王方迪 侯瑞霞 李俊琴 李新華

（山西醫(yī)科大學(xué)附屬太原中心醫(yī)院皮膚科，免疫性皮膚病干細胞山西省重點實驗室，太原030009）

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的多能干細胞，具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)特性，在不同誘導(dǎo)條件下，MSCs可分別向骨、軟骨、心肌細胞、肝細胞、脂肪細胞及神經(jīng)細胞等分化［1］。MSCs 的來源廣泛，可從骨髓、血液、脂肪組織和臍帶等多種組織中分離獲得［2-4］。MSCs是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞，大量文獻報道了其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制，研究發(fā)現(xiàn)其可通過對抗原提呈細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）等免疫細胞的影響來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［5-6］。

T 淋巴細胞來源于骨髓的多能干細胞，在胸腺中分化成熟，在淋巴細胞中數(shù)量最多，功能最復(fù)雜。在受到進入機體的抗原激發(fā)后，未活化的靜息型T細胞會活化增殖，并分化為效應(yīng)T細胞，從而發(fā)揮細胞免疫作用。根據(jù)CD4 和CD8 表達不同，T 淋巴細胞可分為CD4+T 淋巴細胞和CD8+T 淋巴細胞，其中，CD4+T 淋巴細胞又分為Th1、Th2、Th17 和Treg，分別分泌不同的因子，發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)［7］。Th1分泌的細胞因子包括IL-2和IFN-γ等，Th2分泌的細胞因子包括IL-4、IL-5 和IL-6 等，Th17 主要分泌IL-17，Treg 是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細胞亞群，在減少機體炎癥損傷和保持機體自身耐受等方面發(fā)揮重要作用。而CD8+T淋巴細胞主要為細胞毒性T 淋巴細胞。T 細胞是獲得性免疫的主要效應(yīng)細胞，廣泛參與從信號識別、抗原提呈，到炎癥因子的釋放、其他免疫細胞的激活和趨化等多個免疫反應(yīng)過程［8］。MSCs 作為一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞，在多個環(huán)節(jié)均可抑制T細胞功能。

1 MSCs對T細胞的抑制作用

T 淋巴細胞被激活后，可大量增殖并向不同的亞型分化，同時釋放不同的炎癥因子，以發(fā)揮其效應(yīng)功能。MSCs 可調(diào)節(jié)其活化、增殖、分化及細胞因子分泌等不同環(huán)節(jié)，從而影響T 細胞的免疫效應(yīng)。MSCs 對T 細胞的免疫調(diào)節(jié)機制尚不完全明確，細胞間的直接接觸及可溶性細胞因子等可能參與抑制體內(nèi)外T 淋巴細胞的活化和增殖過程，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)MSCs免疫抑制功能的細胞因子包括TGF-β、肝細胞生長因子（hematopoietic growth factor，HGF）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、IL-10、吲哚胺2、3-雙加氧酶（indolamine2，3-dioxygenase，IDO）、一氧化氮（NO）、血紅素氧合酶1、IFN-γ等［9-10］。

1.1 活化 T 淋巴細胞的活化是免疫應(yīng)答的核心，誘導(dǎo)T 細胞活化需要雙重信號刺激：第一信號由T細胞受體（T cell receptor，TCR）傳導(dǎo)并由黏附分子增強；協(xié)同刺激信號由抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）表面的協(xié)同刺激分子和T 細胞表面相應(yīng)的受體相互作用產(chǎn)生，可增強TCR 信號，只有在雙重信號的作用下T 細胞才可被充分活化，繼而增殖并分化為效應(yīng)T 細胞參與免疫反應(yīng)。T 細胞活化的表面標志包括CD25、CD69、細胞因子IL-2、IFN-γ等，MSCs對T細胞活化的影響存在爭議，YOO等［11］發(fā)現(xiàn)MSCs 可抑制T 細胞表面CD25 表達，LI等［12］研究證實MSCs 可通過下調(diào)NKG2D 表達抑制CD8+T 細胞活化，然而RAMASAMY 等［13］發(fā)現(xiàn)MSCs抑制T 細胞的增殖，而對T 細胞的活化沒有影響，與此同時，研究發(fā)現(xiàn)MSCs 可促進T 細胞的早期活化，上調(diào)CD69 表達［14-15］。MSCs 對T 細胞活化的影響不同可能與作用于不同的T 細胞亞群或MSCs 是否處于炎癥環(huán)境中有關(guān)。

