龔高明 陳博 舒鵬

隨著靶向藥物的不斷開發(fā)，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的預(yù)后得到了顯著改善，但MM仍是一種不可治愈的疾病[1]。因此尋找MM的治療靶點，進一步開發(fā)靶向治療藥物，從而改善患者的預(yù)后成為研究的熱點[2]。在患者治療靶點的分析中，除去對患者本身的臨床病理因素進行分析外，近年來通過對患者腫瘤組織樣本的測序數(shù)據(jù)進行分析，明確腫瘤組織中的基因表達與患者預(yù)后因素之間的關(guān)聯(lián)，并進一步應(yīng)用于臨床病例的診斷、腫瘤靶點開發(fā)的這一流程已得到廣泛的認可[3]。目前已有多項研究得出了與MM患者生存率相關(guān)的預(yù)后基因[4]。盡管如此，有關(guān)這些預(yù)后基因如何影響MM患者腫瘤細胞生物學(xué)特性的研究則相對較少。本研究通過Cox預(yù)后模型分析基因表達與MM患者整體生存率之間的相關(guān)性，并得到預(yù)后相關(guān)基因，同時進行相應(yīng)的機制探討。

1 材料和方法

1.1 試劑 RPMI 1640（11875-085）培養(yǎng)基、DMEM（11530556）培養(yǎng)基、FBS（10438026）均購自美國Gibico公司；小干擾 RNA（small interfering RNA,siRNA）購自美國Sigma 公司；PMD2.G（12259）、psPAX2（12260）、lenti－CRISPR V2（52961）均購自美國addgene公司；Lipofectamine2000（12566014）、qRT-PCR實驗中Trizol（15596026）均購自美國Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RTReagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）、SYBR檢測試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNaseHPlus）（RR820A）均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，實驗中全部引物均由華大基因合成；在Western blot實驗中，RIPA強裂解液（P0013B）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；緊密連接蛋白 1（claudin1,CLDN1）（ab63070）、轉(zhuǎn)化生長因子-β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）（ab15537）、GAPDH（ab9485）抗體均購自美國 Abcam公司；Transwell小室（BMS500FI-100）購自美國Corning公司；CCK-8（CK04）增殖檢測試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V FITC/PI（BMS500FI-100）凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；CD138+磁珠分選試劑盒購自美國STEMCELL Technologies公司。

1.2 預(yù)后相關(guān)基因的確定與驗證 MM預(yù)后相關(guān)基因的確定使用R 3.5.1軟件完成，選取GSE2658數(shù)據(jù)集為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，GSE57317數(shù)據(jù)集為測試數(shù)據(jù)集。訓(xùn)練與測試數(shù)據(jù)集均使用GEOquery包下載后，log2轉(zhuǎn)換并使用preprocessCore包進行標(biāo)準(zhǔn)化，訓(xùn)練數(shù)據(jù)集隨后進行如下操作：（1）使用randomForest包中的隨機森林對基因的重要性進行排序；（2）進一步使用多因素Cox模型，最終得到25個預(yù)后相關(guān)基因，使用survival包中的多因素Cox模型檢測訓(xùn)練數(shù)據(jù)集與測試數(shù)據(jù)集中25個基因的表達與MM患者總體生存率的關(guān)聯(lián)，并使用ROC的時間序列分析（timeROC）工具包評估模型對不同時間點生存預(yù)測的性能，隨后使用qRT-PCR檢測25個基因在MM患者CD138+細胞中的表達；（3）在得到候選基因CLDN1后，使用survival包中的單因素Cox模型檢測測序數(shù)據(jù)中CLDN1的表達與MM患者總體生存率的關(guān)聯(lián)；（4）根據(jù)CLDN1的表達值，將GSE2658數(shù)據(jù)集中樣本分為高表達組與低表達組，并使用limma包進行差異表達分析，以P＜0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選基因，最終得到779個異常表達基因，使用fgsea包進行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），并對富集通路中的基因使用cor.test計算相關(guān)系數(shù)。

1.3 細胞培養(yǎng) 3例健康志愿者、7例MM患者骨髓樣本均來自寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院，樣本收集時間為2015年11月至2017年11月，實驗過程經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。健康志愿者、MM患者骨髓在經(jīng)Ficoll分離出單個核細胞后，MM患者骨髓使用CD138+磁珠分選試劑盒分選出CD138+細胞待用。人MM細胞系RPMI8226細胞（北京協(xié)和細胞資源中心）培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。人胚腎細胞系293t細胞（美國ATCC公司）培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。

