劉 敏，劉愛(ài)萍*,韓海斌，甘 霖，陳國(guó)澤，黃海廣

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特 010010；2. 阿拉善科技信息研究所，內(nèi)蒙古阿拉善左旗，750399；3. 阿拉善右旗曼德拉蘇木農(nóng)牧業(yè)綜合站，內(nèi)蒙古阿拉善右旗，750300；4. 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，呼和浩特 010010)

近幾年內(nèi)蒙古地區(qū)的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，茶足柄瘤蚜繭蜂LysiphlebustestaceipesCresson是苜蓿蚜AphiscraccivoraKoch的優(yōu)勢(shì)寄生性天敵，對(duì)控制苜蓿蚜有重要作用(鄭永善和唐保善, 1989; 劉愛(ài)萍等, 2012)。滯育并不是簡(jiǎn)單的發(fā)育停止，而是由環(huán)境與遺傳因素決定的、程序化啟動(dòng)的極其緩慢的發(fā)育過(guò)程。昆蟲(chóng)在滯育期間，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，如脂類(lèi)、碳水化合物和氨基酸等內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)特異性地積累或轉(zhuǎn)化，以確保滯育個(gè)體在逆境中存活及滯育解除后發(fā)育的能量需求(任小云等, 2016)。對(duì)茶足柄瘤蚜繭蜂等天敵昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，闡明滯育的分子調(diào)控機(jī)理，有可能通過(guò)遺傳信息調(diào)控實(shí)現(xiàn)昆蟲(chóng)滯育的人工控制，從而延長(zhǎng)天敵昆蟲(chóng)的壽命，保證天敵昆蟲(chóng)產(chǎn)品的貨架期，最終發(fā)揮生物防治的最佳效果。

糖類(lèi)作為昆蟲(chóng)生命活動(dòng)過(guò)程的中間代謝產(chǎn)物和重要的能源物質(zhì)，與昆蟲(chóng)滯育有密切的關(guān)系(劉流等, 2010)，葡萄糖是大部分生命體的主要供能分子，在新陳代謝中起著重要作用。當(dāng)機(jī)體能量充足時(shí)，葡萄糖可以以淀粉或糖原等聚合物形式進(jìn)行儲(chǔ)備；對(duì)能量需求增加時(shí)，葡萄糖又可以迅速?gòu)募?xì)胞內(nèi)貯存的聚合物中釋放，通過(guò)有氧或者無(wú)氧呼吸提供能量。葡萄糖不僅是供能分子，同時(shí)也可以提供氨基酸、核苷酸、脂肪等生物合成反應(yīng)的代謝中間物質(zhì)。

昆蟲(chóng)滯育期間變化明顯的糖類(lèi)物質(zhì)主要有糖原、海藻糖。在昆蟲(chóng)體內(nèi)，海藻糖(trehalose)主要是由脂肪體合成并分泌到血淋巴，被其他的組織吸收后被利用(Bouniasetal., 1993)，是昆蟲(chóng)血糖的主要組成，海藻糖的含量與海藻糖酶(trehalase, Treh)活力的變化影響著昆蟲(chóng)的滯育、滯育解除和發(fā)育(仵均祥等, 2004)。糖原是昆蟲(chóng)滯育期間主要的能源物質(zhì)，也是抗凍保護(hù)劑(糖、醇類(lèi))的主要來(lái)源之一。已知滯育昆蟲(chóng)的糖原代謝分為糖—醇積累型和海藻糖積累型，兩類(lèi)物質(zhì)都在滯育昆蟲(chóng)的抗凍、蛋白質(zhì)保護(hù)、降低滲透壓或過(guò)冷卻點(diǎn)等方面發(fā)揮著重要的作用。鞭角華扁葉蜂Chinolydaflagellicornis在滯育期間，血淋巴中的糖原逐漸減少，海藻糖含量逐漸增加，在滯育前期，海藻糖與糖原相互轉(zhuǎn)化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)滯育階段及溫度與這種轉(zhuǎn)化關(guān)系有關(guān)(任小云等, 2016)。斑蛾Zygaentrlfolii進(jìn)入滯育后糖原是最重要的能源物質(zhì)，在滯育個(gè)體中糖原含量是非滯育個(gè)體的2倍多(任小云等, 2016)。有研究表明，糖原是棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera滯育蛹生命活動(dòng)的主要能量來(lái)源，隨著滯育強(qiáng)度的深入，糖原含量逐漸減少(李玉艷, 2011)。

