楊曉芳，楊 偉，張永瑞，李文聰，杜 艷

1.云南省腫瘤醫(yī)院檢驗科，云南昆明 650118;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南昆明 650032

近年來，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(CRE)的檢出率逐年增高[1]，已成為全球面臨的嚴重公共衛(wèi)生問題之一。中國惡性腫瘤病亡率居世界前列[2]，腫瘤患者屬于感染的高危人群，一旦發(fā)生CRE，臨床治療將十分困難。不同地區(qū)病原菌的分布有其各自的特點，本文旨在對云南地區(qū)腫瘤?？漆t(yī)院患者CRE感染的臨床特征和耐藥基因型進行分析，以期為腫瘤患者CRE感染的分子流行病學(xué)研究和醫(yī)院感染防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取2015年1月至2018年12月云南省腫瘤醫(yī)院臨床科室送檢標本中檢出的31株CRE為研究對象。CRE判斷標準：美羅培南或亞胺培南的最小抑菌濃度(MIC)≥4 μg/mL或厄他培南的MIC≥2 μg/mL。

1.2儀器與試劑 美羅培南藥敏紙片購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)干粉購自杭州濱和微生物試劑有限公司；PCR所用試劑、瓊脂糖、5×Tris-硼酸(TBE)、DNA marker、凝膠染色試劑(GelRed)及引物均購自上海生工生物工程有限公司；乙二胺四乙酸二鉀購自上海化學(xué)試劑有限公司試劑一廠；哥倫比亞血瓊脂平板、MH瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)、配套的GN卡、AST-GN14卡購自法國生物梅里埃公司；恒溫金屬浴HB120-S購自大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司；ViiATM7實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；powerpac200電泳儀購自美國Bio-Rad公司。 質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3方法

1.3.1菌株復(fù)蘇 取出凍存于-80 ℃冰箱中的菌株標本恢復(fù)至室溫，用無菌鑷子夾取沾有適量細菌的紙片分區(qū)劃線接種于血瓊脂平板，于平板上做好標記后放置于37 ℃孵箱中孵育18～20 h。

1.3.2耐藥表型檢測 改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)與乙二胺四乙酸協(xié)同碳青霉烯滅活試驗(eCIM)均嚴格參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)M100-S28的操作步驟和判讀標準。

1.3.3CRE耐藥基因檢測 用煮沸法提取細菌DNA模板，PCR擴增CRE耐藥基因，包括blaKPC-2、blaSME、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48，具體引物序列見表1[3]。陽性對照為經(jīng)測序確認分別攜帶blaKPC-2和blaNDM-1的肺炎克雷伯菌，陰性對照為肺炎克雷伯菌ATCC700603。PCR 擴增體系25 μL，包括上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1 μL，擴增條件見表2。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，采用紫外凝膠成像與分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 CRE耐藥基因PCR擴增引物序列

表2 PCR擴增條件

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel2007進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布情況

2.1.1CRE菌株的類型分布 31株CRE中共檢出7種不同類型的菌株，以肺炎克雷伯菌為主要類型，有15株，占48.4%。其余依次為大腸埃希菌7株(22.6%)，陰溝腸桿菌3株(9.7%)，產(chǎn)酸克雷伯菌2株(6.5%)，弗氏檸檬酸桿菌2株(6.5%)，產(chǎn)氣腸桿菌1株(3.2%)，克氏檸檬酸桿菌1株(3.2%)。

2.1.2CRE菌株的標本來源 31株CRE分離自8種不同類型的標本，其中以尿液標本和體液標本為主要的標本來源，分別為12株(38.7%)、9株(29.0%)。其余3株(9.7%)來自痰液標本，2株(6.5%)來自血液標本，2株(6.5%)來自咽拭子標本，1株(3.2%)來自腦脊液標本，1株(3.2%)來自分泌物標本，1株(3.2%)來自引流液標本。

2.1.3CRE菌株來源患者的年齡分布 31株CRE分離自30例患者(其中1例患者分別從分泌物和血液標本中各分離出1株CRE菌株)。20～<40歲的有1例(3.3%)，40～<60歲的有15例(50.0%)，60～<80歲的有13例(43.3%)，80～100歲的有1例(3.3%)。

2.1.4CRE菌株的科室來源 31株CRE來源于多個臨床科室，其中7株(22.6%)來源于重癥醫(yī)學(xué)科，7株(22.6%)來源于泌尿外科，5株(16.1%)來源于神經(jīng)外科，5株(16.1%)來源于腹部外科，2株(6.5%)來源于結(jié)直腸外科，1株(3.2%)來源于放射治療科，1株(3.2%)來源于姑息醫(yī)學(xué)科，1株(3.2%)來源于骨科，1株(3.2%)來源于微創(chuàng)介入科，1株(3.2%)來源于胸外科。

2.1.5CRE菌株來源的疾病類型 從直腸癌、膀胱癌、顱內(nèi)腫瘤患者中分離出的CRE菌株所占比例最高，均為12.9%，見表3。

表3 CRE菌株來源的疾病類型

2.2mCIM與eCIM檢測結(jié)果 31株CRE中，mCIM陽性的有27株，占87.1%；eCIM陽性的有20株，占64.5%。mCIM和eCIM聯(lián)合初篩為產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶的CRE有7株，產(chǎn)金屬酶的CRE有20株，碳青霉烯酶陰性的CRE有4株。見表4。