1.4 CLDN1敲除慢病毒包裝、單克隆篩選以及TGF-β3 siRNA轉(zhuǎn)染 從addgene human GECKOV2 library庫中提取CLDN1單引導(dǎo)核糖核酸（single guide RNA,sgRNA）序列，選取6條sgRNA，按照相應(yīng)的操作步驟克隆至lentiCRISPR V2載體中[5]。使用第三代慢病毒包裝體系將sgRNA包裝為慢病毒，主要步驟如下：（1）PMD2.G、psPAX2、lentiCRISPR V2 分別取 3、9、12 μg，轉(zhuǎn)染至293t細胞中。（2）收集36、48 h病毒上清液，混在一起低速離心（3 000 rpm，15 min）后，使用病毒上清液感染RPMI8226，標(biāo)記為RPMI8226 KO組；RPMI8226細胞同時感染lentiCRISPR V2空載病毒，標(biāo)記為RPMI8226 CON組。RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組在使用8.5×10-6mol/L濃度的嘌呤霉素篩選48 h后，使用BD FACSARIA III單細胞分選功能篩選單克隆細胞，并使用Sanger測序檢測DNA突變變化，使用Western blot檢測CLDN1蛋白水平的抑制，最終確定序列為5'-GGCGGTCACGATGTTGTCGC-3'的sgRNA阻斷了RPMI8226細胞中CLDN1的表達。（3）在CLDN1與TGF-β3關(guān)聯(lián)的驗證中，將RPMI8226細胞分為RPMI8226 CON 組、RPMI8226 CLDN1 KO 組、RPMI8226 TGF-β3 siRNA組、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA組，并分別轉(zhuǎn)染lentiCRISPR V2空載體、CLDN1 sgRNA、TGF-β3 siRNA 和 CLDN1 sgRNA+TGF-β3 siRNA，TGF-β3 siRNA轉(zhuǎn)染使用lipofectamine 2000進行，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 健康志愿者骨髓單個核細胞與MM患者CD138+細胞中CLDN1 mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。健康志愿者骨髓單個核細胞與MM患者CD138+細胞首先使用Trizol裂解，經(jīng)氯仿分離出苯酚、等體積異丙醇沉淀出細胞總RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，通過SYBR染料法檢測目的基因在mRNA水平的表達。GAPDH上游引物：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，下游引物：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'；CLDN1 上游引物：5'-GTCTTTGACTCCTTGCTGAATCTG-3'，下游引物：5'-CACCTCATCGTCTTCCAAGCAC-3'。反應(yīng)體系為cDNA 1.2 μl，引物 1.2 μl，2×qPCR Mix 7.5 μl，ROX DyeⅡ 0.3 μl，水 4.8 μl，總反應(yīng)體系為 15 μl；反應(yīng)條件為50 ℃ 20 s，95℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，后兩步40個循環(huán)。最終mRNA的相對表達量使用2-ΔΔCT法定量。

1.6 CLDN1、TGF-β3蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。細胞使用RIPA裂解液冰上裂解30 min后，使用BCA蛋白定量試劑盒定量，加入相應(yīng)比例的上樣緩沖液，沸水浴15 min后，取20μg蛋白加入到Western預(yù)制膠中，恒壓電泳直至溴酚藍跑至膠板底部，并使用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，標(biāo)記相應(yīng)一抗與二抗，使用ECL發(fā)光液檢測信號的強度以判定蛋白的表達。

1.7 細胞凋亡檢測 采用Annexin V FITC/PI雙染法。PBS清洗細胞后，使用Binding buffer重懸，并加入Annexin V FITC與PI，冰上標(biāo)記10 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。數(shù)據(jù)使用FLOWjo 7.6.1進行分析。

1.8 細胞遷移檢測 采用Transwell法。選用8μm Transwell小室，上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞，下室加入含有血清的培養(yǎng)基，12 h后吸取下室培養(yǎng)基，計數(shù)得到遷移細胞數(shù)目。

