沈建平，張明宇，劉高峰，李小龍*，石德興，王 巖

（1.南平市煙草公司邵武分公司，福建 邵武 354000；2.鄭州大學(xué)，化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001）

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種細(xì)菌性的土傳病害［1］，在高溫高濕的條件下，容易大面積爆發(fā)，造成煙區(qū)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量下降，甚至絕收［2］。以往對煙草青枯病的防控措施主要有抗病品種的選育［3］、化學(xué)藥劑防控［4］及改善栽培管理［5］等方面，然而，這些防控措施也存在著抗病品種選育周期長，需要大量人力物力，化學(xué)藥劑破壞環(huán)境，輪作方式受土地限制等諸多問題［6］。

石灰氮作為肥料使用已經(jīng)有超過百年的歷史，由于其轉(zhuǎn)化過程的中間和最終產(chǎn)物都會(huì)對作物產(chǎn)生毒害作用，其推廣應(yīng)用受到了一定影響［7］。隨著技術(shù)進(jìn)步和研究的深入，石灰氮作為一種具有補(bǔ)充Ca、Mg等中量元素、改良土壤和土壤殺菌等多種功效的氮素肥料再次進(jìn)入了農(nóng)業(yè)的使用范圍［8］。石灰氮在土壤中緩慢水解，生成氫氧化鈣和氰氨，氰氨對土壤微生物具有較強(qiáng)的殺滅作用，并逐漸水解形成尿素或氨，直接被植物吸收［9］。以往的研究表明施用石灰氮能有效改善土壤理化性狀和防治土傳病害［10］，但石灰氮施用對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生的影響方面研究較少。因此，本試驗(yàn)通過高通量測序技術(shù)研究了施用石灰氮對煙株根際微生物區(qū)系和煙草青枯病發(fā)病率的影響，旨在為合理施用石灰氮以實(shí)現(xiàn)防控?zé)煵萸嗫莶〉哪康摹?/p>

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018年2～8月在福建省邵武市沿山鎮(zhèn)煙草基地（26°55′～27°35′N，117°2′～117°52′E）進(jìn)行。邵武市屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫和濕潤、日照充足、雨量充沛，常年平均降水量1800 mm左右，年平均氣溫18℃。試驗(yàn)地點(diǎn)海拔200～250 m，試驗(yàn)期間平均氣溫28.5℃，降水量較大。

1.2 煙田常規(guī)施肥管理

供試烤煙品種為K326，試驗(yàn)地前茬作物均為水稻，對往年病害情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并選取青枯病發(fā)病率相近的地塊進(jìn)行試驗(yàn)。供試煙田土壤為砂質(zhì)壤土，土壤pH值5.3，有機(jī)質(zhì)含量24.5 g/kg，堿解氮含量119.6 mg/kg，速效鉀含量204.3 mg/kg，有效磷含量217.8 mg/kg。移栽前以條溝方式施用腐熟牛糞有機(jī)肥1500 kg/hm2和鈣鎂磷肥（P2O516%）450 kg/hm2后起壟并覆蓋地膜。移栽時(shí)施煙葉專用肥465 kg/hm2，有效百分比為N∶P2O5∶（K2O）=12.5∶8∶22.5，團(tuán)棵期追施硝酸鉀300 kg/hm2，旺長期追施硫酸鉀345 kg/hm2。

1.3 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理，每個(gè)處理小區(qū)面積為666.7 m2。處理1（T1）為空白對照，即煙株移栽前施用腐熟牛糞有機(jī)肥、鈣鎂磷肥，起壟后及時(shí)覆蓋塑料膜，煙株移栽時(shí)再施用常規(guī)煙葉專用肥；處理2（T2）在移栽前施用腐熟牛糞有機(jī)肥和675 kg/hm2的石灰氮，起壟后及時(shí)覆蓋塑料膜。通過石灰氮施入的N量完全替代移栽時(shí)煙葉專用肥的N素，不足的磷、鉀肥在煙苗移栽時(shí)以單質(zhì)肥料形式補(bǔ)足。兩處理均于團(tuán)棵期追施硝酸鉀和旺長期追施硫酸鉀的數(shù)量相同。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。試驗(yàn)用石灰氮為灰白色粉未，N素含量約20%，CaO含量約為35%，pH為11.5。該肥料在土壤中養(yǎng)分釋放相對緩慢，因而肥效高。

1.4 測定內(nèi)容及方法

1.4.1 土樣采集

分別在煙株移栽前（編號(hào)YZ）、團(tuán)棵期（移栽后40 d，編號(hào)TK）、旺長期（移栽后70 d，編號(hào)WZ）和成熟期（移栽后100 d，編號(hào)CS），采用S型五點(diǎn)取樣法采取煙株根際土壤。取樣時(shí)首先去除煙株根部表層土壤，于煙株莖部為中心直徑10 cm左右、深10 cm左右處的土壤進(jìn)行取樣。取樣后用密封袋低溫封存，用15 mL離心管裝滿立即送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對微生物進(jìn)行基因測序。

