陳健鑫，魏金龍，錢昱含*，馬煥成，伍建榕1,**

(1. 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明 650224；2. 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224)

昆蟲綱包含近一百多萬種描述物種，昆蟲在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色。叉襀科Nemouroidea屬襀翅目Plecoptera，是襀翅目中數(shù)量最多的一個(gè)科，叉襀科昆蟲是一類重要的水生昆蟲(顏忠誠和Zhong，2004)，稚蟲生活在水質(zhì)優(yōu)良的溪流中，主要取食植物碎片，藻類、苔蘚及水中小型動物，對水環(huán)境的變化較為敏感，因此常作為指示生物評估淡水環(huán)境的污染情況；其中少數(shù)種類的成蟲在大量發(fā)生時(shí)，水域兩邊的果樹也會受到一定程度的危害(Banks，1947；祝芳，2002；李衛(wèi)海，2007；王洪建等，2009)。

由于外界不良環(huán)境因素的影響，昆蟲種群在自然界中經(jīng)常發(fā)生疾病流行，且60%以上的病原物是真菌，病原真菌長期以來一直被研究用于生物控制和綜合害蟲管理(IPM)策略(張維等，2020)。水霉病通常在淡水魚類上發(fā)生，魚類受傷后又處于惡劣的養(yǎng)殖環(huán)境中，容易受到絲狀真菌的侵染而發(fā)生皮膚病，當(dāng)病菌深入真皮及肌肉等組織，會造成魚類組織壞死甚至死亡，魏冬梅等(2019)報(bào)道了新疆地區(qū)造成魚類水霉病的病原菌種類有根霉屬、毛霉屬、水霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬等，并通過致病性研究證實(shí)了大多數(shù)病原真菌屬于機(jī)會性致病菌，與淡水魚類的健康情況及外界環(huán)境條件有著密切的關(guān)聯(lián)。

目前，對叉襀科昆蟲的研究僅在分類研究階段，對其病原菌的種類及其致病性的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在通過從云南香格里拉采集的叉襀科稚蟲自然病死蟲體上分離病原菌，研究病原菌對叉襀科稚蟲的致病性，為水生生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境監(jiān)測及蟲害控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料與供試培養(yǎng)基

于2018年7月16日-22日在迪慶州和麗江老君山采集襀翅目稚蟲及成蟲。采用馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)分離病原真菌。待PDA培養(yǎng)基滅菌冷卻至50℃時(shí)，補(bǔ)充30 mg/L的鏈霉素溶液(生工，上海)以抑制細(xì)菌的快速生長。

1.2 病原真菌分離培養(yǎng)

采用略改進(jìn)的組織分離法分離病原真菌。方法如下：將感病叉襀科稚蟲浸入75%乙醇中浸泡5 s，0.1%升汞溶液浸泡1 min，最后用無菌水漂洗5次。用無菌解剖剪將體壁剪為5 mm×5 mm的組織塊并接種于PDA培養(yǎng)基平板，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。將長出的菌絲挑入新的PDA平板重復(fù)純化3次。純菌落接種于PDA試管斜面，菌絲長滿斜面后于4℃保存。

1.3 病原真菌致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則驗(yàn)證病原真菌致病性。供試病原真菌接種于PDA平板，25℃活化培養(yǎng)3 d，用6 mm無菌打孔器在菌落邊緣打孔，挑取10個(gè)菌絲塊放入無菌錐形瓶中，加入20 mL無菌水，置于搖床200 r/min震蕩30 min制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子液終濃度為1×105個(gè)/mL。叉襀科稚蟲用無菌水漂洗5次后分別用無菌塑料杯分裝(10頭/組)，試驗(yàn)處理組分別使用30 mL孢子懸浮液培養(yǎng)，空白對照組使用30 mL無菌水培養(yǎng)?？刂七m宜叉襀科稚蟲所需的氧氣、溫度、營養(yǎng)等條件進(jìn)行飼養(yǎng)。每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)(細(xì)囊霉菌處理組為PN1-1、PN1-2和PN1-3；毛霉菌處理組為PN2-1、PN2-2和PN2-3以及空白對照組為CK1、CK2和CK3)，每天定時(shí)觀察并記錄蟲體存活死亡情況。