過(guò)去人們認(rèn)為滯育是由滯育激素導(dǎo)致的，但越來(lái)越多的研究證明，海藻糖在兩者之間發(fā)揮重要作用。在對(duì)家蠶Bombyxmori的研究中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入滯育前，滯育激素通過(guò)調(diào)控海藻糖酶的活性，促使海藻糖被分解成葡萄糖進(jìn)入卵細(xì)胞，葡萄糖再轉(zhuǎn)化為糖原誘導(dǎo)卵滯育(Okitsugu, 1996)。海藻糖酶由海藻糖酶基因編碼調(diào)控，干擾海藻糖酶基因會(huì)影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，表明Treh在糖代謝通路中發(fā)揮重要作用，參與昆蟲(chóng)重要的生理過(guò)程(Chenetal., 2010; 張倩等, 2012; Zhaoetal., 2016)。

目前對(duì)于茶足柄瘤蚜繭蜂的滯育研究中，涉及分子機(jī)理的研究較少，究竟在茶足柄瘤蚜繭蜂蛹中，碳水化合物代謝與滯育過(guò)程有怎樣的關(guān)系尚不清楚。本試驗(yàn)對(duì)茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹與非滯育蛹進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，重點(diǎn)分析了與糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，結(jié)合糖酵解，淀粉與蔗糖代謝，檸檬酸循環(huán)及茶足柄瘤蚜繭蜂具體的生理學(xué)和環(huán)境調(diào)控在轉(zhuǎn)錄組水平的研究等，從整體上和細(xì)節(jié)上為茶足柄瘤蚜繭蜂滯育相關(guān)的環(huán)境調(diào)控、物質(zhì)能量的代謝機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源、供試寄主植物與滯育誘導(dǎo)

茶足柄瘤蚜繭蜂、寄主蚜蟲(chóng)苜蓿蚜采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁基地，供試寄主植物為蠶豆Viciafaba。

苜蓿蚜采自基地的羊柴Hedysarummongolicum植株上，并轉(zhuǎn)接在室內(nèi)的水培蠶豆苗上繁殖，接蟲(chóng)后對(duì)蠶豆苗進(jìn)行籠罩(100目防蟲(chóng)網(wǎng)籠，55 cm×55 cm×55 cm)，確保苜蓿蚜未被天敵寄生，試驗(yàn)用2～3齡的苜蓿蚜若蚜作為寄主，在溫室內(nèi)飼養(yǎng)5代以上作為供試蟲(chóng)源。

從基地采集被寄生的苜蓿蚜僵蚜，從中挑取未羽化破殼的僵蚜置于人工氣候箱(上海一恒公司MGC-HP系列)溫度25±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期L ∶D=14 h ∶10 h條件下培養(yǎng)，待蜂羽化后，挑選茶足柄瘤蚜繭蜂轉(zhuǎn)移至試管(10 cm×3 cm)內(nèi)，用20%蜂蜜水作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，接入具有苜蓿蚜的蠶豆苗上，建立茶足柄瘤蚜繭蜂種群作為供試蟲(chóng)源，并在室溫下用苜蓿蚜有效擴(kuò)繁10代以上。

在室溫下養(yǎng)蟲(chóng)籠中將剛羽化成蜂按1 ∶100的蜂蚜比釋放成對(duì)茶足柄瘤蚜繭蜂，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)可知，苜蓿蚜若蚜被茶足柄瘤蚜繭蜂寄生后，寄生蜂卵繼續(xù)發(fā)育120 h，此時(shí)僵蚜體內(nèi)寄生蜂處于高齡幼蟲(chóng)(3～4齡)階段，高齡幼蟲(chóng)為茶足柄瘤蚜繭蜂感受滯育信號(hào)的敏感蟲(chóng)態(tài)，將此時(shí)的僵蚜放入人工氣候箱中進(jìn)行滯育誘導(dǎo)。高齡幼蟲(chóng)處于滯育環(huán)境條件時(shí)，并不會(huì)立刻停止發(fā)育，而是繼續(xù)發(fā)育一段時(shí)間，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)發(fā)育至蛹時(shí)，便不再繼續(xù)發(fā)育(孫程鵬, 2018)。本實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)茶足柄瘤蚜繭蜂滯育的溫光組合為，溫度8℃、光周期L ∶D=8 h ∶16 h，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為30 d。選取經(jīng)過(guò)30 d滯育誘導(dǎo)的僵蚜進(jìn)行解剖，選擇蟲(chóng)態(tài)是蛹的茶足柄瘤蚜繭蜂進(jìn)行收集，以獲得滯育組樣品；苜蓿蚜若蚜被茶足柄瘤蚜繭蜂寄生后，放置在25±0.5℃、RH70%±5%、光周期L ∶D=14 h ∶10 h、光照強(qiáng)度8 800 Lx(人工氣候箱，上海一恒公司MGC-HP系列)條件下，寄生蜂卵繼續(xù)發(fā)育168 h(此時(shí)蚜繭蜂處于蛹態(tài))，對(duì)僵蚜進(jìn)行解剖，挑選飽滿，有活力的蛹作為正常發(fā)育組樣品。

