孫鴿,張偉,黃立群,許文黎,高潔,劉歡,秦秀軍,李建國

(中國輻射防護研究院GLP中心，太原，030006)

锝[99mTc]GSA注射液是99mTc 標記的注射亞錫半乳糖酰人血清白蛋白二亞乙基三胺五乙酸鹽注射用溶液，是一種放射性顯像劑，可特異性地對肝臟顯像，可用于肝病的早期診斷以及肝臟代謝、生理和病理研究[1-2]。放射性診斷制劑因需在較短時間內(nèi)達到目標組織器官進行顯像，通常以靜脈注射方式為主，以快速隨血液循環(huán)系統(tǒng)到達全身，其特殊毒理包括刺激性和過敏性兩方面。2021年，我國國家藥品監(jiān)督管理局頒布實施了《放射性體內(nèi)診斷藥物非臨床研究技術(shù)指導原則》，規(guī)定了放射性體內(nèi)診斷藥物應開展的臨床前評價內(nèi)容，其中采用其最終制劑進行溶血性、刺激性和過敏性研究是必要內(nèi)容[3]。本研究對锝[99mTc]GSA注射液開展臨床前血管刺激性和全身主動過敏性研究，為放射性藥物臨床安全應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1受試物

锝[99mTc]GSA注射液為高锝[99mTc]酸鈉溶液(Na99mTcO4)與GSA凍干制劑標記合成的注射用溶液，Na99mTcO4溶液由鉬锝發(fā)生器淋洗制得，鉬锝發(fā)生器由原子高科股份有限公司生產(chǎn)，批號20191207-1，活度18.5 GBq；GSA凍干藥盒，北京師宏藥物研制中心，規(guī)格3 mg/瓶，批號191024。

1.1.2實驗動物

血管刺激性實驗采用普通級日本大耳白兔6只，2.0～3.0 kg，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0007。主動全身過敏性實驗采用SPF級Hartley豚鼠，雌雄各20只，體重300～400 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2017-0005。

動物均飼養(yǎng)于放射性實驗設施普通環(huán)境內(nèi)，實驗動物使用許可證號：SYXK(晉)2019-0002，輻射安全許可證號：國環(huán)輻證(00346)。

1.1.3儀器設備

CRC-25R放射性核素活度計，美國CAPINTEC INC公司；Mini-Scan薄層掃描儀，美國 Eckert & Ziegler Radiopharma Inc 公司；Histocentre 3 石蠟包埋機、Finesse 325石蠟切片機、Excelsior全自動組織脫水機，英國Shandon；BX53熒光顯微成像系統(tǒng)，日本Olympus公司。

Xγ 個人劑量報警儀，F(xiàn)J-3200，劑量當量率0.1～500 mSv/h，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司生產(chǎn)；環(huán)境級Xγ 輻射測量儀，F(xiàn)J-1200，0.01～200 μSv/h，中國輻射防護研究院生產(chǎn)；表面污染測量儀，F(xiàn)J-1210，0～105 cps，中國輻射防護研究院生產(chǎn)；熱釋光個人劑量計，IDB-III，中國輻射防護研究院提供及定期檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1血管刺激性實驗

(1)溶液要求：血管刺激性實驗理論設計濃度為臨床擬用最大放射性濃度185 MBq/mL，給藥時溶液放射性濃度誤差應不大于10%，且放射化學純度應大于90%。

(2)溶液制備過程：實驗前，從鉬锝發(fā)生器淋洗出新鮮Na99mTcO4溶液，以氯化鈉注射液稀釋至放射性濃度約200 MBq/mL，以1 mL/瓶加入到GSA凍干藥盒，充分溶解，室溫反應不少于5 min，標記完成后檢測活度并取少量用于放射化學純度分析，根據(jù)放射性核素衰變速度，需在30 min內(nèi)完成給藥。

(3)實驗：實驗使用普通級日本大耳白兔6只，采取同體左右側(cè)自身對比法，每只兔左側(cè)耳緣靜脈給予受試物溶液，右側(cè)給予等體積0.9%氯化鈉注射液作為對照，受試物溶液放射性濃度184 MBq/mL，放射化學純度100%，給藥劑量為64 MBq/kg，單次給藥。