1.4.2 微生物基因測序

土壤冷凍樣品微生物（包括細(xì)菌和真菌）測序采用第二代高通量測序技術(shù)，對煙株不同生長時(shí)期的土壤樣本進(jìn)行細(xì)菌（16S rDNA）和真菌（18S rDNA）序列檢測。

DNA抽提和PCR擴(kuò)增：根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用Nano Drop 2000進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠泳檢測DNA的提取質(zhì)量；細(xì)菌16S用338F（5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；真菌18S用SSU081F（5’-TTAGCATG GAATAATRRAATAGGA-3’）和1196R（5’-TCTG GACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物對V5-V7可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

Illumina Miseq測序：使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用Quanti FluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫，16S為PE2*300文庫，18S為PE2*250文庫。用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中。

數(shù)據(jù)處理：原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，使用的UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。

1.4.3 病情指數(shù)測定

為了評估石灰氮對煙草青枯病的防治效果，在煙株移栽后每隔l0 d記載發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)病情，計(jì)算青枯病的發(fā)病率、病情指數(shù)和防控率。青枯病病情指數(shù)的分級(jí)調(diào)查按照《GB/T 23222-2008煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》進(jìn)行。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100；

病情指數(shù)（%）=（Σ各級(jí)病株數(shù)或葉數(shù)×該病級(jí)值）/調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高級(jí)值）×100；

防治效果（%）=（對照病情指數(shù) - 處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

微生物數(shù)量采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性分析和主成份分析采用SPSS 20.0。測序數(shù)據(jù)在I-Sanger生物信息分析云平臺(tái)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石灰氮對土壤微生物區(qū)系的影響

2.1.1 石灰氮對土壤細(xì)菌群落組成的影響

如圖1所示，在門水平上共列出12種在樣本中占比大于1%的物種，如果將相對豐度＞10%的細(xì)菌劃分為優(yōu)勢類群，則樣本中共有5種優(yōu)勢物種，其相對豐度占樣本總量的80%以上。對優(yōu)勢類群在各個(gè)時(shí)期進(jìn)行分析的結(jié)果表明，移栽前3個(gè)平行樣本菌落結(jié)構(gòu)無明顯差異。變形菌門（Proteobacteria）在整個(gè)煙株生長過程中表現(xiàn)出先減少后增多的趨勢，處理組略低于對照。綠彎菌門（Chloroflexin）在團(tuán)棵期對照、處理組中的相對豐度分別為20.3%、23.2%，在旺長期對照、處理組中的相對豐度分別為16.1%、19.1%，在成熟期對照與處理組中差異不明顯。放線菌門（Actinobacteria）在移栽前的土壤樣本中相對豐度較少，進(jìn)入團(tuán)棵期后相對豐度增加，成熟期處理組略低于對照。酸桿菌門（Acidobacteria）在移栽前的土壤樣品中相對豐度較高，進(jìn)入團(tuán)棵期后明顯減少，進(jìn)入旺長期后表現(xiàn)為處理組略高于對照。厚壁菌門（Firmictes）在整個(gè)煙株生長時(shí)期內(nèi)在土壤樣本中的相對豐度先增加后減少，團(tuán)棵期對照、處理組中的相對豐度分別為9.0%、7.7%，旺長期對照、處理組中的相對豐度分別為11.4%、6.8%，成熟期差異不顯著。非優(yōu)勢菌種中，值得注意的是硝化螺旋菌門（Nitrospirae）在整個(gè)煙株生長過程中均表現(xiàn)為處理組明顯高于對照，團(tuán)棵期對照、處理組中的相對豐度分別為0.60%、0.93%，旺長期對照、處理組中的相對豐度分別為0.70%、1.29%（P＜0.05）。試驗(yàn)表明，施用石灰氮在團(tuán)棵期與旺長期對煙株根際土壤細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)影響較大，且能明顯增加煙株根際土壤中硝化螺旋菌門（Nitrospirae）的相對豐度。