1.2 測(cè)序和組裝

茶足柄瘤蚜繭蜂正常發(fā)育組、滯育組轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。測(cè)序進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)需100頭,共構(gòu)建6個(gè)文庫(kù)。測(cè)序完成后，經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用Trinity(Grabherr, 2011)對(duì)clean reads進(jìn)行拼接。

1.3 序列篩選

1)拼接得到的茶足柄瘤蚜繭蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastx比對(duì)(將核酸序列翻譯為蛋白，再進(jìn)行比對(duì))，篩選條件E-value<1e-5，得到注釋基因。

2)應(yīng)用每個(gè)樣本的RPKM(reads per kilo base of exon model per million mapped reads)，以每個(gè)樣本的總表達(dá)量為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行Fisher-test差異檢驗(yàn)，將正常發(fā)育組和滯育組轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行比較，采用FDR與表達(dá)差異倍數(shù)Fold-Change方法進(jìn)行差異基因挑選，篩選條件為：FDR≤0.05，F(xiàn)old-change≥2。

3)篩選的差異基因中，與正常發(fā)育組和滯育組相比，被注釋成功的差異基因定義為滯育關(guān)聯(lián)基因，并提取序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序及組裝

正常發(fā)育蛹與滯育蛹經(jīng)Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序，將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列，作為后續(xù)分析的參考序列。以Corset層次聚類(lèi)后得到最長(zhǎng)Cluster序列進(jìn)行后續(xù)的分析。對(duì)轉(zhuǎn)錄本及聚類(lèi)序列長(zhǎng)度分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

圖1 Nr比對(duì)上的物種分布圖Fig.1 Homology search against Nr database for Lysiphlebus testaceipes transcriptome unigenes

表1 拼接長(zhǎng)度分布情況一覽表

2.2 Unigenes在其他物種中的分布情況

通過(guò)Nr庫(kù)比對(duì)注釋的結(jié)果，可以統(tǒng)計(jì)并繪制比對(duì)上的物種分布圖。因?yàn)槟壳斑€沒(méi)有報(bào)道茶足柄瘤蚜繭蜂的基因組序列，所以利用其他物種的已知基因組對(duì)實(shí)驗(yàn)中的unigene序列進(jìn)行了比對(duì)。在種間分布上，絡(luò)新婦蛛Nephilaclavipes(16.0%)、麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis(9.1%)、多胚跳小蜂Copidosomafloridanum(8.0%)、胡蜂Diachasmaalloeum(6.3%)、Trichomalopsissarcophag(6.0%)和其他種others(圖1)。

2.3 差異基因GO富集分析

在非滯育組與滯育組茶足柄瘤蚜繭蜂差異表達(dá)的基因中，GO注釋到25 666個(gè)差異基因(圖3)，總共分為生物過(guò)程(BP)，細(xì)胞成分(CC)，分子功能(MF)三部分。差異基因的GO功能富集主要集中于代謝過(guò)程(metabolic process)，包括脂代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝等，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)，結(jié)合(binding)功能、催化活性(catalytic activity)。其中GO注釋到碳水化合物代謝(carbohydrate metabolic process)條目的差異基因數(shù)為1 050。

圖2 差異基因GO富集條目圖Fig.2 GO enrichment map of differentially expressed genes for Lysiphlebus testaceipes

圖3 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹與非滯育蛹差異表達(dá)基因KEGG富集氣泡圖Fig.3 Scatter plot of KEGG enrichment of differentially expressed genes in diapause and non-diapause pupae of Lysiphlebus testaceipes注: 圖中橫坐標(biāo)軸為相應(yīng)通路中差異基因的數(shù)目與鑒定出的總基因數(shù)目的比值，值越大，說(shuō)明在該通路中差異基因富集程度越高。點(diǎn)的顏色代表超幾何檢驗(yàn)的P值，值越小，說(shuō)明檢驗(yàn)的可靠性越大、越具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。點(diǎn)的大小代表相應(yīng)通路中差異基因的數(shù)目，值越大，該通路內(nèi)差異基因越多。Note: The abscissa in the figure is the ratio of the number of differentially expressed genes in the corresponding pathway to the number of total proteins identified. The larger the value is, the higher the concentration of genes in this pathway is. The color of points represents the P-value of hypergeometric test. The smaller the value is, the more reliable and statistically significant the test is. The size of the dots represents the number of genes in the corresponding pathway. The larger the dot, the more genes in the pathway.