(4)評價：給藥期間及恢復期期間肉眼觀察注射部位是否出現(xiàn)充血、水腫等刺激反應癥狀并評分，給藥結(jié)束72 h后擊打法處死3只動物，取材兩側(cè)耳緣靜脈及周圍組織，剩余動物繼續(xù)恢復14天后取材，對兔耳進行組織病理學檢查并分級(見表1)，計算給藥結(jié)束和恢復期結(jié)束病理平均分級，評價受試物對血管是否具有刺激性，病理及刺激評分標準均依據(jù)《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導原則》[4]，刺激程度與分級標準為：0.0～0.4為無刺激；0.5～1.4為輕微刺激；1.5～2.4為輕度刺激；2.5～3.4為中度刺激。

表1 血管刺激性實驗病理組織分級標準

1.2.2主動全身過敏性實驗

(1)溶液要求：主動全身過敏性實驗高濃度和低濃度溶液理論設計分別為27.75 MBq/mL和9.25 MBq/mL，誤差允許不大于10%，且溶液的放射化學純度均應大于90%。

(2)溶液制備過程：每次實驗前，從鉬锝發(fā)生器淋洗出新鮮Na99mTcO4溶液，以氯化鈉注射液稀釋至放射性濃度約296 MBq/mL，以1 mL/瓶加入GSA凍干藥盒，充分溶解，室溫反應不少于5 min，標記完成后檢測活度，以氯化鈉注射液分別稀釋至27.75 MBq/mL和9.25 MBq/mL，15 min內(nèi)完成給藥。經(jīng)檢測，三次致敏、兩次激發(fā)給藥前后供試品放射性濃度誤差均小于10%，首次致敏前后低劑量和高劑量溶液的放化純度范圍為90.8%～100%，均大于90%，溶液均符合實驗要求。

(3)實驗：SPF級Hartley豚鼠40只，雌雄各半，依據(jù)體重分段隨機均衡分為陰性對照組(0.9%氯化鈉注射液)、陽性對照組(1%卵白蛋白)、低劑量(單次致敏劑量為13.2 MBq/kg，采用9.25 MBq/mL溶液)和高劑量(單次致敏劑量為39.6 MBq/kg，采用27.75 MBq/mL溶液)組。第1、3、5日腹腔注射0.5 mL/只致敏，末次致敏后第14、21日靜脈注射1.0 mL/只激發(fā)，激發(fā)后30 min內(nèi)觀察動物是否出現(xiàn)過敏反應[4]。過敏反應癥狀及過敏程度判定標準見表2和表3。

表2 過敏反應癥狀

表3 全身致敏性評價標準

1.2.3人員防護裝備及輻射監(jiān)測

锝(99mTc)為γ輻射源，實驗中主要采用鉛屏蔽材料(0.1～10 mm鉛當量)進行外照射的防護。核素制備和分裝時操作者雙手置于手套箱內(nèi)，分裝后的藥物貯存于鉛罐中進行傳遞，給藥抽取和操作均位于鉛屏風后方，所有實驗參與人員必須穿戴鉛衣、鉛帽、鉛圍脖以及防護面罩等防護裝備。實驗過程中對淋洗、標記、藥物分裝和給藥操作崗位的劑量率進行實時檢測，實驗期間(每季度)對所有放射性操作人員有效劑量進行監(jiān)測。

2 結(jié)果

2.1 血管刺激性實驗

實驗期間，動物一般狀態(tài)均良好，給藥當日動物平均體重為2.9 kg，實驗結(jié)束動物平均體重為3.1 kg，體重呈增長趨勢。

給藥后，6只動物給藥側(cè)和對照側(cè)在操作部位(進針部位或針頭活動部位)均出現(xiàn)輕度充血現(xiàn)象，給藥結(jié)束后第5天全部恢復。病理結(jié)果顯示，給藥結(jié)束，對照側(cè)有2例操作部位存在血栓形成或內(nèi)皮細胞腫脹等，為輕微刺激范圍，但藥物作用部位均未見異常，所有動物給藥側(cè)耳緣靜脈及其周圍組織和血管均未見異常，平均分為0，均為無刺激性；恢復期結(jié)束，3只動物耳緣靜脈及其周圍組織和血管均未見異常。

