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        非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白CD2v的功能研究進(jìn)展①

        2021-03-29 02:30:23沈宇清
        中國免疫學(xué)雜志 2021年22期

        王 曼 沈宇清

        (東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,南京210000)

        非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)類屬非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬,是一種有包膜的、核衣殼呈二十面體對稱形態(tài)的病毒。ASFV基因組由線性的雙鏈DNA 組成,大小為170~193 kbp。其中包含150~167個開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼150~200 種蛋白質(zhì)。ALEJO 等[1]利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出68種病毒蛋白,僅占基因組編碼能力的39%。這些蛋白在病毒組裝、基因轉(zhuǎn)錄和RNA 修飾、維護(hù)基因組完整性、入侵宿主和免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用。

        ASFV 的感染與傳播途徑為野豬-軟蜱-家豬。首先是疣豬、叢林豬等因為某種不明確的途徑被感染,軟蜱叮咬被感染豬而攜帶病毒,繼而叮咬家豬后將病毒傳播給家豬。在傳播過程中,疣豬等天然宿主的臨床癥狀很輕,而家豬感染后會出現(xiàn)急性出血熱,病死率很高。軟蜱作為病毒的生物載體和貯藏庫對病毒的傳播起關(guān)鍵作用。

        ASFV 的致病機制十分復(fù)雜,目前尚未完全解析。ASFV 的主要宿主細(xì)胞是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,也能感染樹突狀細(xì)胞。它通過宿主巨噬細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨噬細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。病毒進(jìn)入內(nèi)體中,在內(nèi)體內(nèi)發(fā)生脫殼,病毒核酸物質(zhì)通過微管系統(tǒng)遷移到病毒工廠進(jìn)行復(fù)制[2-3]。感染的巨噬細(xì)胞還可能通過分泌IL-1α、TNF-α 等細(xì)胞因子來誘導(dǎo)未感染的T、B 淋巴細(xì)胞大量凋亡,從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能受損[4-5]。

        目前,ASFV 中的p72、p30、p54 等蛋白的研究進(jìn)展已被許多綜述提及,而本文主要關(guān)注的是ASFV的CD2v 蛋白[6-7]。CD2v 是由ASFV 的EP402R 基因編碼的病毒外膜糖蛋白,也被稱為pEP402R。它由402個氨基酸(amino acid,aa)構(gòu)成,預(yù)測的蛋白質(zhì)大小為46.5 kD[8]。因其aa 序列與T 淋巴細(xì)胞表面黏附受體CD2 具有很高的相似性,被認(rèn)為是CD2 的同源物。CD2v在促進(jìn)病毒復(fù)制與傳播、病毒免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用,也是ASFV 疫苗研究的熱點靶標(biāo)。

        1 ASFV包膜蛋白CD2v的結(jié)構(gòu)特征

        CD2v 是一種病毒包膜蛋白,其結(jié)構(gòu)被分為4 個結(jié)構(gòu)域:①20 個aa 構(gòu)成的N 端信號肽結(jié)構(gòu)域[9];②183 個aa 構(gòu)成的胞外結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域存在高度的糖基化現(xiàn)象[10];③25 個aa 構(gòu)成的疏水跨膜區(qū)域;④174 個aa 構(gòu)成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)ASFV 入侵宿主細(xì)胞后,CD2v 會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中被切割,經(jīng)切割后產(chǎn)生的63 kD 的N 端以糖基化形式存在,而26 kD的C端以非糖基化形式存在[10]。

        測序結(jié)果顯示,CD2v與CD2的胞外結(jié)構(gòu)域具有很高的相似性,但胞內(nèi)區(qū)域序列的相似性較低。CD2v C 端包含11 個重復(fù)的六肽序列PPPKPC,為CD2v 的特有序列。在C 端還存在一段富含脯氨酸的酸性結(jié)構(gòu)域,其功能尚未被解析。