1.2 增殖 已有大量研究表明，MSCs 以劑量依賴的方式抑制T 細胞增殖，可能是通過直接接觸和MSCs 分泌的細胞因子發(fā)揮作用，包括TGF-β、HGF、IDO、PGE2等在內(nèi)的可溶性因子在這一過程中起主要作用［16-18］。MSCs與T細胞直接接觸是否必需尚存在爭議，DI NICOLA 等［9］用Transwell 系統(tǒng)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，避免兩者直接接觸后，T 細胞的增殖仍然受到明顯抑制，考慮是可溶性因子發(fā)揮作用，因此認為MSCs 與T 細胞的直接接觸并不是引起增殖抑制的必要條件。類似地，RASMUSSON 等［19］認為MSCs 主要通過可溶性因子而非與T 細胞直接接觸發(fā)揮作用。然而，有研究則發(fā)現(xiàn)二者的直接接觸必不可少，可能與程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）、人白細胞抗原-G1（human leucocyte antigen-G1，HLA-G1）等有關(guān)［20-23］。

MSCs 抑制T 細胞分裂增殖，研究證明MSCs 可阻斷T 細胞周期，使T 細胞滯留在G0/G1 期［17，23］。在分子水平，CDK2 和細胞周期蛋白D2 表達被抑制，細胞周期調(diào)控因子p27kip1 表達上調(diào)［24］。而對于MSCs 是否誘導(dǎo)T 細胞凋亡，尚無明確定論，GIULIANI 等［23］認為骨髓MSCs 對T 細胞的凋亡沒有影響，但也有研究認為MSCs 可誘導(dǎo)T 細胞的凋亡［24-27］。而BENVENUTO 等［28］發(fā)現(xiàn)MSCs 對T 細 胞凋亡有保護作用。

1.3 分化及效應(yīng)功能 T 細胞在受到刺激后會分化為Th1、Th2、Th17 和Treg，分泌相應(yīng)的細胞因子，發(fā)揮抗炎、促炎及維持免疫平衡等效應(yīng)功能。很多研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 可調(diào)節(jié)T 細胞分化，影響其各亞群平衡，從而調(diào)控其效應(yīng)功能［29-40］。

JIA 等［29］觀察了MSCs 在大鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的免疫調(diào)節(jié)作用，檢測T 細胞產(chǎn)生的Th1/Th2細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)注射MSCs后，T細胞分泌的Th1型促炎因子的水平如IL-2、IFN-γ 顯著降低，而Th2型細胞因子IL-4、IL-10 升高。然而李慧等［30］在探究狼瘡鼠和正常鼠骨髓MSCs 對T 細胞的免疫作用時則發(fā)現(xiàn)T 細胞與正常鼠骨髓MSCs 共培養(yǎng)后，Th2 型細胞因子IL-4 水平降低，Th1 型細胞因子IFN-γ、IL-12 水平升高，類似的實驗還有很多，這些結(jié)果均表明MSCs 可調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡［31-32］。MSCs 還可調(diào)節(jié)Th17 的產(chǎn)生，Th17 是一種CD4+T 細胞亞群，以分泌IL-17為特征，IL-17具有促炎癥作用，誘導(dǎo)促炎細胞因子（如IL-6、TNF-α）、趨化因子等表達，MSCs 可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子RORγt 抑制Th17 細胞亞群的分化，并分泌PGE2等可溶性細胞因子引導(dǎo)Th17 向抑制性Treg轉(zhuǎn)化［33-35］。

