陳 杏 魏 萌

（西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，成都610083）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）作為一類累及全球人口約1% 的系統(tǒng)性炎癥疾病，以多關(guān)節(jié)、對稱性、侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要癥狀，疾病發(fā)展后期可致關(guān)節(jié)畸形甚至殘疾［1］。對RA 的致病機制進行較為全面的了解，有助于研發(fā)更為有效的治療藥物，為廣大患者帶來希望。基因和環(huán)境因素傳統(tǒng)地被認為是導(dǎo)致RA 疾病的兩大因素，然而近年來隨著表觀遺傳學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的研究表明了表觀遺傳學(xué)也參與了RA 致病過程［2］。表觀遺傳學(xué)對外界刺激因子做出反應(yīng)，在基因與環(huán)境之間形成橋梁，通過調(diào)節(jié)基因表達從而影響免疫系統(tǒng)的活動性。表觀遺傳改變，如DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 等，主要通過調(diào)節(jié)基因表達參與自身免疫性疾病的發(fā)病機制。其中DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)中研究熱點，它是指以不改變基因序列為前提，在DNA 甲 基 化 轉(zhuǎn) 移 酶（DNA-methyltransferase，DNMT）的作用下，在基因組CpG 二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結(jié)合1 個甲基基團，大量研究表明其通過染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性、DNA構(gòu)象、DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變可影響基因的表達［3-4］。DNA 甲基化通過調(diào)節(jié)基因的表觀沉默以及部分類型的細胞行為，在RA 發(fā)生、發(fā)展的各個階段發(fā)揮作用，其在RA 發(fā)展中的潛在作用引起了臨床醫(yī)生和研究人員的極大關(guān)注［5］。

RA 是一種慢性自身免疫性疾病，其中成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）通過與滑膜中浸潤的免疫細胞相互作用在RA 患者免疫應(yīng)答的啟動和持續(xù)過程中起著至關(guān)重要的作用，最終促進了關(guān)節(jié)軟骨退化及近關(guān)節(jié)骨組織的侵蝕；而外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），如T 淋巴細胞和B 淋巴細胞通過與FLS 相互作用參與了RA 慢性炎癥的持續(xù)。針對這些在RA 致病過程中有著重要意義的細胞類型，學(xué)者們對這些細胞進行了DNA 甲基化的研究，得到了一系列關(guān)于致病基因的甲基化狀態(tài)信息。本文將對一些重要細胞類型的甲基化研究進行總結(jié)，進一步探索表觀遺傳學(xué)在RA 致病機制中的作用，同時為尋找RA潛在的生物標志物提供線索。

1 FLS

FLS 在RA 滑膜病變和關(guān)節(jié)破壞中起著關(guān)鍵的作用。以間充質(zhì)成纖維母細胞樣滑膜細胞為主的FLS 通過釋放促炎細胞因子、趨化因子刺激軟骨細胞分泌金屬蛋白酶，從而降解了包括軟骨和軟骨下骨在內(nèi)的所有結(jié)締的組織成分，加重關(guān)節(jié)的破壞。對FLS 的DNA 甲基化進行深入研究可有助于揭示FLS在RA中作用的致病基因及其致病機制，從而尋找新的治療靶點［6］。

目前為止，全基因組關(guān)聯(lián)研究已識別出100多個RA 發(fā)生的風(fēng)險基因［7］。RA 表觀遺傳學(xué)與轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)合有助于對DNA 甲基化在基因表達中產(chǎn)生的影響及相互聯(lián)系有更深的理解，從而促進表觀遺傳學(xué)在RA發(fā)病機制的研究發(fā)展。RA FLS的表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和序列變異的數(shù)據(jù)綜合分析共鑒定出2375 個差異甲基化基因、2947 個差異表達基因、74 個風(fēng)險基因，通路分析發(fā)現(xiàn)357 組基因與RA 的致病過程密切相關(guān)［8］。其中，肢芽和心臟發(fā)育（limb bud and heart，LBH）基因被認為是與RA 發(fā)生、發(fā)展關(guān)聯(lián)最強的基因。LBH 通過在細胞分裂周期G1 期阻止細胞分裂調(diào)控FLS 增殖，而LBH 低表達可能通過G1-S 期轉(zhuǎn)化促進FLS 增殖而成為RA 風(fēng)險基因［9］。 芯片 轉(zhuǎn) 錄組 分 析顯 示，LBH 在 骨 關(guān)節(jié) 炎（osteoarthritis，OA）FLS中的表達是RA FLS的1.9倍，LBH 在RA 和OA 之間的表達差異恰好解釋了RA 滑膜增生比OA 更嚴重的原因，因此通過促進LBH 在FLS 中的表達抑制FLS 增殖，從而緩解關(guān)節(jié)滑膜炎的癥狀，可能是新的治療靶點［8］。