        2 CD2v在ASFV致病機制中的作用

        2.1 介導(dǎo)紅細(xì)胞吸附,促進(jìn)病毒的體內(nèi)播散 大多數(shù)的ASFV 毒株都能誘導(dǎo)紅細(xì)胞吸附,其特征是豬紅細(xì)胞黏附在病毒感染細(xì)胞的表面,從而使得感染細(xì)胞能夠隨著紅細(xì)胞傳播。RODRíGUE 等[9]發(fā)現(xiàn)CD2v 的破壞會抑制ASFV 感染細(xì)胞與豬紅細(xì)胞的黏附能力,說明CD2v 在介導(dǎo)感染細(xì)胞與紅細(xì)胞黏附中起主要作用,借此參與病毒的體內(nèi)播散。

        CD2v能夠增加軟蜱中病毒的復(fù)制。ASFV可以在軟蜱體內(nèi)復(fù)制,存活時間長達(dá)3~5年,并可通過軟蜱叮咬傳播給家豬等易感動物。ROWLANDS 等[11]發(fā)現(xiàn)天然低毒性ASFV 分離株NH/P68 基因組中CD2v 基因被破壞。他們通過在NH/P68 中過表達(dá)CD2v 基因,使其恢復(fù)了紅細(xì)胞吸附表型,并發(fā)現(xiàn)重組病毒在軟蜱中能夠建立持續(xù)感染,證明了CD2v蛋白具有介導(dǎo)紅細(xì)胞吸附并增加ASFV 在宿主中傳播功能。

        2.2 協(xié)助病毒定位病毒工廠,促進(jìn)病毒的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制 CD2v的C端序列能夠幫助ASFV定位在病毒工廠(viral factory,VF)區(qū)域附近從而促使病毒的復(fù)制。在病毒的復(fù)制周期中,病毒在離散的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行蛋白翻譯和結(jié)構(gòu)組裝,該區(qū)域被稱為“病毒工廠”。其定位特點為在工廠的外圍分布著磷酸化的翻譯起始復(fù)合物eIF4F。ASFV 晚期mRNA 以及核糖體、線粒體等細(xì)胞器也位于這些區(qū)域[12]。VF位于靠近細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)中,由中間絲蛋白Vimentin所包繞[13]。GOATLEY 等[10]將V5 標(biāo)簽插在CD2v 基因的5'端,將HA 標(biāo)簽插在CD2v 基因的3'端,構(gòu)建成質(zhì)粒SV5CD2vHA。同時還構(gòu)建了1 個刪除了大部分胞內(nèi)序列的突變質(zhì)粒SV5CD2v-cytoHA。他們將2 種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后用ASFV BA71V 病毒毒株進(jìn)行感染,18 h后分別用抗V5抗體、抗HA抗體和抗VP72 抗體(針對ASFV 主要衣殼蛋白的抗體)對表達(dá)SV5CD2vHA 蛋白和SV5CD2v-cytoHA 蛋白的細(xì)胞進(jìn)行染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SV5CD2vHA蛋白無論是用抗V5 抗體還是用抗HA 抗體檢測,都與用抗VP72 抗體鑒定的病毒工廠共定位,而SV5CD2v-cytoHA 蛋白并沒有出現(xiàn)與病毒工廠共定位現(xiàn)象。因此推測SV5CD2v-cytoHA 中缺失的胞質(zhì)片段是CD2V蛋白定位在VF所必需的,即CD2v的C端序列能夠幫助其定位在VF附近,從而促進(jìn)病毒的復(fù)制。