1.9 細胞增殖檢測 采用CCK-8法。將細胞鋪于96孔板中，并設(shè)立 4 個副孔，于 0、24、48、72、96 h 分別加入1/10體積的CCK-8試劑，37℃避光孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測 450 nm處的吸光度（OD）值（OD450），并以0 h時的OD450為參照，其余時間點OD值均與0 h時相除得到增殖指數(shù)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用R 3.5.1統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。生存分析采用單因素Cox回歸分析。樣本的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM患者25個基因預(yù)后模型的建立及與患者預(yù)后的相關(guān)性 本研究得到25個與患者整體生存率相關(guān)的預(yù)后基因，分別為 NNAT、TRAPPC8、IFI27L1、PNOC、HJURP、KRT6B、METTL7A、C16orf45、CENPA、TPT1P8、TYROBP、MSN、RFC4、DSPP、PABPC1、TNFSF12、C3orf52、CLDN1、RPS9、CSTF3、CDKN1A、SLC25A43、HPRT1、VDAC3、FZD3。以25個基因組合得到的預(yù)后模型在訓(xùn)練（圖1a）與測試數(shù)據(jù)集（圖1b）中均能夠很好地預(yù)測患者的總體生存率，且在患者1～3年生存率的預(yù)測中也有很好的表現(xiàn)（AUC 均＞0.7）（圖 1c）。

圖1 多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者25個基因預(yù)后模型的建立及與患者預(yù)后的相關(guān)性（a：使用Cox模型得到的25個預(yù)后相關(guān)基因在GSE2658數(shù)據(jù)集中與患者總體生存率的相關(guān)性；b：在測試數(shù)據(jù)集中驗證25個預(yù)后基因與患者總體生存率的相關(guān)性；c：在測試數(shù)據(jù)集中，25個預(yù)后基因?qū)颊?.5、1、1.5、2、2.5、3年生存率的預(yù)測能力的比較）

2.2 MM患者CD138+細胞中CLDN1的表達情況及與患者預(yù)后的相關(guān)性 MM患者CD138+細胞中CLDN1 mRNA表達水平為4.89±0.63，高于健康志愿者骨髓單個核細胞的 1.00±0.12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.11，P＜0.01）（圖2a）。同時MM患者CD138+細胞中CLDN1蛋白水平呈高表達（圖2b）。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，CLDN1高表達組患者生存率明顯低于CLDN1低表達患者（P＜0.01）（圖 2c）。

2.3 CLDN1的表達水平與MM細胞系細胞生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián) 在確定了CLDN1在CD138+細胞中的表達后，隨后構(gòu)建了CLDN1敲除單克隆，結(jié)果表明CLDN1 sgRNA抑制了CLDN1蛋白水平的表達（圖3a）。而RPMI8226 CON組細胞凋亡比例為2.40±0.23，明顯低于RPMI8226 CLDN1 KO組的17.67±2.77，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.55，P＜0.01）（圖 3b）。在細胞增殖中，72 h時RPMI8226 CON組增殖指數(shù)為4.87±1.56，明顯高于RPMI8226 CLDN1 KO組的 2.51±0.18，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.94，P＜0.01）；96 h時 RPMI8226 CON 組增殖指數(shù)為6.86±0.12，明顯高于RPMI8226 CLDN1 KO組的 3.06±0.25，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=23.73，P＜0.01）（圖3c）。在細胞遷移中，12 h時RPMI8226 CON組遷移細胞數(shù)為2 063±241.9，明顯高于RPMI8226 CLDN1 KO 組的 1 197±166.9，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.95，P＜0.05）（圖 3d）。

圖3 緊密連接蛋白1（CLDN1）的表達水平與骨髓瘤細胞系細胞生物學(xué)特性之間的關(guān)聯(lián)（a：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組CLDN1蛋白表達水平比較；b：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組細胞凋亡比例比較；c：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組細胞增殖指數(shù)比較；d：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組遷移細胞數(shù)比較；與RPMI8226 CON組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 CLDN1調(diào)控的信號通路探討 在確定了CLDN1與RPMI8226細胞生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)后，在GSE2658數(shù)據(jù)集中選取CLDN1高表達與低表達樣本，使用GSEA方法檢測細胞通路的富集，結(jié)果表明細胞外基質(zhì)相關(guān)通路在CLDN1高表達樣本中富集（圖4a），檢測CLDN1與細胞外基質(zhì)分子（GO:0031012）表達相關(guān)性后，發(fā)現(xiàn)CLDN1與TGF-β3的表達呈正相關(guān)（r=0.27，P＜0.01）（圖 4b和表 1）。RPMI8226隨后轉(zhuǎn)染 TGF-β3 siRNA，結(jié)果表明CLDN1的表達受限（圖4c），使用Transwell小室檢測 RPMI8226 CON組、RPMI8226 CLDN1 KO 組、RPMI8226 TGF-β3 siRNA 組、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA組細胞遷移的變化后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLDN1的敲除、TGF-β3的抑制均能抑制RPMI8226細胞的遷移，而同時抑制CLDN1與TGF-β3能夠進一步抑制RPMI8226細胞的遷移能力（圖4d）。