2.1.2 石灰氮對真菌群落組成的影響

如圖2所示，在真菌門水平上共列出7種在樣本中占比大于1%的物種，其中子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān) 子菌 門（Basidiomycota）為 優(yōu)勢物種，占樣本總量的95%以上。其中子囊菌門（Ascomycota）在整個(gè)煙株生長時(shí)期內(nèi)表現(xiàn)為處理組顯著低于對照，團(tuán)棵期在對照、處理組中的相對豐度分別為76.7%、61.2%，旺長期分別為78.7%、73.0%，成熟期分別為79.2%、68.6%。擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在整個(gè)煙株生長時(shí)期內(nèi)表現(xiàn)為處理組顯著高于對照，團(tuán)棵期在對照、處理組中的相對豐度分別為17.9%、36.8%，旺長期分別為11.5%、22.9%（P＜0.05），成熟期分別為12.3%、23.1%。各非優(yōu)勢物種在團(tuán)棵期與旺長期均表現(xiàn)為處理組明顯低于對照。試驗(yàn)表明施用石灰氮降低了煙株根際土壤中子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度，增加了擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的相對豐度，且在團(tuán)棵期與旺長期明顯改變了煙株根際土壤真菌菌落結(jié)構(gòu)。

2.1.3 石灰氮對煙株根際土壤微生物Alpha多樣性的影響

表1 煙田土壤中細(xì)菌微生物的Alpha多樣性

細(xì)菌Alpha多樣性如表1所示，環(huán)境中微生物的多樣性分析可以反映微生物群落的相對豐度和多樣性變化。Coverage指數(shù)是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高則樣本中序列被測出的概率越高。本試驗(yàn)中各樣本細(xì)菌的Coverage指數(shù)都在94%以上，表明本次測序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況。Sobs指數(shù)表示豐富度實(shí)際觀測值，既OTU數(shù)目，可表示樣本中物種數(shù)量的多少，其在移栽前為最高，在整個(gè)煙株生長時(shí)期均表現(xiàn)為處理組高于對照，旺長期差異最為顯著，對照、處理組中分別為2941、3127。Shannon指數(shù)能反映群落多樣性，其指數(shù)值越大說明群落多樣性越高，其在旺長期開始表現(xiàn)出顯著差異，在對照、處理組中分別為6.75、6.96，成熟期在對照、處理組中分別為6.77、6.84。Chao指數(shù)反映群落豐富度，指數(shù)越大群落豐富度越高，其僅在旺長期表現(xiàn)為處理組略高于對照。表明施用石灰氮增加了煙株根際土壤中細(xì)菌的數(shù)量和群落多樣性。

真菌Alpha多樣性如表2所示，Sobs指數(shù)在團(tuán)棵期的對照、處理組中分別為257、230，進(jìn)入旺長期后差異減小，但均表現(xiàn)為處理組低于對照。Shannon指數(shù)僅在旺長期表現(xiàn)為處理組高于對照，其余時(shí)期均表現(xiàn)為處理組略低于對照。Chao指數(shù)在整個(gè)煙株生長時(shí)期均表現(xiàn)出處理組低于對照。表明施用石灰氮降低了煙株根際土壤中細(xì)菌的數(shù)量和群落豐富度。

2.1.4 石灰氮對煙株根際土壤微生物Beta多樣性的影響

PCA主成分分析能夠反映不同調(diào)控措施下煙株根際土壤微生物區(qū)系的變化情況，樣本相似度越高，在圖像中表現(xiàn)越聚集。圖3a為細(xì)菌屬水平PCA圖，移栽前未施用石灰氮，3樣本為平行樣，可以很好地聚集說明細(xì)菌群落相似度較高，團(tuán)棵期對照與處理之間開始表現(xiàn)出差別，對照與處理之間平行樣本各自聚集且區(qū)別明顯，表明施用石灰氮明顯改變了煙株根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。隨著煙株生長其根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)一步增大，表明石灰氮的施用改變了煙株根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演化方向。圖3b為真菌PCA圖，可以看出，隨著煙株生長其根際真菌群落在朝著一定的方向演化，這點(diǎn)與細(xì)菌相似，但處理組與對照差異不明顯，表明施用石灰氮對煙株根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響程度弱于細(xì)菌。

2.1.5 石灰氮對煙株根際土壤微生物區(qū)系及物種差異的影響

為了找出處理組與對照之間的差異物種，將對照與處理組在4個(gè)時(shí)期微生物的群落相對豐度數(shù)據(jù)分別整合成T1、T2兩組，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測不同組（樣本）微生物群落中表現(xiàn)出的豐富度差異的物種，進(jìn)行假設(shè)性檢驗(yàn)，評估觀察到的差異顯著性，從而得到具有顯著差異的物種。細(xì)菌在屬水平上共列出15種差異物種（圖4a），其中鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、黃桿菌屬（Flavisolibacte）等7種物種表現(xiàn)為處理組顯著高于對照，其余則表現(xiàn)為處理組顯著低于對照，這3種菌均能參與土壤氮循環(huán)與轉(zhuǎn)化，表明施用石灰氮可以顯著改變土壤中某些功能菌的相對豐度。而真菌（圖4b）在屬水平共有7種在物種相對豐度上表現(xiàn)出顯著差異的物種，其中假霉樣真 菌 屬（Pseudallescheria）、norank_k__Fungi、unclassified_k__Fungi、酵母菌目下的屬（unclassifiedo__Saccharomycetales）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）表現(xiàn)為處理組顯著低于對照。