根據(jù)飼養(yǎng)123 h內(nèi)每日蟲口死亡情況和剩余活蟲數(shù)計(jì)算出累計(jì)死亡率LR123h，利用生存曲線圖展現(xiàn)各時(shí)間段內(nèi)的蟲口死亡情況并通過二項(xiàng)式回歸計(jì)算致死中時(shí)以分析菌株的致病性。

1.4 病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定

采用玻片培養(yǎng)檢視法觀察病原菌的形態(tài)特征。方法如下：將無菌蓋玻片斜插入PDA平板，在培養(yǎng)基上接種病原真菌，置于25℃培養(yǎng)7 d。將蓋玻片取出后使用光學(xué)顯微鏡(尼康，上海)觀察病原真菌營養(yǎng)體和繁殖體形態(tài)特征。

1.5 病原真菌分子生物學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA抽提試劑盒OMEGA Fungal DNA Kit(碩陽科技有公司，昆明)抽提病原真菌總DNA，提取后保存于-20℃?zhèn)溆?。分別以兩株病原真菌總DNA為模板，采用真菌18S rDNA通用引物對(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)擴(kuò)增其ITS序列。PCR反應(yīng)采用50 μL體系，包括2×PowerTaqPCR MasterMix(百泰克，北京)25 μL，引物(10 μmol/L)各1.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min后，進(jìn)行以下循環(huán)：94℃變性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸50 s，共循環(huán)35次，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠純化后送華大基因測序。

利用DNAMAN 8(Wang，2015)將雙向測通的序列拼接并提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對。利用Clustalx 1.83對序列進(jìn)行多重對比，使用BioEdit調(diào)整保守區(qū)序列。分別以Achlyacatenulate和Rhizopusoryzae作為菌株P(guān)N1和PN2的外類群，通過PAUP* 4.0b10最大簡約法(Maximum-Parsimony, MP)以1 000進(jìn)行Bootstrap校驗(yàn)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析菌株的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌分離培養(yǎng)

從云南香格里拉采集到的自然病死叉襀科稚蟲上分離得到兩株真菌PN1(圖1-A)和PN2(圖1-B)。

圖1 病原真菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征 Fig.1 Morphological characteristics of pathogenic fungi on PDA media注: A, 菌株P(guān)N1; B, 菌株P(guān)N2。Note: A, strain PN1; B, strain PN2.

2.2 病原真菌致病性分析

根據(jù)柯赫氏法則驗(yàn)證病原真菌對叉襀科稚蟲致病性，結(jié)果顯示：細(xì)囊霉菌PN1處理的實(shí)驗(yàn)組27 h后有蟲體死亡，72 h后可見死亡蟲體長出菌絲，96 h后菌絲布滿全部蟲體(圖2-A)；毛霉菌PN2處理的實(shí)驗(yàn)組3 h后有蟲體死亡，24 h后開始長出菌絲，48 h后菌絲布滿死亡蟲體(圖2-B)；對照組在3 h后有蟲體死亡，123 h后蟲體全部死亡，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中死亡蟲體未長出任何菌絲。

圖2 病原真菌致病性驗(yàn)證Fig.2 Pathogenicity assay on isolated pathogenic fungi注: A, PN1處理組; B, PN2處理組; a, 菌株P(guān)N1; b, CK; c, 菌株P(guān)N2; d, CK。Note: A, treatment group of PN1; B, treatment group of PN2; a, strain PN1; b, CK; c, strain PN2; d, CK

