王紅霞 徐廣賢 （寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川750004）

CAR-T 細(xì)胞免疫療法是以T 細(xì)胞為來源，進(jìn)行體外基因修飾后回輸治療的一種過繼性細(xì)胞療法，其在識別腫瘤細(xì)胞時(shí)由于不受MHC限制，可有效避免腫瘤逃逸［1］。但長期腫瘤抗原及其他免疫抑制信號刺激導(dǎo)致CAR-T 細(xì)胞功能逐漸衰減，無法有效殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，闡明Tex 形成的具體分子機(jī)制有利于尋找逆轉(zhuǎn)CAR-T 細(xì)胞功能的最佳策略，此外，聯(lián)合其他腫瘤免疫治療方法有望進(jìn)一步延伸CAR-T細(xì)胞療法在腫瘤治療中的應(yīng)用。

1 T細(xì)胞耗竭

T 細(xì)胞耗竭（T cell exhaustion，Tex）最初用于描述慢性病毒感染時(shí)T細(xì)胞在持續(xù)抗原刺激下的一種功能異常狀態(tài)，最近報(bào)道，參與腫瘤免疫的T細(xì)胞也存在相似現(xiàn)象［2-3］。T 細(xì)胞發(fā)生耗竭時(shí)，其生物學(xué)功能主要表現(xiàn)為：抑制性受體PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等表達(dá)持續(xù)增加或同時(shí)共表達(dá)多個(gè)抑制性受體；效應(yīng)功能漸進(jìn)性降低：包括細(xì)胞因子釋放情況（IFN-γ、IL-2）與穿孔素、顆粒酶產(chǎn)生情況；增殖能力及自我更新能力（依賴于IL-7、IL-15）降低；代謝改變，耗竭性T 細(xì)胞線粒體活性降低，糖酵解受限，代謝儲備能力降低。

研究表明，耗竭性T 細(xì)胞不同于效應(yīng)性T 細(xì)胞（T effector，Teff）KLRG1+CD127?及記憶性 T 細(xì)胞（T memory，Tmem）KLRG1-CD127+等，而是具有獨(dú)特分子表型的一群異質(zhì)性細(xì)胞［4-5］。TCF-1+PD-1intTIM-3?為 Tex 祖細(xì)胞表型，TCF-1?PD-1hiTIM-3hi為終末 Tex表型，此外，CXCR5也可能作為祖細(xì)胞標(biāo)志之一［6-7］。HUDSON 團(tuán) 隊(duì)［8］最 新 發(fā) 現(xiàn) ，TCF-1?PD-1+TIM-3+CX3CR1+可能為耗竭性T 細(xì)胞中間態(tài)細(xì)胞群，這種中間態(tài)的CX3CR1+細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的程度近似Teff。阻斷 PD-1 后 TCF-1?PD-1+TIM-3+CX3CR1+細(xì)胞群增加，暗示該中間態(tài)可能是PD-1營救后主要發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的細(xì)胞群體。目前，Tex 來源尚未統(tǒng)一，可能為初始 T 細(xì)胞（na?ve T cell，Tn）接受活化信號后先分化為耗竭性T 細(xì)胞前體，前體細(xì)胞進(jìn)一步分化為中間態(tài)，最終發(fā)育為TCF-1?PD-1hi末端狀態(tài)［9］。