DNA 甲基化和轉(zhuǎn)錄組不僅在RA 和OA FLS 中有顯著差異，在RA髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)FLS中也存在顯著差異。DNA甲基化芯片鑒定出500個差異甲基化基因，其中285 個基因呈過度甲基化，210 個基因呈低甲基化，5 個在RA 膝關(guān)節(jié)FLS 中同時存在有過度甲基化和低甲基化的CpG 位點的基因［10］。此外，為了鑒定髖關(guān)節(jié)與膝關(guān)節(jié)FLS的甲基化差異是否可導(dǎo)致其功能差異，RNA 測序鑒定出107 個差異甲基化基因和若干條生物信號通路，發(fā)現(xiàn)在RA 與OA FLS中具有差異性的IL-6 信號通路在RA 髖關(guān)節(jié)與膝關(guān)節(jié)中也具有差異性，不僅如此，IL-6 在RA 髖關(guān)節(jié)的表達量是膝關(guān)節(jié)的10.8 倍，而炎癥通路在RA 髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的表達差異導(dǎo)致其在髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的炎癥和免疫反應(yīng)也有差異［10］。這提示了RA 不同受累關(guān)節(jié)可能具有不同致病機制，RA 患者膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)的甲基化組和轉(zhuǎn)錄組差異可能導(dǎo)致其對高度靶向制劑治療反應(yīng)具有一定的差異性。

2 PBMC

RA 的初始疾病階段與先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的改變相關(guān)，兩大免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生針對各種分子包括修飾的自我表位的自身抗體而加重自身免疫反應(yīng)。在疾病的進展階段，先天性免疫系統(tǒng)相關(guān)細胞（如樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞）和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的相關(guān)細胞（如T 淋巴細胞和B 淋巴細胞）與FLS 相互作用而參與慢性炎癥狀態(tài)的加重和持續(xù)［11］。

以淋巴細胞為主的PBMC 某些關(guān)鍵致病基因與疾病發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)RA患者PBMC中人類突 變 同 源 基 因1（human mutL homolog 1 gene，hMLH1）啟動子呈異常超甲基化狀態(tài)，這種狀態(tài)影響hMLH1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，使錯配修復(fù)蛋白基因功能喪失，最終導(dǎo)致RA 的發(fā)生發(fā)展［12］。而目前DNA甲基化在外周血中的研究主要是針對PBMC 中單一類型細胞如T 淋巴細胞、B 淋巴細胞，有助于進一步了解RA表觀遺傳學(xué)在免疫學(xué)中的發(fā)病機制。

2.1 DNA 甲基化在T 淋巴細胞中的研究 有研究者通過將RA 患者外周血提取的各免疫細胞與健康對照組對比，發(fā)現(xiàn)RA 患者FLS 中的高甲基化CpG位點與其在外周血中CD4幼稚T淋巴細胞的高甲基化CpG位點相似［13］。這些相似的高甲基化CpG位點可能成為代表RA風(fēng)險或疾病狀態(tài)的生物標志物。

同時，DNA 甲基化通過與免疫通路相互作用可參與到炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。例如，細胞因子IL-6可增加DNMT1的表達，其表達水平與T 淋巴細胞中的DNA 甲基化程度密切相關(guān)，且DNA 甲基化可調(diào)節(jié)T 淋巴細胞的分化、活化和遷移，而T 淋巴細胞活化又可導(dǎo)致IL-2 啟動子的去甲基化，從而使IL-2 基因表達增加［14］。因此，免疫通路與DNA 甲基化相互作用促進了RA 炎癥反應(yīng)的發(fā)展，而這些關(guān)聯(lián)可能通過DNA 甲基化介導(dǎo)、影響基因表達的調(diào)控、對抗原刺激的反應(yīng)或選擇性剪接，從而導(dǎo)致RA 易感性增加［15］。

