王 楠，馮硯平，陳 康，傅 強(qiáng)，王偉佳

廣東省中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528400

急性髓系白血病(AML)是一種惡性、異質(zhì)性、克隆性疾病，具有高度基因復(fù)雜性。通過聯(lián)合化療誘導(dǎo)緩解后，80%的AML患者可以達(dá)到形態(tài)學(xué)完全緩解(mCR)，但是超過50%的成年患者會復(fù)發(fā)，這與化療后微小殘留病灶(MRD)的增殖有關(guān)。所以，尋找采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法無法觀察到的MRD，對于指導(dǎo)臨床治療策略，改善疾病預(yù)后，延長患者生存期具有重要意義。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MFC)通過使用熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體組來評估造血細(xì)胞的抗原表達(dá)，識別白血病相關(guān)免疫表型(LAIP)，可廣泛應(yīng)用于90%的AML患者，且檢測速度快，靈敏度高[1]。本研究對138例經(jīng)誘導(dǎo)化療后達(dá)到mCR的AML患者進(jìn)行了相關(guān)分析，應(yīng)用MFC監(jiān)測患者骨髓標(biāo)本的MRD,分析其在AML復(fù)發(fā)與預(yù)后評估中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2019年5月本院收治的經(jīng)過1～2個療程誘導(dǎo)化療后達(dá)到mCR的AML患者(排除M3型)138例。所有患者均進(jìn)行骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫表型、分子生物學(xué)檢查，按照世界衛(wèi)生組織(WHO)和FAB標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診和分型,參照2019年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)AML相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行危險分層[2]。

1.2方法

1.2.1治療方案及療效判斷 白細(xì)胞水平過高的患者首先使用羥基脲或聯(lián)合白細(xì)胞單采清除術(shù)降低白細(xì)胞水平。根據(jù)患者的年齡及各方面情況，采用IA、HAA、MA、TA、CAG及DCAG等方案進(jìn)行誘導(dǎo)化療。根據(jù)治療效果及遺傳學(xué)危險分層，預(yù)后良好的患者鞏固化療6～8個療程，預(yù)后不良的患者在完全緩解后進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植，若無移植條件，則采用聯(lián)合化療。參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行療效判斷，分為完全緩解、部分緩解、無效。

1.2.2MFC檢測MRD 根據(jù)初診時每個患者的免疫分型結(jié)果確定相應(yīng)的LAIP，以此作為MRD檢測的標(biāo)志。于每次化療后3周左右或下次化療前抽取患者骨髓，采用MFC進(jìn)行MRD檢測(流式細(xì)胞儀由美國Becton-Dickinson公司生產(chǎn))。以CD45/SCC設(shè)門，獲取10 000～20 000個細(xì)胞，所使用的單克隆抗體包括cMPO、CD13、CD33、CD117、CD34、CD38、CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD19、CD20、cCD22、cCD79a、CD2、CD3、CD4、CD8、CD7、CD10等，設(shè)定具有LAIP的細(xì)胞>0.1%為MRD陽性[3]。

1.3隨訪 采用查閱患者門診、住院病歷及電話聯(lián)系等方式進(jìn)行隨訪，隨訪日期截止2020年3月31日?？偵嫫诙x為患者從確診至死亡或隨訪截止的時間，無復(fù)發(fā)生存期定義為患者從mCR至復(fù)發(fā)或隨訪截止的時間。

2 結(jié) 果

2.1患者臨床特征 138例患者中，MRD陽性31例，占22.5%。MRD陽性與MRD陰性患者性別、年齡、初診時白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、初診時血紅蛋白(HB)、初診時血小板計數(shù)(PLT)、初診時乳酸脫氫酶(LDH)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在化療第1療程達(dá)到mCR的患者中，MRD陰性有89例(83.2%)，MRD陽性有16例(51.6%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 MRD陽性與MRD陰性患者的臨床特征比較

組別n初診時PLT[M(P25,P75),×109/L]初診時LDH[M(P25,P75),U/L]是否在化療第1療程達(dá)到mCR[n(%)]是否MRD陽性3135(10,62)444(275,589)16(51.6)15(48.4)MRD陰性10743(23,69)392(285,659)89(83.2)18(16.8)t/χ2/Z1.4220.60213.162P0.1550.547<0.001

2.2MRD陽性與陰性患者的療效及生存分析 經(jīng)過2～3個療程化療后，所有患者均達(dá)到mCR。中位隨訪時間為26個月，MRD陽性患者累計復(fù)發(fā)率為61.3% ，高于MRD陰性患者的48.6%(χ2=4.407，P=0.036)；MRD陽性患者總生存率為54.8%，低于MRD陰性患者的70.1%(χ2=4.332，P=0.037)；MRD陽性患者的無復(fù)發(fā)生存率為38.7%，低于MRD陰性患者的49.5%(χ2=4.408，P=0.035)。Kaplan-Meier生存曲線見圖1。