        2.3 影響病毒的體內(nèi)復(fù)制,但不影響病毒的毒力8-DR 和EP402R 均為編碼CD2v 的基因名稱。BROCA 等[14]構(gòu)建了ASFV 分離株Malawi Lil-20/1 的基因缺失突變體Δ8-DR 及其回復(fù)突變體8-DR.R。在體外,Δ8-DR、8-DR.R 和親本病毒在豬巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中表現(xiàn)出難以區(qū)分的生長特征。為了更詳細(xì)地比較它們致病力的差異,BROCA 等[15]將3 株病毒分別感染模型動物。在感染后2 d、4 d、6 d 和8 d處死動物并收集組織樣本,測量其中病毒的滴度。他們發(fā)現(xiàn)感染了Δ8-DR 病毒的豬淋巴組織和骨髓中病毒滴度較野生豬和8-DR.R 低,這表明CD2v 在一定程度上影響了病毒的體內(nèi)復(fù)制能力。但是他們也發(fā)現(xiàn)Δ8-DR、8-DR.R和親本病毒在模型動物的疾病發(fā)作、病程和死亡率上都相似,因此CD2v 不影響病毒的毒力。與此一致的是,BROCA 等[15]發(fā)現(xiàn)從 ASFV 分離株Georgia2010 的基因組中刪除8DR基因(ASFV-G-Δ8-DR)并不會顯著改變病毒的毒力。他們證實感染ASFV-G-Δ8-DR 與親本病毒的動物臨床癥狀非常相似,只是在病毒滴度上顯示出一些差異。除此之外,RAQUEL等[16]發(fā)現(xiàn)低毒性ASFV分離株NH/P68 除了包含8DR 的突變外,它還具有MGF360和505基因的缺失。已有研究表明MGF360和505 基因與ASFV 的毒力密切相關(guān),這可能才是NH/P68 株毒力降低的主要原因[17]。綜上所述,雖然CD2v 影響病毒的體內(nèi)復(fù)制,但并不影響病毒的毒力。

        2.4 參與病毒的免疫逃逸 CD2v 的C 端的重復(fù)序列PPPKPC與SH3P7蛋白的相互作用可能參與ASFV的免疫逃逸。KAY-JACKSON等[18]利用酵母雙雜交系統(tǒng),將SH3P7基因分別與CD2vi(編碼221 aa~342 aa,包含C 端的重復(fù)序列)、CD2vii(編碼221 aa~306 aa,不包含C端的重復(fù)序列)、CD2viii(編碼297 aa~335 aa,僅包含C端的重復(fù)序列)基因共轉(zhuǎn)化酵母,通過檢測β-糖苷酶的表達(dá)來定位CD2v 與SH3P7 相互作用的區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有CD2vi 和CD2viii 出現(xiàn)了陽性的相互作用,說明CD2v通過C端的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)與SH3P7 相互作用。SH3P7 是一種多功能的銜接蛋白,它能夠偶聯(lián)細(xì)胞膜受體與肌動蛋白細(xì)胞骨架參與淋巴細(xì)胞的活化,能夠通過GTPase依賴性方式定位在肌動蛋白組裝的位點、細(xì)胞生長的區(qū)域和細(xì)胞運動的前沿,也能調(diào)節(jié)JNK1 的信號傳導(dǎo)過程從而激活轉(zhuǎn)錄因子[19-20]。由于SH3P7 與肌動蛋白組裝和高爾基體囊泡運輸有關(guān),因此CD2v 與SH3P7 的相互作用可能參與ASFV 感染的細(xì)胞中肌動蛋白絲的重排和高爾基體的功能,影響多種免疫分子包括細(xì)胞因子、黏附因子和主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)等的運輸,從而影響免疫系統(tǒng)的識別[21]。

        CD2v 與AP-1 的相互作用在免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。AP-1 是一種銜接蛋白,參與了蛋白質(zhì)從高爾基體到內(nèi)體的轉(zhuǎn)運[22]。它能募集網(wǎng)格蛋白形成囊泡并通過識別膜蛋白胞質(zhì)尾部的分類信號在胞內(nèi)的“ 貨物”分類轉(zhuǎn)運中起關(guān)鍵作用。 PéREZNú?EZ 等[23]發(fā)現(xiàn)CD2v 的羧基末端能夠與AP-1 結(jié)合,并且在ASFV 的感染過程中與AP-1 共定位在病毒工廠的周圍。AP-1 已被證明能夠與多種病毒蛋白包括HIV-Nef 和BPV-E6 結(jié)合。這種相互作用被認(rèn)為能夠破壞宿主細(xì)胞胞內(nèi)一些物質(zhì)運輸,在病毒感染細(xì)胞的免疫逃逸方面發(fā)揮作用。如在HIV 的感染中,AP-1 與HIV-Nef 蛋白的結(jié)合能夠?qū)HCⅠ隔離在細(xì)胞質(zhì)中,降低胞膜表面MHCⅠ類分子的表達(dá),從而使病毒感染細(xì)胞逃脫CTL 細(xì)胞的殺傷[24]。因此推測CD2v 和AP-1 的相互作用在ASFV 的免疫逃逸中具有重要作用,但目前尚缺乏相關(guān)實驗證據(jù)。

