吳曉華，張曉坤，曲玉森，張耀昆，司紅麗

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

隨著時(shí)代的發(fā)展，微生物肥料已成為新型生物肥料發(fā)展的重要方向之一，在提高土壤肥力、改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、低碳環(huán)保、維持生物多樣性、可自行增殖等方面有顯著優(yōu)勢(shì)［1］。但目前微生物肥料使用總量仍然偏小，且市場(chǎng)上使用的菌種性狀不好，選育投入少，達(dá)不到大面積推廣的要求［2］。因此，加強(qiáng)對(duì)微生物肥料的研制及促進(jìn)植物生長(zhǎng)機(jī)理方面的研究就顯得尤為重要。

近年來(lái)，地衣作為一種重要的生物資源，其內(nèi)生真菌的潛在藥物價(jià)值及重要生物活性資源價(jià)值被不斷挖掘［3-4］。利用真菌生物修復(fù)技術(shù)來(lái)改善土壤品質(zhì)的研究取得很多成果［5］，對(duì)地衣資源的有效開發(fā)和利用顯得尤為重要。纖維素作為一類重要的可再生資源，對(duì)纖維素的廣泛利用將有效緩解糧食的不足、垃圾處理、工業(yè)燃料資源短缺等一系列問(wèn)題［6］。土壤是植物所需磷素的主要來(lái)源，但土壤中大部分的磷元素不可轉(zhuǎn)移，不能被植物直接吸收利用，難以滿足植物生長(zhǎng)需要［7］。地衣真菌具有與地衣相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物大多具有一定的抗菌活性，從地衣真菌中篩選出抑菌菌株，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)植物病原菌的抑菌效果，為微生物肥料的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。如今報(bào)道的功能真菌在生物活性上明顯高于細(xì)菌［8］，但真菌的數(shù)量及其種類要遠(yuǎn)小于細(xì)菌［9］，因此，對(duì)功能真菌的篩選和研究具有更重要的意義。

本研究以實(shí)驗(yàn)室已分離純化的120株地衣真菌為實(shí)驗(yàn)材料，篩選出具有高效降解纖維素、溶解無(wú)機(jī)磷、抑制病原菌的菌株，以不同的菌株組合研制微生物菌劑，探究其在黃瓜苗生長(zhǎng)中的促生作用，最終篩選出具有較高應(yīng)用價(jià)值的復(fù)合菌劑，以期為微生物肥料產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

地衣真菌：山東師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存的120株地衣真菌。

供試病原菌：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），花生莖點(diǎn)霉（Phoma arachidicola），蘋果輪紋菌（Botryospuaeria berengeriana）。

1.1.2 儀器

DL-CL-2N超凈工作臺(tái)（哈爾濱），LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海），V-5100可見分光光度計(jì)（上海），PL 303電子天平（上海），全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱（上海），WH-1微型旋渦混合儀（上海），DYY-6C電泳儀（北京），ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海），BG 32干式恒溫器（杭州）。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CMC-Na 1.88 g，剛果紅0.20 g，明膠2.00 g，瓊脂20.00 g，蒸餾水1000 mL。PKO培養(yǎng)基：NaCl 0.30 g，MgSO40.30 g，KCl 0.30 g，（NH4）2SO40.50 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25.00 g，葡萄糖10.00 g，瓊脂20.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5。NBRIP培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，（NH4）2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，Ca3（PO4）25.00 g，蒸 餾 水1000 mL，pH 7.0～7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 2.00 g，KH2PO40.20 g，（NH4）2SO41.40 g，蒸餾水1000 mL。載體為泥炭∶木炭∶花土（2∶2∶1），每袋載體分別裝250 g，連續(xù)滅菌2次（121℃，30 min）。

1.2 方法

1.2.1 降解纖維素、溶解無(wú)機(jī)磷真菌的初篩

以點(diǎn)接的方式將120株地衣真菌菌株分別接種到剛果紅培養(yǎng)基和PKO培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察結(jié)果。根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）大小初步確定該菌株降解纖維素能力和溶磷能力的強(qiáng)弱，篩選出比值較大的菌株作為后期復(fù)篩的菌株。

1.2.2 降解纖維素、溶解無(wú)機(jī)磷真菌的復(fù)篩

繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，以DNS法［10］測(cè)定還原糖含量。以吸光度值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用已配置好的磷標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定吸光值繪制磷標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，具體操作參見文獻(xiàn)［11］。

功能活性的測(cè)定：菌株液體培養(yǎng)發(fā)酵得到粗酶液。采用濾紙酶活測(cè)定法［12］，測(cè)定降解纖維素真菌的濾紙酶活力；采用鉬銻抗比色法［13］測(cè)定溶磷真菌的酶活力；用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，由吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對(duì)應(yīng)的葡萄糖和磷含量，根據(jù)公式計(jì)算出酶活力。