此外，MSCs 還可誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg。Treg 是T 細胞中具有免疫抑制功能的亞群，根據(jù)Treg 的表面標志不同，分泌的細胞因子和作用機制不同，可分為CD4+CD25+Treg、Tr1 和Th3 等多種亞型。CD4+CD25+Treg 可高表達IL-2 受體的α 鏈（CD25）分子和轉(zhuǎn)錄因子FOXP3。Tr1是在IL-10誘導(dǎo)下產(chǎn)生的CD4+T細胞。Th3 主要分泌TGF-β，對Th1 和Th2 都具有抑制作用。MSCs可通過分泌HLA-G5和非經(jīng)典的HLA-G擴增Treg，通過促進IL-10 的分泌誘導(dǎo)Tr1 細胞產(chǎn)生，這一過程可能與MSCs 分泌的PGE2、IDO 等細胞因 子 有 關(guān)［21，36-37］。 同 時，Tr1 也 可 分 泌IL-10 促 進MSCs 分泌HLA-G5，后者又進一步誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg。AKIYAMA 等［38］認為MSCs通過FAS/FASL通路誘導(dǎo)T 細胞凋亡和Treg 產(chǎn)生。YAN 等［39］則發(fā)現(xiàn)MSCs 通過上調(diào)PD-1 誘導(dǎo)可產(chǎn)生高免疫抑制能力的Treg。而DEL PAPA 等［40］研究發(fā)現(xiàn)MSCs 與CD4+T 細胞共培養(yǎng)時激活Notch1 通路，用GSI-Ⅰ或中和抗體阻斷Notch1 信號傳導(dǎo)后，其下游靶點HES1 表達降低，負調(diào)控因子FBW7表達增加，F(xiàn)OXP3的表達顯著降低，且MSCs 誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25highFOXP3+細胞大幅減少，說明Notch1 通路在MSCs 誘導(dǎo)Treg 的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。

2 調(diào)節(jié)機制

MSCs 對T 細胞的抑制作用可通過可溶性細胞因子、細胞間直接接觸及分泌外泌體等多種方式實現(xiàn)。具體以哪一種方式為主，或者是否有多種不同的方式協(xié)同作用，不同的研究中有不同的結(jié)論。實驗證明，可溶性細胞因子或外泌體在MSCs抑制T細胞的過程中發(fā)揮重要作用，這一過程涉及的細胞因子主要包括TGF-β1、HGF、IDO、PGE2、HLA-G 等［9-10，41］。此外，PD-1、HLA-G、Jagged-1 和細胞間黏附分子1（ICMA-Ⅰ）、血管細胞黏附分子1（VCAM-Ⅰ）等介導(dǎo)的細胞間直接接觸也被證實在MSCs 對T 細胞免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

2.1 可溶性細胞因子

2.1.1 TGF-β1 和HGF TGF-β1 和HGF 兩種細胞因子均可抑制同種抗原激活的T 淋巴細胞的增殖，加入中和抗體后可部分恢復(fù)T細胞增殖［9］。TGF-β1還 參 與MSCs 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生CD4+CD25+FOXP3+Treg［36］。這些結(jié)果說明，TGF-β1 和HGF 參與了MSCs 對T 細胞增殖的抑制。

2.1.2 IDO IDO 是一種催化色氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸的酶，T 淋巴細胞的增殖受抑制是由于色氨酸的消耗或犬尿氨酸的積累［42］。已有實驗證實，在MSCs存在時，添加外源性色氨酸可恢復(fù)同種抗原激活的T 細胞增殖，加入IDO 的競爭性抑制劑降低了MSCs 對同種抗原激活的CD4+T 淋巴細胞的免疫抑制作用，IDO 還參與抑制Th17 的分化及FOXP3+Treg的產(chǎn)生［42-44］。此外，MSCs 表達IDO 依賴IFN-γ，實驗觀察到將MSCs 置于炎癥環(huán)境時（如IFN-γ）可抑制T細胞的增殖［43］。

2.1.3 PGE2PGE2是花生四烯酸環(huán)氧合酶的代謝產(chǎn)物，MSCs通過環(huán)氧合酶生成PGE2，進而激活I(lǐng)DO，二者參與Treg 的誘導(dǎo)產(chǎn)生，當PGE2及IDO 被同時阻斷后，IL-10+IFN-γ+CD4+Treg 亞群會大量減少，免疫反應(yīng)可恢復(fù)［45-46］。很多研究都發(fā)現(xiàn)PGE2在MSCs 的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，包括抑制T細胞增殖、影響T細胞分化及細胞因子產(chǎn)生［47-49］。

