王雅心 綜述，趙秀娟，朱鳳雪 審校

(北京大學(xué)人民醫(yī)院創(chuàng)傷救治中心 100044)

CMTM家族即趨化素樣因子(CKLF)樣含MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域超家族(CMTM)，由北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心韓文玲等率先在國(guó)際上報(bào)道[1]，利用經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激后的人髓系白血病U937細(xì)胞系分離出CKLF，通過(guò)表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)分析陸續(xù)發(fā)現(xiàn)趨化素樣因子超家族(CKLFSF)1～8。這9個(gè)在人類(lèi)中表達(dá)的新基因?qū)?yīng)的蛋白功能介于經(jīng)典趨化因子和四跨膜蛋白超家族(M4SF)之間。2005年國(guó)際人類(lèi)基因命名委員會(huì)(HUGO)依據(jù)編碼產(chǎn)物含有的MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域，將CKLFSF1～8更名為CMTM1～8，CMTM4是家族成員之一[2-3]。含MARVEL結(jié)構(gòu)域的蛋白一般都擁有四次跨膜區(qū)，參與膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞間緊密連接的形成。近幾年在腫瘤領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)CMTM4可能扮演抑癌基因的角色，表達(dá)水平的高低變化影響腫瘤細(xì)胞及相關(guān)免疫細(xì)胞的生物學(xué)功能，是潛在的癌癥免疫治療靶點(diǎn)，越來(lái)越多的研究團(tuán)隊(duì)將關(guān)注點(diǎn)投向CMTM4。

1 CMTM4的發(fā)現(xiàn)

2003年北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心利用抑制性減數(shù)雜交技術(shù)(SSH)[4-5]，從經(jīng)過(guò)PHA刺激同時(shí)IL-10抑制的U937細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CKLF，在此基礎(chǔ)上通過(guò)比對(duì)與分析，發(fā)現(xiàn)編碼234個(gè)氨基酸的CMTM4全長(zhǎng)cDNA序列，隨后采用PCR、DNA測(cè)序和Northern blot成功驗(yàn)證這一新基因的真實(shí)存在，并將CMTM4的cDNA序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。隨后，研究人員對(duì)人類(lèi)和小鼠的CMTM家族基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CMTM4的人鼠同源性在整個(gè)家族中最高，達(dá)97.6%，且在機(jī)體不同組織內(nèi)廣泛表達(dá)，這說(shuō)明CMTM4在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)人類(lèi)CMTM4含有3種剪接體v1、v2、v3，而目前在小鼠體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)CMTM4-v2的表達(dá)，與人類(lèi)有95.7%的同源性，提示在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中采用小鼠作為人類(lèi)疾病研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象具有相對(duì)可靠性[1]。

為了深入研究CMTM4的表達(dá)情況及生物學(xué)功能，該研究團(tuán)隊(duì)于2007年制備純化出具有高效價(jià)、高特異性的CMTM4多肽抗體Ab1和Ab2。Ab1特異性識(shí)別v1、v2剪接體，還可識(shí)別天然構(gòu)象的內(nèi)源性蛋白，結(jié)合小鼠內(nèi)源性CMTM4，可用于Western blot及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)；Ab2僅可用于Western blot實(shí)驗(yàn)特異性識(shí)別CMTM4-v1，不可用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)[6]。多抗的研制為后續(xù)開(kāi)展CMTM4功能研究提供可能。