1.2.3 抗病原菌真菌的篩選

采用平板對(duì)峙法測(cè)定抑菌活性［14］。將前期初篩獲得的溶解無(wú)機(jī)磷、降解纖維素的地衣真菌發(fā)酵液采用打孔法接在PDA平板中央，四周接上少量供試病原菌尖孢鐮刀菌、花生莖點(diǎn)霉、蘋果輪紋菌。設(shè)置空白對(duì)照，每個(gè)真菌做3個(gè)重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，觀察病原菌生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 確定最佳組合

挑選高效降解纖維素菌株、溶磷菌株、抑菌菌株，結(jié)合菌株生長(zhǎng)曲線［15］確定菌種比例，進(jìn)行濾紙崩解實(shí)驗(yàn)［16］，篩選最佳降解纖維素組合，采用鉬銻抗比色法篩選最佳溶磷組合。

1.2.5 菌株鑒定

將復(fù)篩的功能性菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基以插片培養(yǎng)法［17］培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。挑取玻片顯微觀察，觀察菌絲和孢子等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。以改良CTAB法［18］提取供試真菌DNA。利用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴(kuò)增菌株的ITS rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)定的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)（Available at：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定種屬。

1.2.6 地衣真菌多功能復(fù)合菌劑的研制

將篩選出的優(yōu)秀組合菌株按比例混合制成復(fù)合菌種孢子懸液，在分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)600 nm下的吸光度值，并使用無(wú)菌水調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為108CFU/mL（OD≥0.5）。以泥炭∶木炭∶花土（2∶2∶1）作為菌肥載體，每份250 g分裝至保鮮袋，于滅菌鍋中連續(xù)滅菌2次（121℃，30 min）。量取復(fù)合菌懸液50 mL與菌肥載體完全混勻?；靹蚝蟠诿芊?，用無(wú)菌牙簽在袋子兩側(cè)扎3～5個(gè)孔，外套一保鮮袋，口密封，放置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右。不定時(shí)查看載體濕度，確保載體松散不結(jié)塊，如混勻后載體較干燥可補(bǔ)加25 mL無(wú)菌水確保載體的濕度，便于菌株定殖。制成后以載體濕度適宜、菌種活性較高、安全性好、對(duì)植物促生作用明顯作為指標(biāo)。

1.2.7 復(fù)合菌劑對(duì)黃瓜苗生長(zhǎng)的影響

選擇種子飽滿且大小一致的黃瓜種子，用1%的NaClO滅菌10 min左右，種植于一次性塑料盆（規(guī)格：外徑9.5 cm×內(nèi)徑8.5 cm×高12 cm）中，每盆中裝有100 g滅菌的沙子，每盆中種植黃瓜種子3粒。施加菌劑的黃瓜苗作為實(shí)驗(yàn)組，不施加菌劑的作為空白對(duì)照組，每組重復(fù)3盆；實(shí)驗(yàn)組中每盆添加250 g載體，內(nèi)含有50 mL菌劑，對(duì)照組中每盆添加250 g滅菌沙子。每2 d澆200 mL無(wú)菌水。待植物生長(zhǎng)到適宜高度后，同步測(cè)定黃瓜苗的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、濕重、干重等各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.2.8 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值或平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤表示）。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能性真菌的初篩

以點(diǎn)接的方式將120株地衣真菌菌株分別接種到剛果紅培養(yǎng)基和PKO培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后，部分真菌出現(xiàn)了水解圈（圖1），測(cè)得的各菌株溶解結(jié)果見表1。在降解纖維素真菌中，菌株1915-2水解圈比值最大，為1.86，菌株1915-2、1913-1、1909-7、1908-3、1915-1、1913-6、1909-3、1912-6、1905-2、1913-2水解圈比值均大于1.30，因此選擇這10株地衣真菌作為復(fù)篩解纖維素的菌株。溶磷真菌中菌株1905-6溶磷圈比值最大，為1.71，菌株1905-6、1901-5、1905-4、1909-3溶磷圈比值均大于1.45，因此選擇這4株地衣真菌作為復(fù)篩溶磷菌株。

表1 地衣真菌降解纖維素和溶磷的水解圈結(jié)果

2.2 功能性真菌的復(fù)篩

初篩獲得的菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，以DNS法測(cè)定降解纖維素的濾紙酶活力，以鉬銻抗比色法測(cè)定溶磷菌株酶活力，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見圖2、圖3、圖4。