2.3耐藥基因檢測結(jié)果 31株CRE中耐藥基因陽性有26株，陽性率為83.9%，其中單獨blaKPC-2陽性11株，陽性率為35.5%；單獨blaNDM-1陽性12株，陽性率為38.7%；單獨blaIMP陽性2株，陽性率為6.5%；1株肺炎克雷伯菌同時出現(xiàn)blaKPC-2和blaNDM-1兩種耐藥基因型陽性，對除阿米卡星之外的全部抗菌藥物耐藥；5株未擴增出耐藥基因。blaSME、blaVIM、blaOXA-48 3種耐藥基因型經(jīng)PCR檢測均為陰性。根據(jù)耐藥基因檢測結(jié)果，最終判斷為產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶的CRE有11株，產(chǎn)金屬酶的CRE有14株，同時產(chǎn)上述兩種酶的有1株。肺炎克雷伯菌以blaKPC-2基因型為主，占肺炎克雷伯菌的66.7%(10/15)；大腸埃希菌以blaNDM-1基因型為主，占大腸埃希菌的71.4%(5/7)。見表4。

表4 mCIM、eCIM與耐藥基因檢測結(jié)果

續(xù)表4 mCIM、eCIM與耐藥基因檢測結(jié)果

3 討 論

近30年來，CRE在全球范圍內(nèi)的分離率逐漸增加[4]。在我國，CRE的流行情況同樣十分嚴峻。全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CARSS)數(shù)據(jù)顯示，CRE的檢出率呈逐年上升趨勢，碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌(CR-KPN)分離率近5年持續(xù)上升，從2013年的4.9%上升至2017年的9.0%；且CRE分離率呈現(xiàn)地域性差異，2017年上海市和河南省CRE的分離率超過25%[1]。

腫瘤患者免疫力低下，是醫(yī)院感染的高危人群。IOANNIDIS等[5]研究發(fā)現(xiàn),使用了大劑量化療藥物的患者如長期應(yīng)用廣譜抗菌藥物,其醫(yī)院感染發(fā)生率將高達20%。腫瘤患者一旦發(fā)生CRE，會導(dǎo)致病死率升高、住院費用增加、住院時間延長等[6]，而且對于該類患者臨床可選擇的抗菌藥物十分有限。對患者所攜帶的CRE耐藥基因進行調(diào)查可以幫助臨床更好地選擇抗菌藥物。

本院分離出的CRE菌株中，以肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌為主要類型，與相關(guān)報道結(jié)果類似[7]。但本院分離出的部分少見菌，如弗氏檸檬酸桿菌、克氏檸檬酸桿菌也出現(xiàn)了CRE菌株。本院檢出CRE菌株的患者中，20～<40歲的僅有1例(3.3%)，40～<60歲的有15例(50.0%)，60～<80歲的有13例(43.3%)，說明中老年患者更易感染CRE。有研究顯示，老年腫瘤患者CRE感染后病死率高[8]。老年腫瘤患者由于各器官功能減退，腫瘤所導(dǎo)致的自身免疫力下降，以及受放化療等的影響，是并發(fā)感染的高危人群，在腫瘤患者CRE感染的防治中應(yīng)重點關(guān)注老年患者。本研究CRE分離率最高的科室是重癥醫(yī)學(xué)科及泌尿外科，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[7，9]。有研究指出，長時間住院、有創(chuàng)治療、留置導(dǎo)管等是感染CRE的危險因素[10]。本研究CRE菌株來源以尿液標本為主，與相關(guān)文獻報道的標本來源主要為痰液有所不同[11]，可能與本研究納入的部分腫瘤患者長期留置導(dǎo)尿管，尿液標本的送檢率高有關(guān)。所以在臨床診治過程中應(yīng)注意及時更換和拔除導(dǎo)尿管，減少不必要的有創(chuàng)操作，以免引起CRE感染。

本研究31株CRE菌株中耐藥基因陽性有26株，陽性率為83.9%，單獨blaKPC-2陽性11株，陽性率為35.5%；單獨blaNDM-1陽性12株，陽性率為38.7%，提示blaKPC-2和blaNDM-1是本院CRE的主要耐藥基因型，這與LI等[12]、胡瑩等[13]的研究結(jié)果相同。但本院CRE的耐藥基因型存在菌種間的差異，肺炎克雷伯菌以blaKPC-2基因型為主，大腸埃希菌以blaNDM-1基因型為主，這對于指導(dǎo)臨床用藥有一定的參考意義。本研究發(fā)現(xiàn)1株肺炎克雷伯菌同時出現(xiàn)blaKPC-2和blaNDM-1兩種耐藥基因型陽性，該菌株對除阿米卡星之外的全部抗菌藥物均耐藥，臨床醫(yī)生應(yīng)引起重視。此外，本研究以耐藥基因檢測結(jié)果為“金標準”，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶的CRE有11株，產(chǎn)金屬酶的CRE有14株，同時產(chǎn)上述兩種酶的有1株，提示臨床應(yīng)加強對產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶和產(chǎn)金屬酶菌株的檢測，這對于控制耐藥菌株傳播和指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。

綜上所述，腫瘤?？漆t(yī)院分離的CRE菌株主要來源于直腸癌、膀胱癌、顱內(nèi)腫瘤患者，感染人群主要為中老年人群，以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為主要類型，主要耐藥基因型為blaKPC-2和blaNDM-1。由于CRE菌株的傳播性強、耐藥性嚴重，應(yīng)加強院內(nèi)監(jiān)測及防控，臨床應(yīng)及時送檢標本并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果合理用藥，避免此類菌株感染的暴發(fā)、流行。