2 Tex分子機(jī)制

急性感染時(shí)，Tn 經(jīng)抗原活化增殖發(fā)揮殺傷效應(yīng)，約5%T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為記憶性細(xì)胞，以非抗原依賴方式進(jìn)行自我更新，當(dāng)再次接觸相同抗原時(shí)，立即進(jìn)行免疫應(yīng)答。但當(dāng)感染持續(xù)存在時(shí)，T 細(xì)胞接受慢性持久刺激，活化與分化發(fā)生異常改變。導(dǎo)致T細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)的潛在分子機(jī)制主要為：①DNA甲基化或組蛋白乙?；母淖儯缇幋a抑制性受體PD-1，以及與記憶、效應(yīng)分子等相關(guān)基因發(fā)生DNA甲基化或組蛋白乙?；?，從而影響基因表達(dá)［10-11］。GHONEIM 等［10］發(fā) 現(xiàn) DNA 甲 基 化 酶 3a（De novo methyltransferase 3a，DNMT3a）介導(dǎo)的 DNA 從頭甲基化促進(jìn)耗竭性T 細(xì)胞前體形成，給予去甲基化藥物decitabine 治療后，CD8+T 細(xì)胞耗竭得到改善，聯(lián)合PD-1 單抗治療時(shí)，小鼠腫瘤負(fù)荷降低，轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)改變。CHEN 等［4］采用淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）Arm 與C113分別制備急性及慢性小鼠感染模型，采用單細(xì)胞測序技術(shù)結(jié)合模擬分化時(shí)間預(yù)測發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞在發(fā)展為Tex 的早期階段，TCF-1起決定性作用，其潛在機(jī)制可能是通過拮抗促進(jìn)T細(xì)胞向Teff 分化的轉(zhuǎn)錄因子，而正向調(diào)節(jié)Emoes、CMyb 等與記憶及存活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)T細(xì)胞向Tex 方向發(fā)育。此外該研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 表達(dá)有助于耗竭性T 細(xì)胞前體形成，保護(hù)其因過度活化而凋亡。除TCF-1 作為促進(jìn)Tex 發(fā)展的轉(zhuǎn)錄因子外，2019年《Nature》3篇文章報(bào)道TOX同樣促進(jìn)Tex祖 細(xì) 胞 形 成［5，12-13］。 此 外 NR4A 家 族 、BLIMP-1、NFAT、Emoes、T-bet 等均參與耗竭 T 細(xì)胞生成［14-17］；②腫瘤微環(huán)境因素，包括調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）、骨髓來源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、M2 型巨噬細(xì)胞等抑制性免疫細(xì)胞，IL-10、IL-6、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，以及腫瘤細(xì)胞周圍纖維母細(xì)胞等均促進(jìn)CD8+T細(xì)胞耗竭形成［18-20］；③小分子 RNA 參與，如 miRNA-155、miR-143、miR-146a 等通過多種方式調(diào)節(jié)T 細(xì)胞記憶、效應(yīng)功能及代謝等相關(guān)基因表達(dá)［21-23］。

3 CAR-T細(xì)胞免疫療法

CAR-T 細(xì)胞療法是指通過體外對T 細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，賦予其靶向殺傷腫瘤細(xì)胞特性，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后回輸患者的一種細(xì)胞免疫療法。目前該免疫療法主要用于血液系統(tǒng)腫瘤治療，靶點(diǎn)為CD19，此外，CD20、CD22 等多靶點(diǎn)聯(lián)合治療也顯現(xiàn)出較好效果［24-26］。實(shí)體瘤治療方面，由于腫瘤特異性抗原缺乏及腫瘤微環(huán)境等因素，其應(yīng)用受阻。在研靶點(diǎn)包括 HER-2、GD2、Mesothelin、CEA、PSCA 等，主要針對乳腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，針對CAR-T 細(xì)胞在實(shí)體瘤治療方面的應(yīng)用，主要應(yīng)對策略包括：①采用基因編輯技術(shù)（ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9）改造 CAR-T 細(xì)胞。HU 等［27］與 GUO 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，敲除PD-1 后，CAR-T 細(xì)胞對肝癌細(xì)胞及Mesothelin陽性的三陰性乳腺癌細(xì)胞殺傷力明顯增強(qiáng)。此外，EYQUEM 等［29］利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)將 CAR 基因“精準(zhǔn)”遞送至 T 細(xì)胞受體（T-cell receptor α con?stant，TRAC）基因座，避免常規(guī)慢病毒載體或其他遞送方式將CAR 基因隨機(jī)插入T 細(xì)胞基因組而引發(fā)潛在細(xì)胞癌變，這種編輯方式制備的CAR-T 細(xì)胞在小鼠白血病模型中相比常規(guī)CAR-T 細(xì)胞顯現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷力；②設(shè)計(jì)多靶標(biāo)CAR。BIELAMOWICZ等［30］將HER2、IL13Rα2、EphA構(gòu)建到同一CAR框中研究其對惡性膠質(zhì)瘤的殺傷作用，結(jié)果表明其殺傷效應(yīng)優(yōu)于單獨(dú)或雙靶點(diǎn)；③聯(lián)合其他免疫療法。MA等［31］開發(fā)一種可使CAR-T 細(xì)胞在淋巴結(jié)提前進(jìn)入激活狀態(tài)的疫苗，結(jié)果顯示，該聯(lián)合治療在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌及黑色素瘤等多種小鼠腫瘤模型中均產(chǎn)生較好效果；④組成性表達(dá)IL-23、IL-7/CCL-19等細(xì)胞因子［32-33］；⑤胞內(nèi)共刺激分子選擇、制備通用CAR-T 細(xì)胞、優(yōu)化CAR-T 細(xì)胞體外培養(yǎng)體系、制備TSCM、TCM 表型 CAR-T 細(xì)胞、改善 CAR-T 細(xì)胞耗竭等對CAR-T 細(xì)胞殺傷實(shí)體瘤均有一定促進(jìn)作用［34-41］。