2.4 差異基因KEGG富集分析

將茶足柄瘤蚜繭蜂非滯育組與滯育組差異表達(dá)基因序列進(jìn)行KEGG在線分析，通過(guò)KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)分析，共分為新陳代謝、遺傳信息加工、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程和有機(jī)體系統(tǒng)五大類(lèi)。7 944個(gè)差異表達(dá)基因共映射到228個(gè)通路，分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要集中在碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑中。

對(duì)茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹與非滯育蛹進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，KEGG注釋到的與糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因共149個(gè)，此次重點(diǎn)分析糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)，淀粉與蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)，檸檬酸循環(huán)三條途徑(citrate cycle)，差異表達(dá)基因分別為18，10和18個(gè)。圖3-圖5展示了三條代謝途徑的KEGG富集通路圖，明確代謝路徑。在表2中，糖酵解/糖異生(glycolysis/ Gluconeogenesis)途徑中，磷酸果糖激酶(phosphofructo kinase, PFK)基因、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)基因、醛縮酶(aldolase, ALDO)基因上調(diào)表達(dá)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因、磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase, PGAM)基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)基因下調(diào)表達(dá)。PFK和PGK是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，基因上調(diào)表達(dá)，兩種酶含量增加，導(dǎo)致的結(jié)果是糖酵解途徑活躍表達(dá)。GAPDH和PGAM是糖酵解和糖異生途徑中共有的酶，同時(shí)PEPCK是糖異生途徑中的關(guān)鍵酶。

在茶足柄瘤蚜繭蜂淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose)途徑中，與非滯育組相比，滯育組糖原合酶(glycogen synthase, GYS)基因、海藻糖合酶(Trehalose 6-phosphate synthase, TreS)基因上調(diào)表達(dá)，海藻糖酶(trehalase, TreH)基因下調(diào)表達(dá)。

在檸檬酸循環(huán)(citric acid cycle)途徑中，蘋(píng)果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, MDH)基因上調(diào)表達(dá)，異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)基因下調(diào)表達(dá)。MDH基因上調(diào)表達(dá)，MDH增加，推測(cè)其與滯育狀態(tài)下的生理需求相關(guān)。IDH是檸檬酸循環(huán)中重要的限速酶，IDH基因下調(diào)表達(dá)，IDH合成減少，導(dǎo)致檸檬酸循環(huán)反應(yīng)速率降低。

圖4 差異基因在糖酵解/糖異生途徑的富集通路圖Fig.4 Pathway map of differentially expressed genes enrichment in glycolysis/ gluconeogenesis

圖6 差異基因在檸檬酸循環(huán)途徑中的富集通路圖Fig.6 Pathway map of differentially expressed genes enrichment in citrate cycle注：包含上調(diào)基因的KO節(jié)點(diǎn)邊框標(biāo)紅色，包含下調(diào)基因的KO節(jié)點(diǎn)邊框標(biāo)綠色，包含上下調(diào)的邊框標(biāo)黃色。實(shí)心箭頭代表分子間的相互作用或關(guān)系，圓圈代表化學(xué)分子。方框-實(shí)心箭頭-圓圈相連，代表表達(dá)；方框-實(shí)心箭頭-豎線-圓圈相連，代表抑制；方框-虛線箭頭-圓圈相連，代表間接作用；直線-方框-實(shí)心箭頭-圓圈-直線-方框-實(shí)心箭頭相連，代表兩個(gè)連續(xù)的反應(yīng)步驟。帶箭頭的直線上標(biāo)有“+P”代表磷酸化，標(biāo)有“-P”代表去磷酸化。Note: The KO node border containing the up-regulated genes is red, containing the down-regulated genes is green, and the border containing up-and-down regulated genes is yellow. A solid arrow represents an interaction or relationship between molecules, and a circle represents a chemical molecule. Box-solid arrow-circle linked, representing expression; Box-solid arrow-vertical line-circle linked, representing inhibition; Box-dashed arrow-circle linked, representing indirect action; Straight-box-solid arrow-circle-straight line-box-solid arrow linked, representing two consecutive reaction steps; Lines with arrows are marked “p” for phosphorylation and “-p” for dephosphorylation.