2 CMTM4的結(jié)構(gòu)特征

CMTM4與CKLF、CMTM1-3緊密分布在染色體16q22.1上形成基因簇，在諸多腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)附近經(jīng)常發(fā)生基因改變，其中包含部分抑癌基因，所以該基因簇可能與抑癌作用相關(guān)[7-9]。測(cè)序結(jié)果顯示CMTM4含有v1、v2、v3三種不同剪接體，Northern blot測(cè)得蛋白分子大小依次為1.2、3.4、8.2 kb，分別對(duì)應(yīng)編碼234、208和179個(gè)氨基酸[1]，CMTM4-v2是全長(zhǎng)cDNA的產(chǎn)物，在小鼠與人類(lèi)高度同源，所以是3種剪接體中最穩(wěn)定、最保守的。在組織和細(xì)胞系內(nèi)CMTM4-v1和-v2表達(dá)頗為廣泛，而CMTM4-v3表達(dá)較局限，只在腎和胎盤(pán)中被發(fā)現(xiàn)[1,10]。NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)提供的數(shù)據(jù)顯示CMTM4在甲狀腺中表達(dá)量最高，其次為腦、腎、結(jié)腸，肝、脾、淋巴結(jié)和骨髓中表達(dá)量最少，幾乎不表達(dá)。CMTM4 屬于膜蛋白，獨(dú)特的MARVEL結(jié)構(gòu)域及在細(xì)胞質(zhì)膜、高爾基體膜及胞內(nèi)囊泡上的定位(來(lái)自The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)，https://www.proteinatlas.org/)，共同提示其可能具有調(diào)節(jié)跨膜運(yùn)輸與緊密連接形成的功能[11]，部分研究證實(shí)其調(diào)節(jié)包括血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白(VE-cadherin)和程序性死亡受體1(PD-L1)在內(nèi)的膜分子的運(yùn)輸與穩(wěn)定性，且在某些惡性腫瘤中表現(xiàn)出調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和相關(guān)免疫細(xì)胞生物學(xué)行為的作用[12-15]。

3 CMTM4在疾病中對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控

擁有特殊跨膜結(jié)構(gòu)域的CMTM家族在人類(lèi)疾病的發(fā)病、進(jìn)展過(guò)程中均扮演著重要角色。已有研究證實(shí)家族成員在免疫、造血、循環(huán)、生殖等系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移亦具有一定影響[16-21]。由于CMTM4基因在染色體上的定位附近存在一定數(shù)量抑癌基因，且利用NCBI、GEO、TCGA、TumourProfile等數(shù)據(jù)庫(kù)完成生物信息學(xué)分析后均發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤疾病中癌組織CMTM4基因表達(dá)量低于正常組織，研究者們便將關(guān)注點(diǎn)集中于探究CMTM4對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，對(duì)采集的腫瘤與正常組織標(biāo)本進(jìn)行基因和蛋白水平檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)具有表達(dá)差異——癌組織CMTM4水平低于癌旁組織。為進(jìn)一步明確該基因?qū)?xì)胞生物學(xué)行為及功能的影響，實(shí)驗(yàn)人員在體外利用基因編輯技術(shù)干預(yù)細(xì)胞CMTM4表達(dá)水平，分別從細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期、遷移與侵襲能力、細(xì)胞凋亡等方面入手進(jìn)行研究[15,22]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)其在非腫瘤疾病中也存在調(diào)節(jié)作用。以下將對(duì)已證實(shí)的CMTM4對(duì)細(xì)胞功能的影響分類(lèi)進(jìn)行闡述。

3.1 對(duì)細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響

CMTM4表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖能力具有明顯影響作用。最初，KITTLER等[23]從5 305個(gè)esiRNAs(endoribonuclease-prepared short interfering)中篩選出37個(gè)對(duì)Hela細(xì)胞增殖分裂有影響的基因，CMTM4便是其中之一，敲除CMTM4基因不會(huì)終止細(xì)胞有絲分裂，紡錘體形態(tài)正常，亦不致細(xì)胞死亡，但可導(dǎo)致有絲分裂時(shí)胞質(zhì)分裂異常，形成雙核細(xì)胞。2010年P(guān)LATE等[14]觀察到的這一現(xiàn)象開(kāi)展更加深入的機(jī)制研究，利用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)Hela細(xì)胞CMTM4基因，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞集落形成數(shù)目均明顯減少。細(xì)胞周期是影響細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制，從流式細(xì)胞分析得到的細(xì)胞周期結(jié)果來(lái)看，無(wú)論是否預(yù)先對(duì)周期進(jìn)行同步化處理，過(guò)表達(dá)CMTM4均導(dǎo)致細(xì)胞大量阻滯于G2/M期，阻止細(xì)胞增殖[14]。上述兩個(gè)團(tuán)隊(duì)的結(jié)果共同證明CMTM4對(duì)Hela細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期均產(chǎn)生影響。除明確了對(duì)Hela細(xì)胞有影響外，有學(xué)者還先后在腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)[22]和結(jié)直腸癌(CRC)[15]中得出同樣的結(jié)論，通過(guò)上調(diào)及下調(diào)細(xì)胞CMTM4基因水平，借助CCK-8及活細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察到CMTM4對(duì)786-O、HT29、SW480細(xì)胞系的增殖具有與對(duì)Hela細(xì)胞相同的影響，流式檢測(cè)也看到相同的細(xì)胞周期變化規(guī)律。