此外，隨著甲基化450 k 芯片的推進，一項研究將RA 患者和健康對照組PBMC 的全基因組DNA 甲基化和mRNA 表達譜進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)若干個與RA 相關(guān)的干擾素調(diào)控基因，其中核糖多聚酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP9）基因甲基化差異最為顯著，基因驗證實驗發(fā)現(xiàn)PARP9 表達減少可使細胞分裂停留在細胞分裂周期G1期，而過表達可促進Jurkat T 淋巴細胞的增殖，同時通過正向調(diào)控IL-2的分泌而參與炎癥反應(yīng)和RA免疫應(yīng)答［16］。

2.2 DNA 甲基化在B 淋巴細胞中的研究 免疫細胞的表觀遺傳調(diào)控對RA 等自身免疫性疾病的發(fā)生和維持至關(guān)重要。B 淋巴細胞通過表達自身抗體加重自身免疫反應(yīng)而與RA 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，表觀遺傳變異，如DNA 甲基化，則可能介導(dǎo)了B 淋巴細胞的致病性。一項研究使用甲基化450 k 芯片，對RA 組和健康組的B 淋巴細胞進行DNA 甲基化對比分析，發(fā)現(xiàn)一系列的差異甲基化基因，且通過與另一組系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）/健康對照組甲基化圖譜分析，發(fā)現(xiàn)基因間區(qū)chr10p12.31 在兩組實驗中具有相似性，這一研究揭示了可能驅(qū)動RA 中B 淋巴細胞致病活性的基因，并提示了RA 與SLE 可能有共同的甲基化模式，表明DNA 甲基化在自身免疫性疾病的可能有共同的作用模式［17］。

此外，DNA 甲基化在免疫反應(yīng)中的細胞分化過程中也有體現(xiàn)。DNA 甲基化特征在激活的B 淋巴細胞后代中被大量保留，產(chǎn)生的記憶B 淋巴細胞和漿細胞中顯示出類似的表觀遺傳特征，其中發(fā)現(xiàn)DNMT 在記憶B 淋巴細胞中高度表達，而與免疫相關(guān)的基因則表現(xiàn)出了獨特的DNA甲基化模式［18］。

3 DNA甲基化在治療領(lǐng)域中的研究

表觀遺傳學(xué)不僅在RA 發(fā)病機制研究上有所進展，在治療領(lǐng)域也有所突破。一些已廣泛用于治療血液腫瘤疾病的藥物如5-雜氮-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-AzadC）可 抑 制DNA 甲 基 化，microRNA-124a基因通過編碼非編碼小RNA抑制細胞增殖，在RA FLS 中呈現(xiàn)出過度甲基化。ZHOU等［19］通過將5-AzadC 處理RA FLS 抑制其DNMT 活性，導(dǎo)致DNA 去甲基化，進而使染色質(zhì)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合促使miroRNA-124a 基因表達增加。因此，5-AzadC 通過抑制RA FLS 增殖有望在RA 治療領(lǐng)域中為表觀遺傳學(xué)開啟新的研究方向。

