張月寧,康 媛,姬 超

陜西省第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710005

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]，早期癥狀不典型，難以及時診斷，多數(shù)患者確診時已是中、晚期，治愈率非常低，是女性腫瘤死亡的主要原因，且近年來發(fā)病率有逐漸升高趨勢[2]。研究卵巢癌的發(fā)病機制，對臨床治療具有重要意義。研究顯示，微小RNA-145(miR-145)在多種腫瘤組織中表達水平降低[3]，其可作為一種抑癌基因參與調(diào)控腫瘤細胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)[4-5]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶，能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)，可廣泛參與機體內(nèi)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，組織的發(fā)育、修復(fù)，以及炎性反應(yīng)等病理、生理過程。MMP-2及MMP-9是MMP家族中的重要成員，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[6]。本研究通過分析miR-145對卵巢癌細胞凋亡、增殖、遷移的影響，以及miR-145與MMP-2、MMP-9表達水平的關(guān)系，以期為卵巢癌的臨床治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1癌細胞株來源 將購于上海素爾生物科技有限公司的卵巢癌細胞株隨機分為3組，其中對照組為單純卵巢癌細胞株，不做其他處理，進行正常培養(yǎng)；miR-145組則是含miR-145質(zhì)粒的慢病毒轉(zhuǎn)染的卵巢癌細胞株；NC組為含NC質(zhì)粒的慢病毒轉(zhuǎn)染的卵巢癌細胞株。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將卵巢癌細胞株在含有胎牛血清的DMEM培育液中培養(yǎng)，孵箱培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。當(dāng)卵巢癌細胞生長至80%～90%時，采用胰蛋白酶消化卵巢癌細胞，800 r/min離心5 min，收集、重懸并培養(yǎng)細胞。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 將卵巢癌細胞稀釋至2×105/mL,平鋪到24孔板中，待卵巢癌細胞生長至70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。將稀釋的卵巢癌細胞分別加入含有10倍稀釋的miR-145慢病毒原液和10倍稀釋的NC慢病毒原液培養(yǎng)皿中進行轉(zhuǎn)染,48 h后熒光顯微鏡下可見卵巢癌細胞發(fā)出綠色熒光，表示轉(zhuǎn)染成功。

1.2.3檢測卵巢癌細胞凋亡情況 分別將3組卵巢癌細胞置于6孔板內(nèi)，待卵巢癌細胞生長至70%～80%時，使用100 nmol/L的培美曲塞刺激卵巢癌細胞12 h，按TUNEL試劑盒說明書進行標記染色，隨機選取視野，用高倍鏡(×400) 觀察卵巢癌細胞的凋亡情況。

1.2.4檢測卵巢癌細胞增殖情況 取3組卵巢癌細胞，稀釋為1×105/mL，培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)好的卵巢癌細胞平鋪到16孔板中，并再次進行培養(yǎng)。培養(yǎng)到一定數(shù)量后，加入CCK-8 10 μL，常溫放置30 min，檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，用于反映卵巢癌細胞的增殖數(shù)。

1.2.5檢測卵巢癌細胞遷移情況 取3組卵巢癌細胞，稀釋為1×105/mL，培養(yǎng)12 h。準備Transwell小室，上室鋪細胞外基質(zhì)水凝膠，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，靜置4 h，吸出液體，殘留液體風(fēng)干。取200 μL培養(yǎng)好的細胞接種在Transwell遷移室中。24 h后取出細胞，乙醇固定，結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡(×100)觀察，每組選5個視野觀察細胞并計數(shù)。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測卵巢癌細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平 取3組卵巢癌細胞，稀釋為1×105/mL，制備12%分離膠。將電泳裝置放置聚膠1 h，每孔分別加入標本懸液50 μg。開始電泳時電壓為90 V，當(dāng)溴酚藍進入分離膠后以120 V電泳，當(dāng)溴酚藍到達分離膠底部時終止電泳。取出分離膠，將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用甲醇浸泡5～10 s。在15 min內(nèi)用轉(zhuǎn)膜液浸泡PVDF膜，10 min內(nèi)移進轉(zhuǎn)膜槽，加入轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜槽進行冰浴，70 V、1.5 h。轉(zhuǎn)膜完成時，從轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)把PVDF膜取出，TBST緩沖液洗2次，每次10 min。將PVDF膜置于封閉液中，水平搖床密封2 h。然后把PVDF膜裝進有一抗的自制雜交袋內(nèi)，4 ℃過夜。將PVDF膜取出，用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min。孵育后，將PVDF膜用TBST緩沖液洗3次，每次10 min，沖洗完成后將PVDF膜放入對應(yīng)的二抗中常溫孵育1.5 h，輕輕晃動。待孵育結(jié)束，用TBST緩沖液洗3次，每次10 min，將ECL顯色液A液和B液按1∶1比例混合為工作液，加工作液至PVDF膜內(nèi)，放置1 min。PVDF膜檢測采用全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)。