3 結(jié)論與討論

在本研究中，重點(diǎn)分析了與茶足柄瘤蚜繭蜂滯育過(guò)程中糖代謝相關(guān)的三條途徑，分別是糖酵解/糖異生，淀粉和蔗糖代謝和檸檬酸循環(huán)。涉及到的基因主要有PFK，PGK，ALDO，GAPDH，PGAM，PEPCK，GYS，TreS，TreH，MDH，IDH等。

糖酵解途徑是葡萄糖的主要代謝途徑，為線粒體TCA循環(huán)提供中間代謝產(chǎn)物，從而為機(jī)體提供大部分生存所需的能量。PFK和PGK這兩種酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，在滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂蛹中，磷酸果糖激酶基因和磷酸甘油酸激酶基因較非滯育蛹上調(diào)表達(dá)，表明在茶足柄瘤蚜繭蜂滯育過(guò)程中糖酵解途徑活躍進(jìn)行，因此推測(cè)茶足柄瘤蚜繭蜂在滯育過(guò)程中依賴(lài)糖酵解途徑轉(zhuǎn)換能量，供生物體維持生命活動(dòng)。

糖異生指的是以非糖物質(zhì)作為前體合成葡萄糖的作用，GAPDH，PGAM，ALDO為糖酵解與糖異生途徑共有的酶，磷酸甘油酸變位酶基因，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因和醛縮酶基因下調(diào)表達(dá)，可以認(rèn)為是糖異生途徑表達(dá)受到抑制或糖酵解途徑不能順利進(jìn)行下去。PEPCK是糖異生途徑中的關(guān)鍵酶，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因在滯育過(guò)程中下調(diào)表達(dá)，因此猜測(cè)在茶足柄瘤蚜繭蜂蛹滯育過(guò)程中GAPDH基因、PGAM基因、PEPCK基因的下調(diào)表達(dá)共同抑制了糖異生途徑的進(jìn)行。

表2 糖代謝重要途徑差異基因表達(dá)情況

海藻糖是昆蟲(chóng)的血糖,是昆蟲(chóng)的能量來(lái)源，在海藻糖酶的作用下，分解成為兩分子葡萄糖，再進(jìn)一步通過(guò)糖酵解為昆蟲(chóng)提供能量(Chenetal., 2010; Shuklaetal., 2015; Xiongetal., 2016; Zhaoetal., 2016; Yangetal., 2017)。另一方面,海藻糖在應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)可作為應(yīng)激代謝反應(yīng)的主要產(chǎn)物發(fā)揮作用(Wharton, 2011; Shietal., 2016)，是昆蟲(chóng)重要的儲(chǔ)能物質(zhì)，也是應(yīng)激代謝產(chǎn)物之一。海藻糖酶能夠分解海藻糖，通過(guò)基因的表達(dá)，影響酶活性，進(jìn)而對(duì)昆蟲(chóng)蛻皮、變態(tài)、發(fā)育及繁殖等生命過(guò)程造成影響(唐斌等, 2012)，海藻糖酶是滯育激素調(diào)控代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶(徐衛(wèi)華, 1999)。在滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂蛹中，海藻糖酶基因基因下調(diào)表達(dá)，海藻糖合酶基因上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明海藻糖分解少，合成多，導(dǎo)致海藻糖積累。糖原是主要的能量物質(zhì)，其作用與脂肪類(lèi)似(丁惠梅等, 2011)。滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂蛹中，糖原合酶基因上調(diào)表達(dá)，糖原積累，糖原經(jīng)水解轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵M(jìn)入糖酵解途徑，糖酵解的產(chǎn)物經(jīng)檸檬酸循環(huán)后釋放出大量能量，供生物進(jìn)行正常的生命活動(dòng)，這說(shuō)明糖原可能與脂肪一樣作為儲(chǔ)備能源物質(zhì)，參與茶足柄瘤蚜繭蜂體內(nèi)能量代謝。而海藻糖則可能作為保護(hù)劑與糖原相互轉(zhuǎn)化，參與了茶足柄瘤蚜繭蜂的滯育調(diào)節(jié)。