2.2 施用石灰氮對煙葉產(chǎn)量及發(fā)病率的影響

2.2.1 石灰氮對煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)的影響

如表3所示，施用石灰氮的處理組與對照相比產(chǎn)量提高了11.7%，均價(jià)提高了4.3%，中上等煙比例提高了8.7%，表明石灰氮達(dá)到防控青枯病及改變煙株根際土壤微生物區(qū)系的同時(shí)也達(dá)到了增產(chǎn)和增值的效果。

表3 不同處理經(jīng)濟(jì)性狀對比

2.2.2 煙株發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)

如表4所示，在對照中發(fā)病率為75.3%，施用石灰氮后青枯病的發(fā)病率顯著降低，在處理組中發(fā)病率為41.2%，其防控效果分別為49.9%，表明施用石灰氮能對煙草青枯病有較好的防控效果。

表4 不同處理的青枯病防控效果 （%）

3 結(jié)論與討論

石灰氮施用在土壤后，Alpha多樣性表明石灰氮不僅減少了煙株根際土壤微生物的數(shù)量，同時(shí)降低了其群落多樣性與豐富度，物種組成分析表明，綠彎菌門（Chloroflexin）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）等優(yōu)勢菌種在該時(shí)期表現(xiàn)出差異，說明施用石灰氮在前期改變了煙株根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。這主要是石灰氮遇水分解后所生成的液體氰胺與氣體氰胺，對土壤中的真菌、細(xì)菌等有害生物具有廣譜性的殺滅作用，而起壟后覆蓋地膜，在日光照射下可以提高土壤溫度，經(jīng)過熱力滅菌作用，達(dá)到殺死土壤有害生物的目的［10］。

而根據(jù)黃國峰等［11］的研究結(jié)果表明，施用石灰氮后的前期對土壤中的微生物數(shù)量抑制效果顯著，但施用石灰氮對土壤微生物數(shù)量沖擊比較柔和，各菌種在定殖20 d后其數(shù)量可恢復(fù)到正常水平。旺長期根際土壤細(xì)菌的各物種多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為處理組顯著高于對照，PCA分析顯示此時(shí)處理組煙株根際土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)與對照明顯不同。推測其原因可能是：施用石灰氮雖滅殺了大量的土壤微生物，但也提供了許多土壤微生物生態(tài)位［12］，旺長期煙株根系大量可溶性的分泌物為細(xì)菌提供了足夠的有效性碳源［13］，而植物主要是通過根際分泌物影響土壤微生物群落組成［14］。石灰氮分解也為微生物提供了氮源，創(chuàng)造了土壤微生物定殖的條件，同時(shí)也增加了鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、黃桿菌屬（Flavisolibacte）等與土壤氮循環(huán)有關(guān)的功能菌的相對豐度。鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）是土壤主要有益菌之一，可促進(jìn)煙株根際吸收營養(yǎng)，抵抗多種病原菌，還有研究表明，鞘脂單胞菌屬中某些菌株具有固氮和脫氫特性，在維持土壤氮平衡方面起著重要作用［15］；硝化螺旋菌屬（Nitrospira）可以將硝化菌氧化土壤氨生成的亞硝酸繼續(xù)氧化成硝酸鹽，而硝酸鹽是土壤中作物易吸收的氮源形式，因此土壤中硝化螺旋菌的增加可以間接地增加土壤氮肥力［16］，雖然石灰氮的中間產(chǎn)物在前期會(huì)對硝化細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，但隨著煙株生長其中間產(chǎn)物會(huì)在土壤中分解或被其他土壤微生物轉(zhuǎn)化，在后期石灰氮分解產(chǎn)生的氨為硝化細(xì)菌大量定殖創(chuàng)造了條件；另外根據(jù)梁志婷［17］的研究結(jié)果表明，黃桿菌屬（Flavisolibacte）被認(rèn)為參與了土壤氮代謝過程。這些因素共同作用使處理組煙株根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)朝不同的方向演化，進(jìn)而在成熟期的煙株根際逐漸形成具有更高物種多樣性及豐富度的微生物群落。而高水平的微生物多樣性能夠抑制土傳病害的發(fā)生，提高土壤質(zhì)量［18-20］，最終達(dá)到降低青枯病發(fā)病率、提高煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)的目的。由于施用石灰氮對煙株根際微生物的殺滅作用具有廣泛性，所以在殺滅病原菌的同時(shí)也會(huì)殺滅益生菌。在施用石灰氮一段時(shí)間后如團(tuán)棵期或旺長期，在土壤中施加益生菌，其對煙株根際土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的影響有待進(jìn)一步探究。