4 耗竭性CAR-T細(xì)胞

CHEN 等［16］和 SEO 等［17］發(fā)現(xiàn)，與 HBV/HCV 感染時(shí)出現(xiàn)的Tex 相似，腫瘤浸潤性CAR-T 細(xì)胞相較于體外制備的CAR-T 細(xì)胞，可高表達(dá)NR4A、TOX 等T 細(xì)胞耗竭相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)敲除或沉默TOX、TOX2，Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3 基因后，黑色素小鼠腫瘤負(fù)荷減小，生存時(shí)間延長，同時(shí)沉默TOX 與NR4A效果更為顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NR4A、TOX 及NFAT 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能在pdcd-1 啟動子上游約23 kb共同形成轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子復(fù)合體，從而調(diào)節(jié)pdcd-1基因表達(dá)。WEI 等［42］從細(xì)胞代謝角度出發(fā)，靶向代謝相關(guān)因子REGNASE-1，CD8+T 細(xì)胞發(fā)生重編程，擴(kuò)增能力、體內(nèi)存留時(shí)間、效應(yīng)功能等都得到提升，對小鼠白血病與黑色素瘤均顯示較好療效，可能通過影響B(tài)AFT、PTPN2 與SOCS1 等基因表達(dá)發(fā)揮作用 。 ZOU 等［43］采 用 CRISPR/cas9 技 術(shù) 同 時(shí) 敲 除PD-1、TIM-3、LAG3 免疫抑制性受體，表現(xiàn)出更佳腫瘤控制效果，具體分子機(jī)制可能為敲除抑制性受體后一方面阻斷腫瘤細(xì)胞傳導(dǎo)抑制信號，另一方面CAR-T 細(xì)胞表面 CD56 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn) CAR-T 細(xì)胞存活，改善耗竭狀態(tài)從而增強(qiáng)功能。

除腫瘤微環(huán)境因素導(dǎo)致CAR-T 細(xì)胞耗竭外，CAR-T細(xì)胞自身區(qū)別于天然T細(xì)胞，CAR 結(jié)構(gòu)引入，尤其胞內(nèi)共刺激分子不同，使制備的CAR-T 細(xì)胞因“噪聲信號”引起非抗原依賴T 細(xì)胞過度活化，導(dǎo)致Tex發(fā)生。LONG等［34］觀察到胞內(nèi)刺激分子為4-1BB時(shí)，相比CD28 CAR-T 細(xì)胞存活時(shí)間更久；LYNN等［15］發(fā)現(xiàn)，相較于 CD19-28z CAR T 細(xì)胞，HA-28z CAR T 細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的Tex，進(jìn)一步研究表明，AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子c-jun表達(dá)降低，過表達(dá)c-jun后，CAR-T 細(xì)胞增殖能力、效應(yīng)分子分泌能力提升，而分化程度、抑制性受體表達(dá)降低，小鼠腫瘤負(fù)荷降低。此外，共表達(dá)IL-15、抗PD-1 單鏈抗體，封閉TGF-β信號等方法在一定程度上可改善CAR-T細(xì)胞耗竭狀態(tài)，加速腫瘤清除［41-47］。