表1 細胞外基質(zhì)分子（GO:0031012）中與CLDN1表達相關(guān)的基因

圖4 緊密連接蛋白1（CLDN1）調(diào)控的信號通路的探討[a：在GSE2658數(shù)據(jù)集中，篩選出CLDN1高表達與低表達樣本后，使用基因富集分析（GSEA）檢測通路的富集；b：GSE2658數(shù)據(jù)集中CLDN1與轉(zhuǎn)化生長因子-β3（TGF-β3）表達的相關(guān)性；c：RPMI8226細胞在轉(zhuǎn)染TGF-β3小干擾 RNA（siRNA）后，CLDN1、TGF-β3 蛋白表達的電泳圖；d：RPMI8226 CON 組、RPMI8226 CLDN1 KO 組、RPMI8226 TGF-β3 siRNA組、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA組細胞遷移的變化比較，與RPMI8226 CON組比較，*P＜0.05，**P＜0.01]

3 討論

MM目前仍為預(yù)后較差的一種惡性疾病，我國患者中位生存期僅為3年，僅有少數(shù)患者能夠存活10年以上[6]。與此同時MM也是最早應(yīng)用靶向治療藥物的疾病之一，通過對MM發(fā)病過程中特異的通路進行靶向治療能夠起到很好的效果，如2014年的一項研究中，在130例成人MM患者中應(yīng)用蛋白酶體抑制劑硼替佐米，使得1例患者達到完全緩解、49例患者達到部分緩解[7]。然而隨著腫瘤細胞的不斷演化，多種基因如PSMB5 A49T、C52F等位點突變介導(dǎo)的耐藥也備受關(guān)注[8]，而明確新的預(yù)后相關(guān)基因，并開發(fā)新的靶點成為研究的熱點。

本研究通過Cox生存分析與隨機森林算法結(jié)合的方式，得到了25個與患者總體生存率顯著相關(guān)的基因，而由該25個預(yù)后相關(guān)基因構(gòu)建的預(yù)后模型，在對患者 0.5、1、1.5、2、2.5、3 年生存率的預(yù)測中，該模型的AUC在0.5年最高，在3年總體生存率的預(yù)測中依然具有很好的性能。通過在本院MM樣本驗證，25個基因中，CLDN1在7例MM患者中的mRNA與蛋白水平均呈現(xiàn)高表達，與此同時CLDN1的表達與患者的總體生存率高度相關(guān)，因此筆者選定CLDN1進行進一步的驗證。

目前已有的研究中，CLDN1又稱Claudin 1，屬于跨細胞膜蛋白家族，其主要功能與細胞之間的緊密連接相關(guān)[9]，因此也被證實與細胞增殖、轉(zhuǎn)移[10]、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]等進程密切相關(guān)。MM中CLDN1的具體功能與機制尚未有報道，通過構(gòu)建CLDN1敲除細胞系，筆者證實了CLDN1的表達與MM細胞系的增殖、凋亡、遷移高度相關(guān)，初步證實了CLDN1的表達水平?jīng)Q定了MM細胞系的生物學(xué)特性，可能為MM的驅(qū)動基因之一。因此筆者隨后在測試數(shù)據(jù)集中調(diào)取CLDN1的表達數(shù)據(jù)并計算細胞通路的富集，結(jié)果表明細胞外基質(zhì)成分相關(guān)通路在CLDN1高表達樣本中異常富集，隨后調(diào)取該通路（GO:0031012）中的所有基因，并與CLDN1表達數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，得出TGF-β3與CLDN1的表達呈正相關(guān)。TGF-β3屬于TGF-β家族，已被證實與MM的發(fā)病相關(guān)[12]。同時在結(jié)腸上皮細胞系中TGF-β家族的TGF-β1能夠誘導(dǎo)CLDN1的表達，因此筆者認為TGF-β3可能通過同樣的機制調(diào)控CLDN1的表達[13]。筆者向RPMI8226細胞系中轉(zhuǎn)染了TGF-β3 siRNA，通過Western blot確定了敲低效率后，進一步證實了TGF-β3的抑制能夠降低CLDN1的表達，初步證實TGF-β3對CLDN1的調(diào)控，而在細胞遷移實驗中，TGF-β3、CLDN1的抑制均能降低細胞的遷移能力，且兩者具有協(xié)同作用。

綜上所述，本研究確定了25個預(yù)后相關(guān)基因?qū)颊呱娴念A(yù)測作用，并確定了其中與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的癌基因CLDN1，同時初步證實了CLDN1與TGF-β3之間的相關(guān)性，為進一步開發(fā)靶向藥物提供了基礎(chǔ)。