1.2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測卵巢癌細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平 在3組卵巢癌細胞株培養(yǎng)液中加入氯仿，振蕩，離心，使溶液呈乳白色，4 ℃下1 200 r/min離心5 min，加異丙醇、75%乙醇，1 200 r/min離心5 min，干燥，-80 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系：94 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 10 min，40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌細胞凋亡情況 NC組、對照組、miR-145組卵巢癌細胞凋亡率分別為13.54%、13.73%、42.63%。與對照組、NC組比較，miR-145組卵巢癌細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與NC組卵巢癌細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 3組卵巢癌細胞凋亡情況(×400)

2.2卵巢癌細胞增殖情況 miR-145組卵巢癌細胞增殖數(shù)最低(A值為0.08±0.01)，NC組(A值為0.16±0.03)、對照組(A值為0.15±0.02)卵巢癌細胞增殖數(shù)明顯高于miR-145組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與NC組卵巢癌細胞增殖數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3卵巢癌細胞遷移情況 NC組、對照組、miR-145組卵巢癌細胞遷移數(shù)分別為(34.25±3.42)、(35.17±3.75)、(17.54±1.64)個，NC組、對照組卵巢癌細胞遷移數(shù)明顯高于miR-145組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組與NC組卵巢癌細胞遷移數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 3組卵巢癌細胞遷移情況(×100)

2.4卵巢癌細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平 Western blot結(jié)果顯示，NC組、miR-145組和對照組MMP-2蛋白表達水平分別為0.74±0.12、0.39±0.07、0.73±0.14，3組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=54.462，P<0.05)；MMP-9蛋白表達水平分別為0.43±0.11、0.26±0.09、0.44±0.12，3組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.754，P<0.05)。miR-145組MMP-2、MMP-9蛋白表達水平低于NC組、對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組與NC組MMP-2、MMP-9蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 3組卵巢癌細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達的Western blot結(jié)果

2.5卵巢癌細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，NC組、miR-145組和對照組的MMP-2 mRNA表達水平分別為0.61±0.22、0.26±0.11、0.62±0.24，3組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=234.397，P<0.05)；MMP-9 mRNA表達水平分別為0.51±0.13、0.19±0.08、0.50±0.18，3組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=165.835，P<0.05)。miR-145組MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平低于NC組、對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組與NC組MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：A為3組MMP-2 mRNA表達水平比較；B為3組MMP-9 mRNA表達水平比較；*為與miR-145組比較，P<0.05。

3 討 論

卵巢癌的發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位，僅次于宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌，但其病死率位于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[1]。卵巢癌的發(fā)病機制尚未完全明確，這導(dǎo)致其治療研究也未取得較好的成果，目前卵巢癌多采用一些常規(guī)的治療方法，如手術(shù)治療、術(shù)后化療等，但上述方法均無法有效控制腫瘤細胞的增殖和遷移。因此，找到抑制卵巢癌細胞生長、增殖、遷移的有效方法對臨床治療具有重要意義。

大量研究表明，miR-145在卵巢癌中扮演著抑癌基因的角色，卵巢癌細胞在過表達miR-145后，其體外增殖、遷移等能力均明顯下降；miR-145能明顯抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，加速卵巢癌細胞的凋亡[7-9]。本研究中，相較于NC組與對照組，miR-145組卵巢癌細胞大量凋亡、增殖減低、遷移能力減弱，與上述研究結(jié)果相同。此外，miR-145在人體多種惡性腫瘤中表達水平降低，而高表達miR-145可抑制惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進細胞凋亡[10-11]。

MMP-2及MMP-9主要通過降解細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，參與血管生長因子的形成，促進腫瘤血管新生，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6]。李文婷等[12]的動物實驗研究結(jié)果顯示，miR-145能通過下調(diào)MMP-9抑制腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移。肖雪蓮等[13]的研究結(jié)果顯示，miR-145可通過抑制wnt/β-catenin通路下調(diào)肺腺癌細胞A549中MMP-2的表達。本研究中，miR-145組卵巢癌細胞中MMP-2、MMP-9蛋白與mRNA表達水平均低于NC組和對照組，提示在卵巢癌細胞中miR-145的表達可能對MMP-2、MMP-9的表達具有一定的抑制作用，考慮miR-145可能是通過抑制MMP-2、MMP-9在卵巢癌細胞中的表達來抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移，加速卵巢癌細胞凋亡。有研究表明，miR-145的表達水平升高能明顯影響卵巢癌細胞的活性，且miR-145與卵巢癌的惡性程度關(guān)系密切，與卵巢癌的治療有效率及復(fù)發(fā)率也有一定關(guān)系[5]，說明在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，miR-145發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

綜上所述，miR-145可抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移，促進調(diào)亡，其作用機制可能與降低MMP-2、MMP-9表達水平有關(guān)，miR-145可作為卵巢癌治療的新靶點。