通常，發(fā)生在啟動子區(qū)域的過度甲基化與基因表達沉默相關(guān)，而有時某些位點的過度甲基化可增強其所在基因?qū)λ幬锏姆磻?yīng)性，提高治療藥效。MAESHIMA 等［20］通過計算與實驗相結(jié)合的方法，在酪氨酸蛋白磷酸酶非受體11 型基因（tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11，PTPN11）中發(fā)現(xiàn)了1 個內(nèi)含增強子，該片段包括兩個RA FLS 與OA FLS 相比下高度甲基化的CpG 位點（CpG 6/CpG 7），且對糖皮質(zhì)激素受體有特異性應(yīng)答；不僅如此，高度甲基化的6 號和7 號CpG 位點通過增強內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的增強子激活性來促進PTPN11 的轉(zhuǎn)錄，進而導(dǎo)致了RA FLS 中酪氨酸磷酸2（tyrosine phosphatase 2，SHP-2）的過表達；骨髓重建實驗中發(fā)現(xiàn)SHP-2 的過表達促進了K/BxN 關(guān)節(jié)炎，而使用SHP-2 抑制劑治療可減少RA FLS 的遷移，以及對腫瘤壞死因子和IL-1β 刺激的反應(yīng)，從而降低小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴重程度。通過對致病基因的異常表觀遺傳學(xué)特征影響FLS 生物學(xué)行為，靶向抑制SHP-2 的表達可緩解關(guān)節(jié)炎的癥狀，且不會影響高甲基化CpG 6/CpG 7 對糖皮質(zhì)激素受體的特異性應(yīng)答，這可能是RA新的治療策略。

研究發(fā)現(xiàn)，在使用緩解病情的抗風(fēng)濕藥物治療的早期RA 患者中，T 淋巴細胞、單核細胞、B 淋巴細胞顯現(xiàn)出普遍的DNA 低甲基化，同時DNMT1 呈現(xiàn)出低表達趨勢。不僅如此，TET（ten-eleven translocation）蛋白1、TET蛋白2、TET蛋白3等涉及DNA 去甲基化的酶呈現(xiàn)出過表達趨勢。而通過甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）進行治療后，發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞和單核細胞的甲基化程度降低，B 淋巴細胞整體甲基化程度增加，且DNMT1 和DNMT3A 的表達有逆轉(zhuǎn)下降的趨勢［21］。這一結(jié)果說明RA患者的DNA 低甲基化對某些血細胞亞群具有特異性，并通過MTX 治療能夠逆轉(zhuǎn)，而這些變化伴隨著與甲基化有關(guān)的酶水平的平行變化，表明在這一水平上的可調(diào)控性。

有臨床研究表明，接受及時有效的治療后病情持續(xù)緩解的RA 患者出現(xiàn)長期殘疾甚至死亡的可能性較小，但同時有高達40%的患者在接受治療2年后仍無效，這一部分患者在炎癥期間由于沒有對藥物治療產(chǎn)生反應(yīng)而增加了殘疾的風(fēng)險［22-23］。盡早識別與患者治療反應(yīng)相關(guān)的生物標志物可及時為患者制定個人化治療方案。為探討抗風(fēng)濕藥物治療療效是否與DNA 甲基化有關(guān)，一項研究利用甲基化450 k 芯片對患者在接受抗風(fēng)濕病學(xué)藥物前后的T淋巴細胞進行全基因組DNA 甲基化分析，發(fā)現(xiàn)其中有6個CpG 位點在對藥物治療有反應(yīng)和無反應(yīng)者之間呈現(xiàn)出明顯差異的甲基化，并且發(fā)現(xiàn)血小板反應(yīng)蛋白基序的解體蛋白和金屬蛋白酶2（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 2，ADAMTSL2）以及嗜丁基蛋白亞家族3 成員A2（butyrophilin subfamily 3 member A2，BTN3A2）基因中的兩個CpG 位點與治療反應(yīng)密切相關(guān)，提示藥物治療療效與某些位點的甲基化狀態(tài)相關(guān)［24］。此外，在一項將DNA 甲基化作為RA 腫瘤壞死因子抑制劑（tumor necrosis factor inhibitor，TNFi）治療反應(yīng)的生物標志物的全表觀基因組關(guān)聯(lián)分析研究中，觀察到在無治療反應(yīng)者中低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白的伴侶蛋白1 基因（low-density lipoprotein receptor-associated protein chaperone1，LRPAP1）的7 號外顯子中的4個CpG 位點的甲基化程度高于良好治療反應(yīng)者［25］?？梢园l(fā)現(xiàn)，治療反應(yīng)效果與某些基因位點甲基化程度相關(guān)。在制定治療方案前，若能結(jié)合患者病情和相關(guān)基因甲基化情況，針對性選擇患者治療反應(yīng)敏感的藥物，可使治療效果達到最佳，且為患者節(jié)省大量治療時間，提高患者治愈率。然而治療反應(yīng)效果受多因素影響，且預(yù)測算法包含了對一組生物標志物的評估，這些標志物可能包括表觀遺傳、遺傳和轉(zhuǎn)錄因子和血清學(xué)，評估治療反應(yīng)時還需考慮足夠多的生物標志物，因此這可能成為DNA甲基化作為評估治療反應(yīng)的生物標志物的一大局限性［25］。

