夏振遠(yuǎn)，谷醫(yī)林，張宏越，魏海雷*

（1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，但是長(zhǎng)期以來(lái)由于連作和大量化肥的施用，導(dǎo)致土傳病害發(fā)生嚴(yán)重，煙區(qū)土壤質(zhì)量退化，煙葉品質(zhì)逐年下降［1］。煙草黑脛病是由煙草致病疫霉（Phytophthora nicotiana）引起的一類(lèi)土傳真菌病害［2］。該病常致煙草矮化、萎焉、葉片發(fā)黃、根和莖基部壞死，是煙草生產(chǎn)中為害最重的病害之一。由于煙草的特殊性，化學(xué)農(nóng)藥防治受到很大限制，也不能滿足綠色生態(tài)發(fā)展的需求。通過(guò)研制兼具土壤營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和防病促生的微生物制劑，改善煙田土壤化學(xué)和生物性狀，調(diào)控土壤養(yǎng)分的供給和利用率，控制病害發(fā)生發(fā)展是實(shí)現(xiàn)煙草農(nóng)業(yè)綠色防控、提質(zhì)增效的重要手段。在最近的研究中，李倩等［3］報(bào)道了一種微生物制劑的使用可以顯著增加土壤細(xì)菌、放線菌、自生固氮菌、無(wú)機(jī)磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌的數(shù)量，從而提高了土壤脫氫酶、脲酶和蔗糖酶活性，并對(duì)煙草土傳病害有一定防效。另一項(xiàng)研究表明，施用復(fù)合微生物菌劑、腐熟劑和溶磷劑能顯著提高烤煙的農(nóng)藝性狀，上等煙比例、畝產(chǎn)量、畝產(chǎn)值均顯著增加，其中產(chǎn)值增加可達(dá)32%以上［4］。在其他作物中，復(fù)合微生物制劑也同樣起到了顯著效果。麻耀華等［5］對(duì)不同生育時(shí)期的黃瓜施入復(fù)合微生物制劑，根際土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量明顯增加，土壤脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶活性提高了一倍以上。由此可見(jiàn)，篩選和開(kāi)發(fā)復(fù)合微生物制劑是一種行之有效的措施。本研究前期已篩選了大量煙草根際微生物，現(xiàn)通過(guò)對(duì)效果良好的菌株進(jìn)行復(fù)合篩選和評(píng)價(jià)，以期獲得兼具土壤調(diào)節(jié)和防病促生的復(fù)合微生物制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙草品種

采用生產(chǎn)主栽品種云煙99。

1.1.2 微生物菌種

采用實(shí)驗(yàn)室從北京、云南等地分離保存的根際益生菌芽孢桿菌S711（Bacillussp.）、假單胞菌S1130（Pseudomonassp.）、鞘氨醇菌S1191（Sphingobiumsp.）和不動(dòng)桿菌S1063（Acinetobactersp.）。由S711、S1130、S1063制備復(fù)合微生物制劑T1，由S711、S1130、S11191制備復(fù)合微生物制劑T2，活菌含量均為1×109cfu/mL。

1.1.3 拮抗、解磷、解鉀、產(chǎn)酶和生長(zhǎng)素檢測(cè)

對(duì)煙草致病疫霉（Phytophthora nicotiana）的拮抗采用對(duì)峙培養(yǎng)法［6］。其他功能檢測(cè)參考文獻(xiàn)［7-10］。

1.1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別施用復(fù)合微生物制劑T1、T2為處理組，每盆加入終濃度為1×108cfu/g的復(fù)合微生物制劑，攪拌均勻，以不施入復(fù)合微生物制劑為對(duì)照（CK）。移入煙草苗，待4周后傷根接種10 mL 1×106cfu/mL的煙草致病疫霉，15 d后檢測(cè)記錄結(jié)果。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 土壤酶活性測(cè)定

土壤酶活性測(cè)定方法參考已發(fā)表論文并作部分改進(jìn)［11-14］。土壤脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的NH3-N毫克數(shù)表示；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的葡萄糖毫克數(shù)表示。過(guò)氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，以每克土消耗0.1 mol/L KMnO4毫升數(shù)表示。根際土壤呼吸強(qiáng)度由便攜式土壤呼吸分析儀SRS-SD1000測(cè)定。采用氯仿熏蒸浸提法提取土壤微生物量碳和微生物量氮，采用K2Cr2O7氧化法測(cè)定浸提液中的微生物量碳，采用凱氏定氮法測(cè)定微生物生物量氮。利用土壤微生物基礎(chǔ)呼吸與微生物量碳的比值計(jì)算土壤微生物代謝熵（qCO2）。