        3 CD2v在ASFV疫苗研究中的應(yīng)用

        3.1 基于CD2v 的ASFV 疫苗研究 迄今已有CD2v 應(yīng)用于減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗和病毒載體疫苗的研究報道。MONTEAGUDO 等[25]刪除了強毒株BA71 的部分CD2v 基因(除了C 末端的其他序列),將其作為減毒活疫苗進(jìn)行動物免疫。發(fā)現(xiàn)BA71ΔCD2v 能夠以劑量依賴的方式保護(hù)豬免受ASFV 的攻擊。 該疫苗不僅能夠抵抗同源的BA71 病毒攻擊,也能抵抗異源強毒株E75 的攻擊。BA71ΔCD2v 在COS-1 細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞中生長良好而不影響其遺傳穩(wěn)定性、致病性和免疫原性,適合應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn),具有良好的疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用前景。

        RUIZ-GONZALVO 等[26]構(gòu)建了一種能夠表達(dá)CD2v 蛋白的重組桿狀病毒。利用3 只豬接種重組CD2v 蛋白后再用野生ASFV 病毒毒株E75 攻擊,最終3 只豬都獲得了保護(hù)性免疫并且產(chǎn)生了針對CD2v的特異性抗體。這些結(jié)果驗證了CD2v蛋白作為ASFV亞單位疫苗的可行性。

        在核酸疫苗研究中,ARGILAGUET 等[27]構(gòu)建了3 種質(zhì)粒:pCMV-PQ(表達(dá)p54 和p30 蛋白)、pCMVsHAPQ(表達(dá)p54、p30 和CD2v胞外端蛋白)和pCMV-UbsHAPQ(表達(dá)與泛素融合的p54、p30 和CD2v 胞外端蛋白)作為DNA 疫苗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅有用pCMV-UbsHAPQ 免疫的豬能夠獲得部分免疫保護(hù)。因此推測,泛素化CD2v 蛋白可靶向蛋白酶體發(fā)生降解,參與MHCⅠ類分子的遞呈途徑,激活特異性T 細(xì)胞免疫。實驗證實,經(jīng)pCMV-UbsHAPQ 免疫后的豬在ASFV 攻擊后,體內(nèi)CD8+T 細(xì)胞數(shù)量急劇擴(kuò)增,說明機體產(chǎn)生針對CD2v的特異性T細(xì)胞免疫與該疫苗的保護(hù)作用相關(guān)。以上實驗均提示CD2v可以作為ASFV疫苗設(shè)計和研發(fā)的靶點分子。

        引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的另一種方法是使用病毒載體。BacMam 是一種基于桿狀病毒的載體,通過感染哺乳動物細(xì)胞表達(dá)靶基因。ARGILAGUET 等[28]構(gòu)建了承載CD2v、p54 和p30 基因的BacMam-sHAPQ 載體,免疫后通過用ASFV 進(jìn)行致死性攻擊來測試該疫苗的保護(hù)潛力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ASFV 感染后,免疫的6 只豬中有4 只豬獲得了保護(hù)性免疫,這種保護(hù)作用與疫苗接種后產(chǎn)生的病毒特異性T 細(xì)胞有關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步驗證了CD2v 在未來疫苗開發(fā)中的潛力。