4 DNA甲基化作為病情判斷的生物標志物

DNA 甲基化通過對某些關(guān)鍵致病基因進行甲基化修飾，影響其基因表達而在RA 致病過程中發(fā)揮作用，且RA 呈慢性進行性發(fā)展，在疾病發(fā)展的各個階段可能具有特定的甲基化特征，因此識別這些特有的甲基化特征有助于對疾病發(fā)展的程度及預(yù)后做出準確的判斷。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）和雙特異性蛋白磷酸酶22（dual specificity protein phosphatase 22，DUSP22）基因啟動子的低甲基化區(qū)域分別與RA 活動性和侵蝕性相關(guān)，而SHROOM1 基因在RA 早期與進展期FLS 中差異甲基化最為明顯，提示基因甲基化與RA 疾病病情進展的關(guān)系密切［26-27］。此外，RA 作為以慢性全身炎癥為特征典型的炎癥關(guān)節(jié)炎，已有研究報道中性粒 細 胞/淋 巴 細 胞 比 值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）可能成為冠心病、腫瘤以及自身免疫性疾病如RA、大動脈炎等疾病發(fā)展的系統(tǒng)性炎癥標志物［28-29］。研究發(fā)現(xiàn)從外周血DNA中提取獲得的甲基化NLR（methylation-derived neutrophil to lymphocyte ratio，mdNLR）指數(shù)可以作為一種研究工具來評估近期發(fā)生且未經(jīng)過治療的慢性系統(tǒng)性炎癥（systemic inflammation，SI），mdNLR 與共變量（年齡、性別、吸煙狀態(tài)）相比，在區(qū)分新發(fā)RA 病例和對照組方面表現(xiàn)更好，用DNA甲基化數(shù)據(jù)評估的SI可作為RA 近期發(fā)病的標志［30］。DNA 甲基化作為RA 新的生物標志物及評價SI 的可能性促進了表觀遺傳學(xué)在臨床研究中的應(yīng)用與發(fā)展。

在技術(shù)手段上，檢測DNA 甲基化的樣本來源廣泛，幾乎所有的組織樣本和體液都可以用來分析DNA 甲基化，包括福爾馬林固定石蠟包埋組織、血斑、頰上皮、外周血、支氣管吸入物、唾液和尿液等［31］。廣泛的檢測標本使這一技術(shù)應(yīng)用到臨床工作中成為可能。然而，DNA 甲基化這一生物標志物在應(yīng)用于臨床之前仍面臨著許多問題：首先，缺乏統(tǒng)一標準的全基因組高通量技術(shù)，降低了DNA 甲基化分析的可信度；其次，DNA 提取和DNA 定量的效率可能會影響到最終結(jié)果的分析［32］。因此，將DNA甲基化應(yīng)用于臨床之前，逐一克服這些局限性可使表觀遺傳學(xué)更好地服務(wù)于臨床工作。

5 小結(jié)與展望

本文通過對DNA甲基化在FLS和PBMC中的研究以及治療領(lǐng)域進行了闡述總結(jié)，揭示了某些致病基因的異常甲基化狀態(tài)及其致病機制，為RA 治療提供了新的研究方向。此外，在RA 發(fā)展的各個階段鑒別出了有意義的顯著差異甲基化基因，有望成為判斷RA 病情的生物標志物。然而，在DNA 甲基化應(yīng)用到臨床研究中還將面對很多挑戰(zhàn)，鑒定出的差異甲基化基因還需經(jīng)過更多的實驗研究驗證。通過對DNA 甲基化在RA 中致病機制的深入研究，有助于我們理解表觀遺傳學(xué)在RA 發(fā)病機制中的發(fā)揮的作用，并有利于尋找新的治療靶點［33］。