1.2.2 病情指數(shù)與防治效果

參照煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法［15］，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)＝100×Σ（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）

防治效果（%）＝（對(duì)照病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan’s進(jìn)行差異顯著性分析，不同處理間顯著差異水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的有益生物學(xué)功能

首先對(duì)供試菌株進(jìn)行全面的有益功能檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。S711與S1130均對(duì)煙草致病疫霉具有顯著的抑制作用，而S1191與S1063無(wú)此功能。S711無(wú)解有機(jī)、無(wú)機(jī)磷、產(chǎn)嗜鐵素和生長(zhǎng)素的能力，但是該菌株具有很強(qiáng)的產(chǎn)氨、蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力。S1130與S711相比，雖不產(chǎn)酶但其解鉀、產(chǎn)嗜鐵素和生長(zhǎng)素能力顯著，并具有一定的有機(jī)磷分解能力。S1063與其他菌株相比具有突出的分解有機(jī)磷的能力，而S1191表現(xiàn)出多種功能，如分解有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷、解鉀、產(chǎn)嗜鐵素、產(chǎn)氨和生長(zhǎng)素以及蛋白酶等特性。由此可見(jiàn)，本研究所采用的菌株具有功能多樣性，各自具有獨(dú)特的有益功能，可以作為復(fù)合微生物制劑的備選。

表1 菌株功能特性

2.2 土壤酶活性

兩種復(fù)合微生物制劑（T1、T2）的施用不同程度上影響了根際土壤脫氫酶、脲酶、蔗糖酶和過(guò)氧化氫酶的活性（表2）。復(fù)合微生物制劑T1雖然對(duì)土壤酶活性有一定提高，但其作用顯著低于復(fù)合制劑T2。尤其過(guò)氧化氫酶的活性，T2處理后顯著高于對(duì)照和T1，而T1對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶無(wú)顯著影響。復(fù)合微生物制劑T2的施用對(duì)脲酶和蔗糖酶活性的提高最為顯著，其值分別達(dá)到1.68和30.32 mg/（g·d）。由此說(shuō)明制劑T2對(duì)調(diào)節(jié)土壤營(yíng)養(yǎng)供給具有顯著效果。

表2 復(fù)合微生物制劑對(duì)土壤酶活性的影響

2.3 土壤微生物活性

由于復(fù)合微生物制劑的施用提高了土壤酶活性，因此推測(cè)土壤微生物的活性可能也受到了影響。從圖1來(lái)看，T1和T2均顯著提高了土壤微生物量碳、氮和土壤呼吸強(qiáng)度。且T2對(duì)土壤微生物活性的影響顯著高于T1。從微生物代謝熵值可以發(fā)現(xiàn)，T1處理沒(méi)有顯著變化，而T2顯著降低了土壤微生物代謝熵。由此推斷復(fù)合微生物制劑改善了煙株根際土壤環(huán)境，微生物生長(zhǎng)與代謝增強(qiáng)。

2.4 黑脛病防治效果

本研究所選用的有益微生物具有多種生防特性，由此檢測(cè)了各復(fù)合制劑對(duì)煙草黑脛病的防治效果。接種煙草致病疫霉后15 d，對(duì)照病情指數(shù)達(dá)到了73.2%，而施用復(fù)合微生物制劑的處理均顯著降低了發(fā)病率。復(fù)合微生物制劑T1處理的煙草黑脛病指數(shù)為56.6%，防效僅為22.7%；制劑T2處理后黑脛病指數(shù)低于20%，僅為17.3%，防效顯著高于T1，達(dá)到76.4%，且經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立重復(fù)后防效穩(wěn)定。因此，復(fù)合微生物制劑T2具有明顯的煙草黑脛病防治功能。