除腫瘤細(xì)胞外，荷蘭學(xué)者沉默及過(guò)表達(dá)HUVECs細(xì)胞系CMTM4基因，發(fā)現(xiàn)CMTM4表達(dá)減少對(duì)細(xì)胞增殖影響不大，但過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期[12]。這與在腫瘤中的研究結(jié)論存在差異，提示在非腫瘤性疾病中，CMTM4可能對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期發(fā)揮不完全一致的調(diào)節(jié)作用，存在分別研究的必要性。

在機(jī)制方面，目前僅有對(duì)ccRCC及CRC細(xì)胞的研究，且兩者機(jī)制并不相同。通過(guò)檢測(cè)ccRCC 786-O細(xì)胞周期調(diào)控的標(biāo)志物表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在轉(zhuǎn)錄還是翻譯水平上，CMTM4均上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控基因p21表達(dá)，上調(diào)的p21抑制Cdk1/CyclinB復(fù)合物對(duì)周期的調(diào)控作用致G2/M期阻滯，從而抑制786-O細(xì)胞增殖；另外，對(duì)參與調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞增殖的信號(hào)通路進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CMTM4降低了AKT、ERK1/2、STAT3通路磷酸化水平，從而抑制CRC細(xì)胞生長(zhǎng)[15,22]。有趣的是，在ccRCC的786-O細(xì)胞中作為p21上游分子的p53未被檢測(cè)到激活，所以CMTM4是如何上調(diào)p21的還需進(jìn)一步研究。

3.2 對(duì)細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響

BEI等[24]針對(duì)CMTM4與肝細(xì)胞肝癌(HCC)患者腫瘤臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CMTM4表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期都密切相關(guān)。隨后研究者利用劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)觀察CMTM4水平對(duì)細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響，過(guò)表達(dá)CMTM4后的ccRCC 786-O和CRC SW480其遷移與侵襲能力均明顯減弱，而下調(diào)則使CRC HT29能力增強(qiáng)。在ccRCC中，CMTM4高表達(dá)上調(diào)p21水平，通過(guò)抑制Rho GTP酶及相關(guān)信號(hào)通路影響細(xì)胞遷移；而在CRC中，CMTM4發(fā)揮的抑制作用是借助AKT、ERK1/2、STAT3通路磷酸化水平降低實(shí)現(xiàn)的，但這并不一定適用于其他腫瘤細(xì)胞，還需大量研究對(duì)機(jī)制進(jìn)行探索[15,22]。與上述研究結(jié)論不同的是，CHRIFI等[12]利用劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)CMTM4后的HUVECs并不對(duì)細(xì)胞遷移產(chǎn)生影響，但沉默會(huì)導(dǎo)致其遷移能力顯著下降。

3.3 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心先后對(duì)CMTM4過(guò)表達(dá)的HeLa細(xì)胞[14]、786-O細(xì)胞[22]和SW480細(xì)胞[15]進(jìn)行Annexin V-PI染色及流式檢測(cè)，均未觀察到細(xì)胞凋亡的發(fā)生。從現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，CMTM4分子似乎與實(shí)體腫瘤細(xì)胞凋亡并無(wú)太大關(guān)系，并不直接致細(xì)胞凋亡。