細(xì)囊霉菌PN1處理組27 h后初見死亡蟲體，在 27～39 h死亡率突增達(dá)到46.67%，123 h后PN1-1組蟲體全部死亡，7 d后PN1-2組蟲體全部死亡，10 d后PN1-3組蟲體全部死亡，123 h平均死亡率為93.33%；毛霉菌PN2處理組3 h后初見死亡蟲體，在15～39 h死亡率突增，達(dá)到43.33%，之后死亡速率減緩，75 h后PN2-2組蟲體全部死亡，99 h后PN2-3組蟲體全部死亡，11 d后PN2-1組蟲體才全部死亡，123 h平均死亡率為96.67%；對照組3 h后初見死亡蟲體，123 h平均死亡率達(dá)到100.00%(表1，圖3)。

表1 病原真菌孢子懸浮液處理123小時(shí)內(nèi)稚蟲的平均死蟲數(shù)及平均死亡率

圖3 病原真菌孢子懸浮液處理123小時(shí)內(nèi)稚蟲的生存曲線Fig.3 Survival curve of larvea exposed to pathogenic conidia in 123 h

通過二項(xiàng)式回歸模型及致死中時(shí)分析比較病原真菌處理組與對照組之間的致病性差異，得出PN1及PN2處理組的死亡數(shù)量在90 h前均低于對照組，其中毛霉菌處理組PN2的死亡情況與對照組無明顯差異，而細(xì)囊霉菌處理組PN1卻表現(xiàn)出明顯差異，死亡數(shù)量趨勢幾乎接近于線性增長。在1×105個(gè)/mL接種濃度下，細(xì)囊霉菌處理組52 h后死亡率達(dá)到50%，LT50為52.28 h，毛霉菌處理組在30 h之內(nèi)死亡率達(dá)到50%，LT50為29.15 h(表2，圖4)。結(jié)果表明，PN1及PN2處理組對叉襀科稚蟲的致病性稍弱，其中細(xì)囊霉菌處理組PN1的致病性低于毛霉菌處理組，毛霉菌處理組PN2的致病性與對照組無明顯差異。

表2 病原真菌對叉襀科稚蟲致病性回歸模型分析

圖4 病原真菌致病性的回歸模型分析Fig.4 Regression model of pathogenicity of pathogenic conidia

2.3 病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌株P(guān)N1營養(yǎng)體為分枝發(fā)達(dá)的絲狀體，無隔膜，分體產(chǎn)果式。無性階段產(chǎn)生游動孢子，常具有兩游現(xiàn)象，孢子囊可由孢囊層出方式或分枝方式產(chǎn)生，菌絲中常形成厚垣孢子，即芽孢子，有性階段產(chǎn)生卵孢子(魏景超，1990)(圖5-A)。

菌株P(guān)N2菌絲生長迅速，且無假根；孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，單軸分枝或假單軸分枝，全部頂生孢子囊；孢子囊大，球形，含孢子甚多；孢囊孢子球形、橢圓形、卵圓形或不規(guī)則，壁薄，平滑；無附屬絲(魏景超，1990)(圖5-B)。

圖5 PDA培養(yǎng)基上病原真菌形態(tài)學(xué)特征Fig.5 Morphological characteristics of pathogenic fungi on PDA media注: A, 菌株P(guān)N1; B, 菌株P(guān)N2; a, 無隔菌絲; b, 卵孢子; c, 孢囊梗; d, 孢子囊。Note: A, strain PN1; B, strain PN2; a, non-septahypha; b, oospore; c, sporangiophore; d, sporangium.

2.4 病原真菌分子生物學(xué)鑒定

通過PCR擴(kuò)增得到大小約為500～750 bp特異性片段(圖6)，菌株P(guān)N1和PN2的序列提交到NCBI基因庫分別獲得GenBank登錄號：MT950235和MT950271，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列比對，結(jié)果表明菌株P(guān)N1與GenBank中的細(xì)囊霉菌Leptolegniasp.同源性達(dá)到100%；菌株P(guān)N2與凍土毛霉Mucorhiemalis同源性達(dá)到99.83%，系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7，圖8)結(jié)果顯示，菌株P(guān)N1與Leptolegniasp.聚為一類，支持率為100%；菌株P(guān)N2與M.hiemalis處于同一進(jìn)化支，支持率為98%，從而確定了2株病原真菌的親緣關(guān)系。