2.1.4 IL-10 IL-10 由Treg 淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等產(chǎn)生，可抑制促炎細胞因子（如IL-2、IL-3、TNF-α 等）的產(chǎn)生，促進HLA-G5 的表達和分泌，同時還可抑制樹突狀細胞及巨噬細胞共刺激分子的表達［50］。中和抗體實驗表明IL-10 在MSCs 介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，并可誘導(dǎo)Treg 產(chǎn)生［51-52］。CD4+CD25+Tregs 與MSCs 共培養(yǎng)后免疫抑制能力增強，可能是由于共培養(yǎng)上清液中IL-10 刺激Tregs 上的PD-1高表達所致［39］。

2.1.5 NO NO 由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）合成，當MSCs 與CD4+、CD8+T細胞接觸時，iNOS可合成NO。Stat5是T細胞活化和增殖的重要轉(zhuǎn)錄因子，在MSCs 存在時，T 細胞中Stat5 磷酸化被抑制，NO 參與了抑制Stat5 磷酸化和T 細胞增殖［53］。ZHANG 等［54］用炎癥因子處理MSCs，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其產(chǎn)生細胞因子信號傳導(dǎo)抑制分子1（SOCS1），敲除SOCS1 的MSCs 免疫抑制能力增強，進一步證明，SOCS1 通過降低iNOS 表達抑制MSCs 的免疫抑制能力，提示NO 可能參與MSCs 介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)。

2.2 細胞間接觸

2.2.1 PD-1 PD-L1（B7-H1/CD274）及 其 受 體（PD-1/CD279）是T 淋巴細胞共刺激通路的組成部分，激活后釋放抑制和調(diào)節(jié)信號，該通路參與促凋亡和終止免疫應(yīng)答以避免組織損傷［55］。PD-1/PD-L1通路在持續(xù)的抗原刺激下被激活，該通路的激活可抑制自身免疫，并通過調(diào)節(jié)T 淋巴細胞直接導(dǎo)致免疫抑制微環(huán)境。在小鼠模型和人類MSCs 中，已經(jīng)觀察到用IFN-γ 誘導(dǎo)后MSCs 的PD-L1 表達增加，用中和抗體證明PD-L1 參與MSCs 介導(dǎo)的免疫抑制［55-56］。YAN 等［39］用人骨髓MSCs 與活化的Treg 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Treg 的PD-1 表達上調(diào)，同時Treg 的免疫抑制作用增強，而用人骨髓MSCs 與活化的CD4+CD25-Tconv 細胞共培養(yǎng)后，CD4+CD25-Tconv 細胞的PD-1 表達也增高，同時MSCs 表達PD-L1，PD-1與PD-L1 結(jié)合后引起CD4+CD25-Tconv 細胞凋亡，且PD-1 高表達的CD4+CD25-Tconv 細胞凋亡的數(shù)量較PD-1低表達的多，表明MSCs作用后活化Tconv細胞的凋亡與PD-1/PD-L1通路的激活有關(guān)［25］。

2.2.2 HLA-G HLA-G 分子是非典型的HLA 分子，具有有限的等位基因多態(tài)性和組織特異性表達模式。有膜結(jié)合的亞型（HLA-G1、G2、G3、G4）和可溶性亞型（HLA-G5、G6、G7）［57］。IL-10 可促進MSCs表達膜結(jié)合亞型HLA-G1 和可溶性亞型HLA-G52種分子［21］。同樣，HLA-G5可正反饋刺激IL-10分泌，同時使用針對這兩種分子的抗體幾乎可以在MSCs存在時完全恢復(fù)同種抗原激活的PBMCs 的增殖［58］。MSCs 與T 細胞的直接接觸可建立正反饋通路和免疫抑制環(huán)境，二者接觸產(chǎn)生的CD4+CD25+FOXP3+Treg 也可加劇這一過程。類似的研究也說明了MSCs和T細胞間接觸的重要性［20］。

2.2.3 ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ 黏附分子ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ已通過抗體證明參與MSCs 對T 細胞的免疫調(diào)節(jié)作用［59］。用IFN-γ 刺激MSCs 后，ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ表達增加，在小鼠模型中阻斷二者表達后，會顯著抑制MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能［36，59］。黏附分子可能通過誘導(dǎo)T 細胞上CTLA-4 的表達參與T 細胞免疫調(diào)節(jié)，活化的CD3+淋巴細胞與MSCs 的細胞間接觸可增加CTLA-4 的表達［20，60-61］。然而，對于人類而言，ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ對MSCs 抑制T 細胞的增殖似乎并不是那么重要。