表3 復(fù)合微生物制劑對(duì)煙草黑脛病的防治效果

3 討論與結(jié)論

土壤是植物生長(zhǎng)的根基，土壤質(zhì)量是植物健康生長(zhǎng)的重要保證。良好的土壤環(huán)境可以增強(qiáng)微生物代謝活動(dòng)，提高呼吸強(qiáng)度，降低代謝熵，促進(jìn)碳氮源的利用率。許多土壤有益微生物可通過(guò)分泌土壤酶、參與有機(jī)質(zhì)降解和驅(qū)動(dòng)養(yǎng)分循環(huán)，改善土壤的理化及生物學(xué)性質(zhì)，并通過(guò)拮抗、寄生及溶菌等作用抑制有害病原菌的侵染和繁殖，促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)，進(jìn)而提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)［16-19］。本研究采用了能夠拮抗病原菌、產(chǎn)酶、解磷、解鉀、產(chǎn)嗜鐵素和生長(zhǎng)素的菌株，通過(guò)對(duì)優(yōu)良菌株的組合使用，改善了土壤環(huán)境，降低了煙草黑脛病的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)了多功能互補(bǔ)。

拮抗作用是目前病害生防菌篩選中的首選指標(biāo)，也是次生代謝產(chǎn)物中抑制病原菌生長(zhǎng)最直觀、最簡(jiǎn)便、最有效的因素［20］。本研究中的S711和S1130均具有非常強(qiáng)的抑制煙草致病疫霉的作用，因此在兩種復(fù)合微生物制劑中均同時(shí)使用了這兩株菌。其中S711屬于芽孢桿菌，此類(lèi)菌代謝廣泛，可產(chǎn)生多種抗生素、抗菌肽和水解酶，其根部定殖和環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物農(nóng)藥和微生物肥料的主成分。S711菌株具備芽孢桿菌特有的拮抗病原菌的能力，以及產(chǎn)氨、產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力。S1130屬于假單胞菌，這類(lèi)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，在自然界中廣泛存在。尤其在植物根際部分，所篩選到的具有生防活性的細(xì)菌絕大部分屬于假單胞菌屬，代表菌株如P.aureofaciens30-84，P.fluorescensCHA0，P.kilonensisF113，P.fluorescensQ2-87，P.fluorescensPf-5等［21-23］。假單胞菌作為生防菌有其自身的優(yōu)勢(shì)，它所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)較多，在植物根圍中可以被植物選擇性的利用。另外，假單胞菌具有很強(qiáng)的根部定殖能力，很多菌株可產(chǎn)生刺激植物生長(zhǎng)的激素，本研究中S1130即可產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素。復(fù)合微生物制劑T1和T2的區(qū)別在于第3個(gè)菌株的選擇，T1選用了S1063，而T2選用了S1191。S1063屬于不動(dòng)桿菌，該菌株具有顯著的降解有機(jī)磷的能力，以及一定的無(wú)機(jī)磷降解和產(chǎn)氨、產(chǎn)嗜鐵素的能力。S1191屬于鞘醇屬，除了具備S1063的有益功能外，還具有顯著的產(chǎn)嗜鐵素、蛋白酶和生長(zhǎng)素的能力。嗜鐵素是一種低分子量但對(duì)三價(jià)鐵高親和性的螯合物，可以將鐵運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌細(xì)胞內(nèi)。嗜鐵素造成的鐵缺乏環(huán)境會(huì)阻止真菌孢子的萌發(fā)，這種有效的鐵吸收機(jī)制可能是這些菌株能夠與其它微生物競(jìng)爭(zhēng)而在植物根部有效定殖的重要原因［24］。復(fù)合微生物制劑T2中所特有的產(chǎn)水解酶和生長(zhǎng)素特性也可能是其改善土壤環(huán)境、防治病害的重要因素。已有研究表明，有益微生物產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶等真菌細(xì)胞壁水解酶在與病原菌相互作用中發(fā)揮重要的作用，可對(duì)病原菌孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)和菌絲生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用［25-26］。

綜上所述，利用復(fù)合微生物制劑可以達(dá)到改善土壤性質(zhì)和防治病害的目的。本研究通過(guò)對(duì)有益微生物篩選和組合后創(chuàng)制的復(fù)合微生物制劑T2顯著提高了土壤酶和微生物活性，降低了煙草黑脛病的發(fā)病率和病情指數(shù)，具有潛在改良土壤和防治土傳病害的開(kāi)發(fā)價(jià)值。