注：A為累計復(fù)發(fā)率；B為總生存率；C為無復(fù)發(fā)生存率。

2.3MRD陽性患者接受不同治療方案后的生存情況 31例MRD陽性患者在誘導(dǎo)緩解后有19例繼續(xù)采用鞏固化療，12例接受異基因造血干細(xì)胞移植。鞏固化療患者總生存率為47.4%，低于異基因造血干細(xì)胞移植患者的66.7%(χ2=4.190，P=0.041)。Kaplan-Meier生存曲線見圖2。

圖2 鞏固化療患者與異基因造血干細(xì)胞移植患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

AML是一種具有高度異質(zhì)性、進(jìn)展快的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，隨著醫(yī)療水平的快速提高及大量新藥的研發(fā)應(yīng)用，AML患者的完全緩解率明顯提高，生存期延長。但仍有半數(shù)以上的患者會在緩解后一段時間內(nèi)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致生存期縮短，最終死亡，其主要原因是在達(dá)到mCR后骨髓中的MRD持續(xù)存在且出現(xiàn)增殖，導(dǎo)致AML復(fù)發(fā)。所以，MRD監(jiān)測在指導(dǎo)個性化治療、更早發(fā)現(xiàn)藥物耐藥性、預(yù)測復(fù)發(fā)，以及評價治療效果等方面均具有重要意義[4]。目前，臨床常用的定量檢測MRD的方法包括MFC檢測LAIP和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測特異性融合基因。RT-qPCR的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度和特異度高，但是通常用于檢測特定遺傳學(xué)及分子學(xué)異常的患者所存在的融合基因及基因突變[5]，如PML-RARA、RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH1等融合基因及NPM1、FLT3等基因突變等，而存在這些遺傳學(xué)及分子學(xué)異常的患者僅占所有AML患者的60%～70%[6]，因此該方法存在一定的局限性。MFC可以識別每個患者獨(dú)特的LAIP，并將其作為該患者的MRD在后續(xù)樣本檢測中進(jìn)行追蹤，可廣泛應(yīng)用于90%的AML患者，且采用MFC檢測MRD的靈敏度較高。

國內(nèi)外多項研究肯定了MRD在AML mCR患者中的預(yù)后意義[7-10]。FREEMAN等[7]使用MFC評估2 450例成年AML患者M(jìn)RD的研究指出，首次誘導(dǎo)化療后MRD陽性患者與化療后部分緩解患者的生存結(jié)局類似，特別是在中風(fēng)險及高風(fēng)險患者中；對于NPM1野生型中風(fēng)險患者，兩個療程化療誘導(dǎo)后，MRD陽性與不良預(yù)后顯著相關(guān)。張瑩等[8]對131例AML患者的研究顯示，在獲得mCR后接受鞏固化療的患者中，MRD陽性患者的5年總生存率和無復(fù)發(fā)生存率明顯低于MRD陰性患者。本研究結(jié)果顯示，MRD陽性患者累計復(fù)發(fā)率高于MRD陰性患者，總生存率和無復(fù)發(fā)生存率低于MRD陰性患者，與上述報道相似。

目前，對AML患者治療前進(jìn)行風(fēng)險分層主要根據(jù)年齡、遺傳學(xué)及分子學(xué)等，MRD對預(yù)后的重要意義提示可將其作為治療后危險分層的參考依據(jù)，可根據(jù)AML治療后MRD的狀態(tài)來進(jìn)行危險分層，并指導(dǎo)臨床個性化治療。以MRD為依據(jù)的危險分層相關(guān)研究大多數(shù)是針對急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的，ZUGMAIER等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，在3次強(qiáng)化治療后完全緩解但MRD陽性的前體B-ALL患者中，經(jīng)過靶向CD19+的博納吐單抗治療后，與MRD轉(zhuǎn)陰的患者相比，MRD未轉(zhuǎn)陰患者的總生存率、無復(fù)發(fā)生存率更低，緩解期更短。目前，在AML中以MRD為基礎(chǔ)指導(dǎo)危險分層治療的研究較少，1項國外的前瞻性臨床試驗將AML患者細(xì)胞遺傳學(xué)和MFC聯(lián)合用于評估鞏固化療后MRD的情況，用來指導(dǎo)患者的緩解后治療，結(jié)果顯示，在鞏固化療后MRD陽性的中風(fēng)險患者中，異基因造血干細(xì)胞移植可以延長總生存期及無復(fù)發(fā)生存期，使其與MRD陰性患者的生存結(jié)局接近[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MRD陽性患者中，鞏固化療患者總生存率低于異基因造血干細(xì)胞移植患者，說明異基因造血干細(xì)胞移植可以改善MRD陽性患者的預(yù)后，延長其生存時間。

綜上所述，mCR后MRD陽性患者復(fù)發(fā)率高，采用MFC監(jiān)測AML患者mCR后的MRD對患者預(yù)后具有重要意義，可以早期發(fā)現(xiàn)易復(fù)發(fā)患者，為個性化地制訂緩解后治療方案提供依據(jù)。但目前以MRD為依據(jù)指導(dǎo)臨床干預(yù)措施這一觀點(diǎn)仍需要大量的前瞻性研究來證明。