5 T細(xì)胞耗竭與CAR-T細(xì)胞免疫療法國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與前景

基于耗竭性T 細(xì)胞對抗腫瘤治療效果的影響，國內(nèi)外研究者開始關(guān)注Tex 營救，即免疫檢查點(diǎn)阻斷劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）的應(yīng)用，如阻斷PD-1/PD-L1信號傳遞，該方法一方面阻斷腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的抑制作用，另一方面可逆轉(zhuǎn)PD-1lo 的Tex 祖細(xì)胞并促進(jìn)其成熟分化，發(fā)揮殺傷功能［48］。目前，臨床常采取的 ICI 靶點(diǎn)包括 PD-1、CTLA-4，主要適應(yīng)癥為惡性黑色素瘤，此外也用于非霍基金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌等研究［49］。2011 年，CTLA-4 特異性抗體Ipilimumab 獲FDA 上市批準(zhǔn)，臨床數(shù)據(jù)分析顯示，5年無復(fù)發(fā)生存率為40.8%［50］；2014年，PD-1特異性單克隆抗體Opdivo、Keytruda 獲批上市，最初用于惡性黑色素瘤治療，Keytruda 五年生存率達(dá)34%［51］。HUANG 等［52］研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 療效取決于 T細(xì)胞活化效應(yīng)與患者腫瘤負(fù)擔(dān)。2016 年，PD-L1 單抗Tecentriq 獲批用于治療膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌治療等；2018 年，我國首個(gè) PD-1 單抗 Toripalimab 獲批上市，其治療黑色素瘤、肺癌、淋巴瘤等腫瘤均取得較好反響［53-54］。隨后 Sintilimab、Tislelizumab、Cam?relizumab 也進(jìn)入臨床試驗(yàn)，擬用于非小細(xì)胞肺癌、肝癌、胃癌、霍基金淋巴瘤等腫瘤治療。由于耗竭T細(xì)胞一般同時(shí)表達(dá)多個(gè)抑制性受體，臨床上采取抑制劑聯(lián)合治療，常見組合為CTLA-4 與PD-1，治療惡性黑色素瘤時(shí)五年生存率達(dá)52%［55］。PD-1 與其他抑制劑聯(lián)用也在進(jìn)一步研究中［56-58］。