如圖2和圖3所示，在產(chǎn)孢子真菌中，菌株1909-7降解纖維素能力最強(qiáng)，最大酶活力為1450 U/mL，菌株1913-6降解能力次之，為1070 U/mL，菌株1909-7和1913-6的最大酶活力均高于其他菌株最大酶活力500～700 U/mL；不產(chǎn)孢子真菌中，菌株1915-2降解纖維素能力最強(qiáng)，最大酶活力為1462 U/mL；菌株1905-2能力次之，為406.6 U/mL；菌株1915-2和1905-2的最大酶活力均高于其他菌株最大酶活力230～380 U/mL。因此選擇菌株1909-7、1913-6、1915-2、1905-2為復(fù)篩后最終確定的菌株。

由圖4可知，菌株1905-4溶解效果最強(qiáng)，溶液中磷酸根濃度可達(dá)到1387.20 mg/L；總體上，在0～96 h內(nèi)，溶磷菌的溶磷能力是隨著時(shí)間的變化而增大，在培養(yǎng)96 h后，由于培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分的消耗而基本保持穩(wěn)定。因此，本研究選擇菌株1905-4作為復(fù)篩后最終確定的菌株。

2.3 抗病原菌真菌的篩選

將前期初篩獲得的溶解無(wú)機(jī)磷、降解纖維素的內(nèi)生真菌取發(fā)酵液接在PDA平板，以平板對(duì)峙法測(cè)定初篩菌株的抑菌活性，測(cè)定結(jié)果見表2。在進(jìn)行抑菌活性測(cè)定的所有菌株中，約24%的功能性地衣真菌對(duì)病原菌有較為明顯的拮抗作用，尤其是對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果。其中菌株1905-2對(duì)蘋果輪紋菌的抑制效果最明顯，在PDA平板中產(chǎn)生了較為明顯的抑菌圈，且病原菌菌絲生長(zhǎng)到一定程度時(shí)停止生長(zhǎng)；菌株1915-2對(duì)尖孢鐮刀菌、花生莖點(diǎn)霉、蘋果輪紋菌都有抑制效果，因此對(duì)病原菌具有廣譜性和較好的抑制性；菌株1905-4在抑制尖孢鐮刀菌上效果最顯著。因此本研究選用菌株1905-2、1915-2、1905-4作為篩選得到抗病原菌真菌。

表2 地衣真菌抑菌活性結(jié)果 （%）

2.4 功能菌株的組合篩選

以復(fù)篩出的高效溶磷菌株1905-4與高效降解纖維素菌株1913-6、1909-7、1905-2、1915-2分別組合，由于溶磷菌株1905-4生長(zhǎng)較快，因此以溶磷菌株∶纖維素菌株=1∶4作為菌液比例，組合編號(hào)分別標(biāo)為2、3、4、5、6，空白對(duì)照標(biāo)為編號(hào)1。通過(guò)濾紙降解效率和鉬銻抗比色法分別測(cè)定組合降解纖維素能力與溶磷能力。發(fā)酵培養(yǎng)6 d后的濾紙降解效率見表3，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出組合5的崩解效果最好，其次為組合4和組合6。鉬銻抗比色法測(cè)定溶磷率（圖5），由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出組合5磷酸根離子溶度最高，其次為組合4和組合6。所以選取組合4、組合5和組合6作為菌劑研制的實(shí)驗(yàn)組，探究其對(duì)黃瓜苗的促生作用。

表3 功能性真菌組合培養(yǎng)6 d的濾紙降解效率

2.5 地衣真菌多功能復(fù)合菌劑的研制

按照前期篩選的高效復(fù)合多功能作用的真菌組合4、5和6作為實(shí)驗(yàn)組，不加菌為空白對(duì)照組，分別測(cè)量其對(duì)黃瓜苗的促生作用。將黃瓜種子種在加入含有菌株的生物肥料和沙土中，測(cè)量15 d后黃瓜苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、鮮重、干重等生長(zhǎng)指標(biāo)。

從表4中可以看出，4個(gè)處理下黃瓜苗根長(zhǎng)表現(xiàn)為組合4＞對(duì)照組＞組合5＞組合6，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。黃瓜苗莖長(zhǎng)表現(xiàn)為組合5＞組合6＞組合4＞對(duì)照組，不同菌肥組合處理黃瓜苗莖長(zhǎng)有顯著性差異（P＜0.05）。不同菌肥處理對(duì)黃瓜苗生物量干重總體表現(xiàn)為組合6＞組合5＞組合4＞對(duì)照組，鮮重總體表現(xiàn)為組合5＞組合6＞組合4＞對(duì)照組，且生物菌肥對(duì)增加黃瓜苗生物量干鮮重具有顯著效果（P＜0.05）。組合5在莖長(zhǎng)和鮮重上占有優(yōu)勢(shì)（圖6），且組合5的溶磷效果及降解纖維素效果最好，因此綜合選取組合5研制的生物菌劑作為最終的微生物菌劑。

