與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致，水平軸對(duì)總揮發(fā)物的解釋率為33.7%，垂直軸的解釋率為20.1%(圖3)。a類主要受害樹種樟子松和油松歸為A1組，b類樹種華山松、白皮松和c類未發(fā)現(xiàn)受害樹種中的馬尾松歸為A2組，c類樹種中的紅松、落葉松歸為B組。

圖2 7種松樹樹干揮發(fā)物聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of volatiles from the trunks of 7 tree species

圖3 7種松樹樹干揮發(fā)物主成分分析得分圖Fig.3 PCA score plot of volatiles from the trunks of 7 tree specie

A組5個(gè)樹種揮發(fā)物的共同特征是含有高比例的α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%、53.62%±6.69%、16.89%±2.23%、11.36%±6.18%)，共有的萜烯類化合物包括莰烯、β-蒎烯、檸檬烯、萜品油烯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，A1組中α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%)及莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例顯著高于B組(8.86%±1.07%、9.41%±2.56%)和(0、1.32%±0.52%)(P<0.05)。除此之外，A1組兩樹種中共有的萜烯類化合物還包括(+)-3-蒈烯，A2組包括月桂烯。以上數(shù)據(jù)見表2。故選擇上述7種化合物：(1R)-(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯，月桂烯，(+)-3-蒈烯，(S)-(-)-檸檬烯、萜品油烯、莰烯進(jìn)行紅脂大小蠹的行為反應(yīng)(α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯的構(gòu)型參考以往研究結(jié)果選擇(王鴻斌等，2006；張龍娃等，2009；陳海波，2010；陳大風(fēng)等，2013)。

2.2 行為選擇偏好性分析

2.2.1紅脂大小蠹在不同物質(zhì)不同濃度刺激下的移動(dòng)距離

在30 min內(nèi)，紅脂大小蠹在不同濃度7種化合物刺激下的總移動(dòng)距離如表3所示。隨著月桂烯(A2組特征性揮發(fā)物)濃度的升高，紅脂大小蠹雌蟲的移動(dòng)距離呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)；在相同濃度的月桂烯刺激下，紅脂大小蠹雌雄成蟲的移動(dòng)距離存在差異，在10-4mg/mL的月桂烯刺激下，雌蟲移動(dòng)距離顯著高于雄蟲(P<0.05)，而在1 mg/mL的月桂烯刺激下，雌蟲移動(dòng)距離顯著低于雄蟲(P<0.05)。另外，在10-2mg/mL的莰烯刺激下，雌雄成蟲的移動(dòng)距離均顯著高于其余對(duì)照組(P<0.05)，在10-4mg/mL的莰烯刺激下，雄蟲的移動(dòng)距離顯著低于雌蟲(P<0.05)。其他化合物對(duì)紅脂大小蠹總移動(dòng)距離的影響不顯著。

表3 紅脂大小蠹在不同物質(zhì)不同濃度刺激下30 min內(nèi)的移動(dòng)距離(cm)

2.2.2紅脂大小蠹在不同區(qū)帶內(nèi)停留的平均時(shí)間

在不同濃度各化合物的刺激下，試驗(yàn)記錄開始后30 min內(nèi)，紅脂大小蠹在不同區(qū)帶的停留時(shí)間如圖4所示。雌蟲在10-2mg/mL的(+)-3-蒈烯(t=5.264，P<0.001)，l mg/mL的月桂烯(t=3.796，P<0.005)，1 mg/mL (-)-β-蒎烯(t=3.347，P<0.005)區(qū)帶的停留時(shí)間顯著高于對(duì)照正己烷組，雄蟲在10-4mg/mL的(S)-(-)-檸檬烯區(qū)帶內(nèi)停留時(shí)間顯著高于對(duì)照組(t=3.853，P<0.005)。其中(-)-β-蒎烯與(S)-(-)-檸檬烯為A組樹種共有的化合物，(+)-3-蒈烯為A1組樹種的特征性揮發(fā)物，月桂烯為A2組樹種的特征性揮發(fā)物。其他對(duì)照條件下沒有顯著差異。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)中7種松樹揮發(fā)物中，α-蒎烯，β-蒎烯，月桂烯，(+)-3-蒈烯， (-)-檸檬烯為主要揮發(fā)性成分，與北美紅脂大小蠹的主要寄主黃松的松脂主要成分相符(Hobsonetal.，1993)。松樹的揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析與主成分分析結(jié)果與目前野外受害情況基本一致，已發(fā)現(xiàn)受害的樹種與未發(fā)現(xiàn)受害的樹種揮發(fā)物分為兩組。除馬尾松外，A組樹種為目前已發(fā)現(xiàn)受害的a類和b類樹種，B組為野外未發(fā)現(xiàn)受害樹種。且A組5個(gè)樹種揮發(fā)物的共同特征是含有高比例的α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%、53.62%±6.69%、16.89%±2.23%、11.36%±6.18%)，共有的萜烯類化合物包括莰烯、β-蒎烯、檸檬烯、萜品油烯。通過對(duì)比A1組與A2組，發(fā)現(xiàn)A1組中特有的萜烯類揮發(fā)物為(+)-3-蒈烯，A2組特有的萜烯類揮發(fā)物為月桂烯，且A1組莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例高于A2(0.84%±0.1%、0.43%±0.05%、0.15%±0.12%)組。從以上結(jié)果推測(cè)，樹種揮發(fā)性物質(zhì)的組成、含量等影響紅脂大小蠹的偏好寄主選擇。