這是否代表CMTM4與凋亡不存在任何聯(lián)系呢？并非如此。ZHANG等[9]在研究miR-205對(duì)慢性腎病(CKD)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)CMTM4可使腎細(xì)胞發(fā)生凋亡。CMTM4 mRNA的3′UTR區(qū)域有兩個(gè)miR-205結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合后可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)CMTM4 mRNA活性。在體外對(duì)HK-2細(xì)胞上調(diào)miR-205表達(dá)可保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡，利用Western blot和雙熒光素報(bào)告酶基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-205的HK-2細(xì)胞時(shí)，均顯示CMTM4 表達(dá)減少。由此得知，miR-205通過(guò)減少CMTM4 表達(dá)量實(shí)現(xiàn)對(duì)腎細(xì)胞凋亡的抑制作用，CMTM4影響腎細(xì)胞凋亡，高表達(dá)的CMTM4促進(jìn)凋亡發(fā)生。

此外，MEZZADRA等[13]和BURR等[25]在Nature上分別發(fā)表了關(guān)于CMTM與PD-L1蛋白存在相互作用的文章，其共同證明CMTM6是調(diào)控PD-L1蛋白穩(wěn)定性與半衰期的關(guān)鍵分子。而在MEZZADRA等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)CMTM4作為CMTM6的替代分子，與CMTM6具有相同的功能，備用調(diào)控及保護(hù)PD-L1。MEZZADRA等[13]在實(shí)驗(yàn)中敲低12種腫瘤細(xì)胞系模型CMTM6基因，結(jié)果顯示無(wú)論是細(xì)胞固有表達(dá)的PD-L1，還是受IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的PD-L1，其蛋白水平均有2～10倍不同程度的降低；此外在免疫方面，在抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)上亦是如此。CMTM4與CMTM6有55%同源性，與PD-L1共表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞膜上，兩個(gè)基因的表達(dá)并不影響PD-L1轉(zhuǎn)錄水平，而是影響從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸出的蛋白活性，在翻譯水平進(jìn)行保護(hù)，防止其被泛素化降解，延長(zhǎng)半衰期，從而增加PD-L1在腫瘤細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞膜上的蛋白水平。該調(diào)控作用不借助IFN-γR介導(dǎo)的信號(hào)通路，亦不影響組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHC-Ⅰ)和PD-L2水平。上調(diào)的PD-L1與更多的T細(xì)胞膜上PD-1結(jié)合，負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞功能，T細(xì)胞增殖減少、凋亡增多，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。當(dāng)然，PD-1/PD-L1信號(hào)通路不僅僅影響腫瘤中T細(xì)胞功能，在細(xì)菌感染中同樣發(fā)揮重要作用[26]。所以，CMTM4可通過(guò)對(duì)PD-L1的調(diào)控，間接影響表達(dá)PD-1的T細(xì)胞發(fā)生凋亡[13,27]。

3.4 對(duì)細(xì)胞連接的影響

參與和(或)調(diào)節(jié)細(xì)胞連接的形成是跨膜蛋白最本質(zhì)的功能特性，細(xì)胞間黏附連接(AJs)對(duì)于維持血管內(nèi)皮完整性十分重要，參與血管出芽、新生血管形成過(guò)程。VE-cadherin是形成細(xì)胞間黏附連接的關(guān)鍵分子，而CMTM4正對(duì)其具有調(diào)節(jié)作用。CHRIFI等[12]沉默斑馬魚(yú)CMTM4基因，觀察到肌間血管生成障礙；胞內(nèi)免疫熒光染色顯示CMTM4不僅與VE-cadherin共定位于細(xì)胞膜上，還在胞內(nèi)共定位于循環(huán)利用VE-cadherin的Rab4+，Rab7+，EEA1+，Rab11+囊泡上，借助細(xì)胞內(nèi)吞循環(huán)運(yùn)輸通路促進(jìn)其內(nèi)化循環(huán)的同時(shí)，部分囊泡還與溶酶體結(jié)合發(fā)生降解，加快細(xì)胞膜上VE-cadherin新舊更替及AJs形成，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞連接分子的黏附力以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，但CMTM4不具備促進(jìn)VE-cadherin合成的能力，并不改變細(xì)胞總體蛋白量?？偟膩?lái)說(shuō)，CMTM4促進(jìn)VE-cadherin在細(xì)胞表面的再利用，形成黏附連接，調(diào)節(jié)血管生成和出芽。