        3.2 CD2v 分子的抗原表位研究 BURMAKINA等[29-30]在CD2v中鑒定出了4個T細(xì)胞表位,2個位于胞外區(qū),2 個位于胞內(nèi)區(qū)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域內(nèi)。應(yīng)用IFN-γ ELISPOT 實驗評估針對不同的CD2v 表位的應(yīng)答強度:在模型動物被ASFV 攻擊7~10 d 后分離出外周血單個核細(xì)胞,接著通過IFN- γ ELISPOT 測定這些細(xì)胞與CD2v 的不同抗原肽孵育后T 細(xì)胞的應(yīng)答程度。實驗發(fā)現(xiàn)針對這4 個表位均出現(xiàn)了T 細(xì)胞應(yīng)答,而針對胞內(nèi)區(qū)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域的T 細(xì)胞應(yīng)答更為強烈,說明這2 個表位是免疫優(yōu)勢表位,也是疫苗設(shè)計的良好靶點。

        MINMA 等[31]對ASFV 分離株Georgia 2007/1 的CD2v蛋白主要序列進(jìn)行了計算機分析,使用計算機模擬方法鑒定CD2v 蛋白的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞表位。通過計算機預(yù)測,在CD2v蛋白胞外區(qū)(17 aa~204 aa)中鑒定出了4 個B 細(xì)胞表位和5 個T 細(xì)胞表位。對鑒定出的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞表位進(jìn)行保守性分析后繪制了CD2v 蛋白序列中免疫表位分布的圖譜,為針對CD2v抗原的疫苗設(shè)計提供了幫助。

        4 CD2在ASFV基因分型中的作用

        SANNA 等[32]提出將CD2v 蛋白C 端重復(fù)六肽序列的基因作為一種新的遺傳標(biāo)記,對來自不同地區(qū)的ASFV 進(jìn)行基因分型,借此追蹤病毒毒株的起源與傳播。針對大量的撒丁島ASFV 樣本,對ASFV 中編碼p72蛋白、p54蛋白和中央可變區(qū)的基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同病毒分離株的這些基因并無區(qū)別。但不同病毒毒株CD2v C 端重復(fù)六肽序列的重復(fù)數(shù)目不同,其基因長度可用于不同病毒毒株的鑒別。MOLINI等[33]也證明CD2v C 端重復(fù)六肽序列可對納米比亞ASFV 進(jìn)行分型。因此,CD2v 可以作為不同ASFV病毒毒株的鑒別標(biāo)志。

        5 小結(jié)及展望

        CD2v 作為一種結(jié)構(gòu)蛋白,在ASFV 復(fù)制、體內(nèi)播散和免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用。CD2v 可以通過介導(dǎo)紅細(xì)胞吸附增加ASFV 在宿主中的播散;C 端能幫助病毒定位VF 促進(jìn)病毒的復(fù)制;它還可以與SH3P7 蛋白和AP-1 蛋白相互作用參與病毒的免疫逃逸。對CD2v 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的解析促進(jìn)了它的應(yīng)用研究。研究人員以CD2v 為靶點進(jìn)行了減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗和病毒載體疫苗的研究,以CD2v 的C 端為遺傳標(biāo)記進(jìn)行ASFV 基因分型。

        但是對于CD2v 蛋白的結(jié)構(gòu)解析和功能還有許多未解之處:比如目前只解析出CD2v 在體內(nèi)能夠被加工成3 種形式,但是并沒有確定加工位點及加工后產(chǎn)物的功能。CD2v 蛋白介導(dǎo)感染細(xì)胞與紅細(xì)胞的黏附,但是它位于紅細(xì)胞上的受體尚未找到。CD2v 蛋白C 端的重復(fù)六肽序列PPPKPC 和富含脯氨酸的酸性結(jié)構(gòu)域是ASFV 的特異性序列,它們的功能也尚未明確。CD2v 蛋白介導(dǎo)病毒的免疫逃逸機制仍未完全證實。對于這些問題的進(jìn)一步解決可以幫助人們更加深入地了解ASFV,為非洲豬瘟的防治提供幫助。

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