表4 菌肥盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 功能菌株的鑒定

2.6.1 功能菌株形態(tài)特征

本實(shí)驗(yàn)篩選得到的高效降解纖維素菌株為1905-2、1909-7、1913-6、1915-2，其中菌株1905-2和1915-2具有抑制病原菌的活性。高效溶磷菌株為1905-4，也具有抑制病原菌的活性。將功能菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，用光學(xué)體式顯微鏡觀察地衣真菌的外部形態(tài)。分別記錄真菌菌株的形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)真菌的形態(tài)學(xué)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》［19］和《中國(guó)真菌志》［20］進(jìn)行比對(duì)分析，菌株1905-2在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成瓶梗及瓶梗孢子，瓶?；砍是蛐位驒E圓形膨大，瓶頸細(xì)長(zhǎng)而彎曲，瓶梗孢子球形至卵形。菌株1905-4分生孢子穗黑色，大而呈球形；分生孢子梗光滑，無(wú)色；頂囊稍膨大，產(chǎn)小梗，小梗雙層，分生孢子粗糙，具褐黑色條紋。菌株1909-7菌落淡黃綠色，分生孢子梗粗糙，分生孢子穗半圓形、圓筒形，顏色如菌落。菌株1913-6菌落青綠色，分生孢子梗從菌絲垂直生出，無(wú)足細(xì)胞，有橫隔膜，粗糙，頂層為小梗菌株1915-2白色菌落，產(chǎn)孢后逐漸變成淺粉紅色，分生孢子梗末端膨大。分生孢子為單細(xì)胞，橢圓形至紡錘形，呈鏈狀、平滑、無(wú)色至黃色，孢梗上具有瓶頸狀不規(guī)則的分枝或輪生分枝，瓶?；枯^寬。輪生分枝由圓柱形的部分組成，有時(shí)分枝向遠(yuǎn)離主軸方向彎曲。

2.6.2 ITS rDNA序列分析

改良CTAB法提取功能地衣真菌的DNA，PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得ITS rDNA片段，在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子系統(tǒng)學(xué)分析確定菌株1905-2為高山彎頸霉（Tolypocladium tropicale），1905-4為塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis），1909-7為黃曲霉（Aspergillus aflatoxiformans），1913-6為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum），1915-2為淡紫擬青霉菌（Purpureocillium lilacinum）。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選得到的高效降解纖維素菌株為1905-2、1909-7、1913-6、1915-2，其中1905-2和1915-2具有抑制病原菌的活性。高效溶磷菌株為1905-4，也具有抑制病原菌的活性。菌株1905-2為高山彎頸霉（T.tropicale），1905-4為塔賓曲霉（A.tubingensis），1909-7為黃曲霉（A.aflatoxiformans），1913-6為產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum），1915-2為淡紫擬青霉菌（P.lilacinum）。目前，曲霉屬、青霉屬和擬青霉屬菌株是在降解纖維素菌株的研究與應(yīng)用中產(chǎn)酶量大、酶系組成比較齊全的霉屬［21］。對(duì)于頸霉屬（Tolypocladium）的研究國(guó)內(nèi)主要集中在新種的發(fā)現(xiàn)及鑒定上，頸霉屬是Gams于1971年建立的新屬，截至目前，國(guó)際真菌名錄數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄了彎頸霉屬有43種［22］。在頸霉屬中得到了具有高效降解纖維素效果的菌株，為頸霉屬生物活性的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。溶磷真菌具有比溶磷細(xì)菌更高的生物活性，但目前還存在著溶磷真菌菌種少的問(wèn)題［23］，從地衣真菌中篩選得到了具有高效溶磷效果的菌株，為溶磷真菌的有效開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)篩選得到功能菌株，進(jìn)行復(fù)合后研制菌劑，以組合4（1905-4、1905-2）、組合5（1905-4、1915-2）和組合6（1905-4、1915-2、1909-7）作為菌劑研制的實(shí)驗(yàn)組，探究其對(duì)黃瓜苗的促生作用。組合5在莖長(zhǎng)和鮮重上占有優(yōu)勢(shì)，且組合5的溶磷效果及降解纖維素效果最好，因此綜合選取以組合5所研制的生物菌劑作為最終的微生物菌劑，為微生物菌肥的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用研究前景。

綜上，從地衣真菌中篩選出高效功能真菌，同時(shí)以不同菌株組合研制生物菌肥探究其對(duì)黃瓜苗的促生作用，找到促生效果最好的組合菌劑，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上對(duì)篩選出的高效真菌進(jìn)行產(chǎn)酶條件的探索及優(yōu)化，以期大幅度提高功能菌株生物活性，同時(shí)對(duì)高效菌株生物活性的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，對(duì)生物菌劑將探究其組合條件的優(yōu)化，以期獲得工業(yè)化的生產(chǎn)。