CAR-T 細(xì)胞療法目前主要用于血液系統(tǒng)腫瘤治療。2012 年，EMILY WHITEHEAD 在美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)院接受腫瘤CAR-T 細(xì)胞治療，目前未復(fù)發(fā)，成為世界上第一個(gè)被CAR-T 細(xì)胞療法治愈的兒童，極大程度推進(jìn)了細(xì)胞療法在腫瘤免疫中的應(yīng)用。2017 年，F(xiàn)DA 先后批準(zhǔn) Kymriah、Yescarta 上市，適應(yīng)證為復(fù)發(fā)或難治性兒童急性淋巴細(xì)胞白血病和復(fù)發(fā)或難治性大B 細(xì)胞淋巴瘤，治療靶點(diǎn)為CD19，Kymriah 3 個(gè)月響應(yīng)率為81%，12 個(gè)月生存率76%［59］。Yescarta完全緩解率可達(dá)51%［60］。此外，包括以BCMA、CD20、CD33、CD123 為靶點(diǎn)用于多發(fā)性骨髓瘤、急性髓系白血病等研究，同種異體CAR-T細(xì)胞申報(bào)的臨床試驗(yàn)也顯示較好療效［61-62］。國內(nèi)相關(guān)研究積極跟進(jìn)，2018 年3 月，我國第一個(gè)CAR-T細(xì)胞療法臨床申請獲CFDA 批準(zhǔn)，為南京傳奇生物申報(bào)，以BCMA為靶點(diǎn)，適應(yīng)證為復(fù)發(fā)性或耐藥性多發(fā)性骨髓瘤，總反應(yīng)率為88.2%，一年總生存率為82.3%［63］。繼南京傳奇后，上海明聚生物、上海優(yōu)卡迪生物、復(fù)星凱特、銀河生物等公司相繼開展臨床試驗(yàn)。目前，全球登記的CAR-T 細(xì)胞治療臨床研究約630項(xiàng)，美國約234項(xiàng)，我國達(dá)315項(xiàng)，在研靶點(diǎn)主要以CD19 為主，BCMA 次之。與血液腫瘤相比，CAR-T 細(xì)胞療法在實(shí)體瘤研究領(lǐng)域面臨更大挑戰(zhàn)，登記的在研項(xiàng)目約30 多項(xiàng)，主要靶點(diǎn)為GD2、MUC1、EGFR、Her2 等，此外也有聯(lián)合 ICI 同時(shí)進(jìn)行治療的研究［62］。近年細(xì)胞免疫療法在血液腫瘤與實(shí)體瘤治療方面呈明顯上升趨勢，治療效果可觀，CAR-T 細(xì)胞療法更為顯著，后續(xù)對CAR-T 細(xì)胞治療的整個(gè)流程不斷優(yōu)化，有望為腫瘤患者帶來福音。

6 展望

CAR-T 細(xì)胞療法作為目前腫瘤治療中最具前景的免疫療法之一，改善其耗竭狀態(tài)將增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞功能，提升腫瘤免疫治療效果。目前，聯(lián)合治療成為腫瘤治療研究熱點(diǎn)，在一定程度上呈現(xiàn)“協(xié)同效應(yīng)”，如ICI 與CAR-T，溶瘤病毒（OVs）等兩兩組合，或前期輔助放化療、其他抗腫瘤藥物。SAMSON等［64］發(fā)現(xiàn)，瘤內(nèi)注射OVs 進(jìn)行腫瘤微環(huán)境預(yù)處理，促進(jìn)膠質(zhì)瘤周圍T 細(xì)胞浸潤，此外，輔之PD-1 封閉處理，相較于對照組，小鼠腫瘤得到明顯改善；經(jīng)改造后可分泌EGFR 雙特異性抗體的溶瘤病毒（OAd-BiTE），與CAR-T 聯(lián)用促進(jìn)T 細(xì)胞體外活化、增殖及細(xì)胞毒性，且在小鼠腫瘤模型中展現(xiàn)較好效果［65］。GULATI 等［66］表明，CAR-T 細(xì)胞與 PD-1 抗體聯(lián)合治療可加速腫瘤清除，其在MPM 患者體內(nèi)存留時(shí)間長達(dá)21 d。最近，NAKAZAWA 等［67］采用CRISPR/cas9技術(shù)敲除CAR-T 細(xì)胞表面PD-1，其對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有一定抑制作用，而T 細(xì)胞自身表型及抑制性受體表達(dá)未受影響，進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚待研究?？梢姡?lián)合治療的確增強(qiáng)了抗腫瘤效應(yīng)，未來，CAR-T、ICI、溶瘤病毒三者聯(lián)用可能成為腫瘤免疫治療的發(fā)展趨勢［68］。盡管耗竭性T細(xì)胞依然可分泌細(xì)胞毒性效應(yīng)分子，在維持長期腫瘤或感染性疾病中發(fā)揮作用，但總的來說其抗腫瘤效應(yīng)仍是局限的。因此，著力于Tex狀態(tài)改善，更深入研究CAR-T細(xì)胞耗竭，以及與其他抗腫瘤療法聯(lián)合治療將進(jìn)一步拓展CAR-T 細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用，尤其在肝癌、肺癌、乳腺癌等實(shí)體瘤治療方面。