在需氧生物中，檸檬酸循環(huán)是普遍存在的一種獲取能量的代謝方式，是聯(lián)系糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)三大主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的樞紐及最終代謝通路(王蔭長(zhǎng), 2001)。研究發(fā)現(xiàn)，滯育過(guò)程中昆蟲(chóng)代謝水平顯著下調(diào)，有些甚至代謝抑制達(dá)到90%(Ragland, 2009)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，參與檸檬酸循環(huán)的異檸檬酸脫氫酶基因在滯育個(gè)體中下調(diào)表達(dá)，蘋(píng)果酸脫氫酶基因上調(diào)表達(dá)。異檸檬酸脫氫酶作為催化異檸檬酸氧化形成α-酮戊二酸反應(yīng)中的限速酶，此反應(yīng)不可逆，是檸檬酸循環(huán)中重要的限速步驟。已有研究表明， 檸檬酸循環(huán)在昆蟲(chóng)滯育期間受到抑制(Michaud and Denlinger, 2007; Xuetal., 2012; Luetal., 2014)。在調(diào)節(jié)能量釋放速率中起到關(guān)鍵作用，在茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹中基因下調(diào)表達(dá)，也反應(yīng)出能量供應(yīng)的關(guān)鍵循環(huán)之一—檸檬酸循環(huán)整體反應(yīng)速率的降低，表現(xiàn)在滯育茶足柄瘤蚜繭蜂體內(nèi)維持了低能量代謝，與茶足柄瘤蚜繭蜂蛹在滯育條件下整體呈現(xiàn)的低水平代謝相符。

在研究中發(fā)現(xiàn)，甘油、山梨醇等醇類(lèi)物質(zhì)在低溫環(huán)境中對(duì)蘋(píng)果酸活性保持具有重要作用，而在滯育個(gè)體中，已知甘油、山梨醇、甘露醇等多元醇是不斷積累增加的，它們可以降低生物體的過(guò)冷卻點(diǎn)，保護(hù)細(xì)胞膜免受結(jié)冰損傷(Mansingh and Smallman, 1972; Zachariassen, 1985; Jaindl and Popp, 2006)。蘋(píng)果酸脫氫酶為NAD-依賴(lài)型，定位于線粒體基質(zhì)中，催化檸檬酸循環(huán)中 L-蘋(píng)果酸羥基氧化形成羰基，生成NADH并與草酰乙酸相互轉(zhuǎn)化，以此調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的物質(zhì)能量代謝(Goward and Nicholls, 1994)。在茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹中，蘋(píng)果酸脫氫酶基因上調(diào)表達(dá)，蘋(píng)果酸脫氫酶增加，在滯育過(guò)程中蘋(píng)果酸脫氫酶的主要作用是參與NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸, nicotinamide adenine dinucleotide)的循環(huán)利用及物質(zhì)循環(huán)(王啟龍等, 2012)，推測(cè)其與滯育狀態(tài)下的生理需求相關(guān)，一方面與茶足柄瘤蚜繭蜂對(duì)NAD的合成和利用有關(guān)，另一方面或許是應(yīng)對(duì)滯育環(huán)境條件的一種應(yīng)激方式，與正常個(gè)體的代謝通路相比，滯育個(gè)體開(kāi)啟了另外的代謝通路以適應(yīng)環(huán)境條件的改變。蘋(píng)果酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶作為糖代謝中重要的酶類(lèi)，它們的含量變化與滯育期間昆蟲(chóng)的能量調(diào)節(jié)及代謝密切相關(guān)(Hayakawa and Chino, 1981, 1982; Hahn and Denlinger, 2011)。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究糖代謝在茶足柄瘤蚜繭蜂滯育中的作用，糖類(lèi)物質(zhì)在滯育過(guò)程中的變化對(duì)昆蟲(chóng)有著怎樣的影響。從整體上和細(xì)節(jié)上為茶足柄瘤蚜繭蜂滯育相關(guān)的環(huán)境調(diào)控、物質(zhì)能量的代謝機(jī)理提供參考。研究糖代謝對(duì)揭示滯育過(guò)程的分子機(jī)制至關(guān)重要，闡明分子機(jī)理有可能通過(guò)遺傳信息調(diào)控實(shí)現(xiàn)人工控制昆蟲(chóng)滯育，豐富常規(guī)的溫光互作滯育誘導(dǎo)技術(shù)，從而延長(zhǎng)天敵昆蟲(chóng)的壽命，保證天敵昆蟲(chóng)產(chǎn)品的貨架期，最終發(fā)揮生物防治的最佳效果。