3.5 其他

除影響體細(xì)胞功能，CMTM4對(duì)男性生殖細(xì)胞亦有調(diào)控作用。LIU等[28]根據(jù)CMTM4在睪丸中高度保守表達(dá)這一發(fā)現(xiàn)推測(cè)其在男性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮一定作用[1,14]，在對(duì)無(wú)精癥和弱精癥患者、老年患者及CMTM4基因敲除小鼠模型進(jìn)行表型變化和蛋白組學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)CMTM4表達(dá)量減少可通過(guò)抑制精子運(yùn)動(dòng)能力和頂體反應(yīng)從而降低男性生育能力。隨后研究者對(duì)CMTM4-KO小鼠的睪丸和精子進(jìn)行定量蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的蛋白基本與細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸和DNA結(jié)合有關(guān)，影響精子代謝功能；表達(dá)下調(diào)的蛋白主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、α/β-微管蛋白及肌動(dòng)蛋白的結(jié)合力和蛋白酶/蛋白酶抑制劑活性有關(guān)，阻礙精子生成過(guò)程中組蛋白向精蛋白的轉(zhuǎn)化，抑制精子活力和頂體反應(yīng)等功能，減少精子產(chǎn)生，降低精子質(zhì)量[29]。

4 小 結(jié)

既往研究證明在不同疾病背景下，CMTM4差異表達(dá)會(huì)影響某些細(xì)胞功能，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤領(lǐng)域，利用GEO、TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，再采集臨床標(biāo)本做基因及蛋白水平驗(yàn)證，均發(fā)現(xiàn)與正常癌旁組織相比，CMTM4在癌組織的表達(dá)顯著降低；利用基因編輯的動(dòng)物及細(xì)胞模型進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CMTM4高表達(dá)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等生物學(xué)行為。目前在非腫瘤性疾病領(lǐng)域的研究較少，已證實(shí)的是CMTM4參與男性不育疾病的發(fā)生；另外，CMTM4對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接具有調(diào)節(jié)作用，在發(fā)生血管滲漏、破裂、血管再生障礙的疾病中扮演重要角色。

CMTM4在臨床疾病中的研究仍處于起步階段，現(xiàn)有研究雖已在部分疾病背景下對(duì)其功能及少數(shù)機(jī)制方面有所涉及，但無(wú)論在疾病模型還是作用機(jī)制方面，均有非常大的探索空間。目前的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域，但從MEZZADRA等[13]和BURR等[25]發(fā)表在Nature上的成果來(lái)看，CMTM4可通過(guò)干預(yù)PD-L1活性及半衰期來(lái)間接影響機(jī)體的獲得性免疫功能。所以在干預(yù)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能、引發(fā)炎性反應(yīng)的疾病中，CMTM4或許會(huì)影響疾病的病理生理過(guò)程，成為一個(gè)潛在的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。CMTM4在膜上表達(dá)量的改變是否可用作診斷、分期指標(biāo)，CMTM4是否可作為藥物作用的新靶點(diǎn)用于疾病的治療，有待后續(xù)的研究來(lái)證實(shí)。另外，在機(jī)制方面，作為膜蛋白其是否存在于外分泌囊泡中干預(yù)信號(hào)物質(zhì)分泌，尚無(wú)從得知，仍存在很多空白亟待研究深入，以支持、指導(dǎo)CMTM4在臨床疾病中的應(yīng)用。