Hobson等在美國(guó)的研究認(rèn)為β-蒎烯對(duì)紅脂大小蠹的引誘能力最強(qiáng)(Hobsonetal.，1993)，Sun等在中國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)，3-蒈烯對(duì)紅脂大小蠹引誘能力最強(qiáng)，檸檬烯具有抑制引誘的作用 (Sunetal., 2004)。本文中β-蒎烯、檸檬烯為A組樹種共有的揮發(fā)物，(+)-3-蒈烯為A1組樹種特有揮發(fā)性物質(zhì)。與以往研究不同，本研究中1 mg/mL (-)-β-蒎烯與10-2mg/mL (+)-3-蒈烯對(duì)雌性紅脂大小蠹均有明顯的吸引作用，(S)-(-)-檸檬烯對(duì)紅脂大小蠹雄蟲也有吸引作用。停留時(shí)間在本試驗(yàn)中被選擇作為評(píng)價(jià)其行為選擇的主要指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，雌蟲在10-2mg/mL的(+)-3-蒈烯(t=5.264，P<0.001)以及1 mg/mL (-)-β-蒎烯(t=3.347，P<0.005)區(qū)帶的停留時(shí)間均顯著高于對(duì)照正己烷組，表明上述兩種刺激對(duì)紅脂大小蠹雌蟲具有顯著的吸引作用。雄蟲在10-4mg/mL的(S)-(-)-檸檬烯(t=3.853，P<0.005)區(qū)帶內(nèi)停留時(shí)間顯著高于對(duì)照組，且王鴻斌等證明雄性紅脂大小蠹對(duì)檸檬烯的觸角電位反應(yīng)值與對(duì)照之間的差異達(dá)到了顯著性的水平(王洪斌等，2006)，這一結(jié)果說明該濃度下(S)-(-)-檸檬烯對(duì)紅脂大小蠹雄蟲具有吸引作用。由于紅脂大小蠹在北美原產(chǎn)地就存在對(duì)萜烯類化合物反應(yīng)的地理差異(Sunetal.，2004；張龍娃，2007)，推測(cè)上述結(jié)果差異可能與紅脂大小蠹對(duì)寄主揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)的反應(yīng)出現(xiàn)新的地理變異有關(guān)；或由于本研究在室內(nèi)進(jìn)行，而以往研究為野外試驗(yàn)，結(jié)果差異與不同溫度條件下?lián)]發(fā)物的釋放速率有關(guān)。

本研究中發(fā)現(xiàn)莰烯與月桂烯對(duì)紅脂大小蠹的行為具有刺激作用。移動(dòng)距離的結(jié)果顯示，雌蟲在10-4mg/mL月桂烯刺激下以及雌雄成蟲在10-2mg/mL莰烯刺激下活動(dòng)較為活躍。停留時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，雌蟲在l mg/mL的月桂烯(t=3.796，P<0.005)區(qū)帶的停留時(shí)間顯著高于對(duì)照正己烷組。莰烯為A組樹種共有的萜烯類揮發(fā)物，且A1組莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例高于A2組(0.84%±0.1%、0.43%±0.05%、0.15%±0.12%)；月桂烯為A2組特有的萜烯類揮發(fā)物。

值得注意的是，馬尾松與已發(fā)現(xiàn)受害的4個(gè)寄主樹種揮發(fā)物較為相似，且與a類樹種樟子松、油松同屬二針?biāo)?，但在自然條件下未見其被危害的報(bào)道；需要進(jìn)一步了解紅脂大小蠹的寄主選擇機(jī)制，除了寄主植物揮發(fā)性物質(zhì)的影響以外，需綜合考慮當(dāng)?shù)貧夂?、溫濕度，樹皮厚度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、含水量、滲透壓以及流脂等情況，展開進(jìn)一步的研究。

本文研究了我國(guó)幾種主要松樹樹干揮發(fā)物的組成及含量。通過主成分分析和聚類分析明確了7種樹種揮發(fā)物的差異性，并與紅脂大小蠹的野外危害情況類比分析，篩選出可能與紅脂大小蠹寄主選擇行為相關(guān)的萜烯類揮發(fā)物進(jìn)行行為選擇試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)紅脂大小蠹的主要寄主樹種油松和新發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)危害樹種樟子松的揮發(fā)性物質(zhì)高度相似，且其中的主要揮發(fā)性萜烯化合物β-蒎烯、檸檬烯、(+)-3-蒈烯對(duì)紅脂大小蠹具有吸引作用，莰烯與月桂烯對(duì)紅脂大小蠹也有明顯的刺激作用。本研究加強(qiáng)了紅脂大小蠹趨性行為與寄主樹種揮發(fā)性代謝物質(zhì)相互關(guān)系的研究，有助于紅脂大小蠹引誘劑和驅(qū)避劑的開發(fā)，同時(shí)進(jìn)一步闡明其寄主選擇機(jī)制，為紅脂大小蠹監(jiān)測(cè)與控制技術(shù)體系提供重要依據(jù)。

致謝:感謝內(nèi)蒙古赤峰市黑里河林場(chǎng)對(duì)本研究的大力支持，為我們提供了試蟲和部分試驗(yàn)場(chǎng)所。