2.3 胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs） EVs 是指從細胞膜上脫落或由細胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，直徑從40～1000 nm 不等，主要由微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌體（exosomes，Exs）組成。最近發(fā)現(xiàn)，MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能在很大程度上是由旁分泌信號介導(dǎo)的，MSCs分泌的胞外囊泡也參與這種調(diào)節(jié)作用，并且被認為是關(guān)鍵的旁分泌因子，其攜帶各種生物分子，如RNA（mRNA、miRNA）和蛋白質(zhì)（膜受體、酶、細胞因子和生長因子），因此具有免疫調(diào)節(jié)特性［62］。MSCs 通過將其生物活性物質(zhì)從親代細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞，在細胞與細胞的相互作用中發(fā)揮重要作用，MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用在很大程度上依賴于EVs的分泌［63-64］。

MSCs 分泌的EVs 在T 細胞抑制中的作用越來越受到關(guān)注［65-67］。與MSCs 的功能類似，EVs 也可抑制效應(yīng)T 細胞的分化、活化和增殖，誘導(dǎo)T 細胞凋亡，促進Treg 生成［68-71］。MOKARIZADEH 等［68］首次從IL-1β 激活的小鼠MSCs 中分離出EVs，其作為MSCs 的特異性細胞分子（如PD-L1、TGF-β 等）的載體。MSCs-EVs 可抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠自身反應(yīng)性淋巴細胞的活化和增殖，誘導(dǎo)T 細胞凋亡，促進抗炎因子（IL-10、TGF-β）的分泌及Treg的產(chǎn)生。FAVARO 等［69］探究了1 型糖尿病的骨髓MSCs 來源的EVs 能否模擬MSCs 的免疫調(diào)節(jié)功能，發(fā)現(xiàn)MSCs-EVs 能夠干擾抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。通過檢測IFN-γ 的表達發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 能夠抑制體外Th1 產(chǎn)生，誘導(dǎo)Treg 產(chǎn)生，減少Th17 產(chǎn)生，MSCs-EV作用T 細胞后，T 細胞可分泌PGE2和TGF-β。因此，MSCs-EVs 可調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡，增加Treg 在1 型糖尿病中的比例。此外，BLAZQUEZ 等［70］用脂肪來源的MSCs分泌的EVs作用于活化T細胞后發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+細胞減少，同時，T細胞表達的IFN-γ水平降低。提示MSCs-EVs不僅影響T細胞的表型分化，還可影響其細胞因子的表達。

但也有研究證實，EVs 的效應(yīng)并不能等同于MSCs 本身。CONFORTI 等［72］對骨髓MSCs 及其分泌的EVs 的免疫調(diào)節(jié)作用進行了比較，發(fā)現(xiàn)相比MSCs-EVs，MSCs 能更有效地抑制體外T 細胞增殖。MSCs-EVs 作用T 細胞后，IL-10、TGF-β 分泌增加，GM-CSF、IFN-γ 分泌減少，但MSCs 直接與T 細胞共培養(yǎng)時，細胞因子的增加或減少都更明顯，說明EVs僅能發(fā)揮MSCs的部分效應(yīng)。并且，由于EVs計數(shù)困難和EVs 與靶細胞的比例難以確定，在比較EVs 和MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力時應(yīng)考慮其局限性。

3 小結(jié)與展望

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，可調(diào)節(jié)多種免疫細胞的功能，特別是T 細胞，MSCs 可明顯抑制T 淋巴細胞的活化、增殖和細胞因子分泌，顯著上調(diào)Treg 比例，進而影響其他免疫細胞功能，鑒于這些特點，MSCs 已被用于包括GVHD 在內(nèi)的自身免疫性疾病的治療，并取得了積極的結(jié)果［73］。然而，MSCs 對T 細胞的免疫調(diào)節(jié)機制尚不完全明確，因此進一步探討其確切的作用機制，將為MSCs 的實驗室研究及臨床治療提供重要的理論支持。