圖6 病原真菌ITS序列PCR電泳結(jié)果Fig.6 PCR products of ITS sequences from pathogenic fungi

圖7 菌株P(guān)N1基于ITS序列采用最大簡約法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of PN1 based on ITS sequences by the MP method

圖8 菌株P(guān)N2基于ITS序列利用最大簡約法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of PN2 based on ITS sequences by the MP method

3 結(jié)論與討論

本研究從云南香格里拉叉襀科稚蟲自然死亡蟲體上分離到兩株病原真菌PN1和PN2；通過形態(tài)學(xué)鑒定同時(shí)結(jié)合ITS序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定菌株P(guān)N1為Leptolegniasp.；PN2為Mucorhiemalis；通過柯赫氏法則驗(yàn)證病原真菌的致病性，結(jié)果顯示兩株真菌對叉襀科稚蟲的致病性較弱，無較強(qiáng)的殺蟲效果。

本研究分離得到的細(xì)囊霉菌和凍土毛霉為水生弱寄生菌，屬于條件致病菌，通常情況下不侵染健康的叉襀科稚蟲，當(dāng)外界水環(huán)境改變或被污染，不再適宜叉襀科稚蟲生活，使得叉襀科稚蟲處于亞健康或體壁出現(xiàn)傷口時(shí)，病原菌開始侵入蟲體。菌絲侵入蟲體的早期無明顯的癥狀，隨著病程的發(fā)展，菌絲向內(nèi)穿過體壁進(jìn)入肌肉組織，向外則長出絮狀菌絲，最終造成稚蟲死亡并加速侵染其余蟲體。

Leptolegniasp.是水霉科Saprolegniaceae一種水生真菌(梁枝榮和余永年，1985；宋鎮(zhèn)慶等，1994)，Huneycutt于1952年將該屬新增至水霉科(魏景超，1990)。前人在研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)囊霉屬真菌對蚊科幼蟲有較強(qiáng)的致病性，金立中(1986)年報(bào)道細(xì)囊霉屬Leptolegniasp.對庫蚊亞科和按蚊亞科的9種幼蟲有致病作用；Andrade和Fernando(1993)曾列出一種細(xì)囊霉菌Leptolegniasp.對三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus、致倦庫蚊Culexfatigans、庫蚊屬Culex和曼蚊屬M(fèi)ansonia有寄生關(guān)系；Gutierrez團(tuán)隊(duì)(2017)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)囊霉菌Leptolegniasp.具有很高的宿主特異性，能感染蚊科幼蟲，并對非目標(biāo)水生生物造成傷害非常低；倪達(dá)書(1982)研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)魚類皮膚或鰓受到機(jī)械損傷及其他病原體的傷害時(shí)，魚體抵抗力降低，水霉孢子侵入傷口并開始萌發(fā)，使魚類發(fā)生水霉病。Bly等人(1992)通過研究溝鯰水霉病表明，當(dāng)鯰魚免疫力迅速下降才會被水霉菌感染，而健康魚體不會感染水霉。毛霉目Mucorales是接合菌綱Zygomycetes最大的目(李鐘慶，1981)。毛霉目中某些類群通常會引起動植物的病害，如甘薯在貯運(yùn)過程中受到黑根霉侵染發(fā)生軟腐?。焕羁死珙^霉和微小毛霉能侵染人類的內(nèi)臟器官(陳臘梅和李春陽，2007)。毛霉目感染昆蟲及利用毛霉作為生防制劑防控水生害蟲的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

叉襀科昆蟲是一類重要的水生昆蟲，本研究首次在叉襀科昆蟲中報(bào)道了細(xì)囊霉菌和毛霉菌并分析了兩株真菌對稚蟲的致病性，為水生生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境監(jiān)測及農(nóng)林有害昆蟲生物防治提供了理論依據(jù)。今后，對叉襀科昆蟲病原菌種類多樣性，病原菌致病條件多樣性以及病原菌侵染和致病機(jī)理開展深入研究具有重大的意義。