2.2 主動全身過敏性實驗

致敏期間，豚鼠一般狀態(tài)良好，至實驗結(jié)束，各組豚鼠平均體重均呈增長趨勢，實驗期動物各組平均體重無統(tǒng)計學差異。

兩次激發(fā)，陰性對照組8只動物均未觀察到過敏反應癥狀，呈陰性，陽性對照組8只動物呈極強陽性，陽性發(fā)生率100%。(1)首次激發(fā)，低劑量組2只動物未見明顯異常，1只動物激發(fā)后3 min死亡，1只出現(xiàn)顫抖，30 min內(nèi)恢復，高劑量組4只動物均出現(xiàn)咳嗽、痙攣、跳躍過敏反應癥狀，其中3只激發(fā)后3 min內(nèi)死亡；(2)末次激發(fā)，低劑量組3只動物未見明顯異常，1只極強陽性反應死亡；高劑量組有1只無明顯反應，3只動物出現(xiàn)顫抖、步態(tài)不穩(wěn)，其中1只最后死亡，其余2只30 min內(nèi)恢復。取未致敏組動物給予高劑量組和低劑量組溶液1.0 mL/只，動物均未見過敏反應發(fā)生。詳見表4。

表4 主動全身過敏性實驗激發(fā)結(jié)果

3 討論

診斷試劑是指用于診斷或監(jiān)測疾病的藥品，用于評價藥品有效性、安全性、質(zhì)量可控性的原則同樣適用于診斷試劑，亦需考慮評估與診斷試劑使用有關(guān)的獲益和風險。放射性診斷藥物通常包括放射性核素和標記底物兩個部分，本研究中的锝[99mTc]GSA注射液就包括高锝[99mTc]酸鈉和GSA兩種主要成分，實驗設計要兼顧GSA藥盒化學和輻射劑量學2個方面[5]，給藥前對標記后受試物溶液的質(zhì)量進行合理控制[6]，在血管刺激和主動全身過敏性實驗中，放射化學純度均大于90%，給藥階段受試物溶液的放射性濃度均控制在誤差10%以內(nèi)，表明在給藥時效性和核素標記有效性方面均符合實驗要求。

放射性診斷藥物通常單次使用，且注射過程中常首先建立生理鹽水靜注通道，確認注射針頭進入血管后再快速推注藥物，給藥后再對血管進行灌注沖洗，以防止藥液外滲和降低血管刺激性。本研究給藥后肉眼觀察到對照側(cè)和給藥側(cè)操作部位的輕度充血現(xiàn)象，給藥后癥狀逐漸消失，給藥結(jié)束72 h 有2例對照側(cè)操作部位出現(xiàn)血栓形成或內(nèi)皮細胞腫脹等輕度病理變化，可能與注射操作或給藥后止血時間短相關(guān)，且所有動物藥物作用部位均未見異常，顯示受試物單次使用后對兔耳緣靜脈未見引起刺激反應，證明锝[99mTc]GSA注射液注射對血管的局部安全性。主動皮膚過敏性研究，豚鼠出現(xiàn)強陽性過敏反應甚至極強陽性而死亡，與受試物本身性質(zhì)相關(guān)，锝[99mTc]GSA注射液含人血清白蛋白，人血白蛋白和卵白蛋白為《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導原則》推薦的兩種主動全身過敏實驗可采用的致敏陽性物質(zhì)，且受試物對豚鼠為異源蛋白，重復使用會引起豚鼠強過敏反應發(fā)生，在高梅等[7]的研究中亦表明人血白蛋白、卵白蛋白在2～100 mg/只劑量范圍內(nèi)，豚鼠主動全身過敏反應的發(fā)生率為100%。實驗中正常動物給予激發(fā)劑量的受試物后，未見過敏反應發(fā)生，但豚鼠經(jīng)重復致敏后二周內(nèi)可產(chǎn)生特異性IgE抗體，致敏后2～3周靜脈輸入同種抗原，引起速發(fā)型超敏反應發(fā)生，結(jié)果提示，一方面放射性診斷制劑臨床單次使用引起患者過敏反應較低，另一方面臨床4周內(nèi)多次使用可能引起患者速發(fā)型過敏反應發(fā)生，嚴重者可能出現(xiàn)過敏性休克甚至短時間內(nèi)死亡，應密切觀察。

實驗過程中，各工作位點輻射劑量率監(jiān)測結(jié)果顯示，淋洗、標記和給藥作業(yè)人員操作位劑量率較高，最高值為24.925 μSv/h，藥物抽取、分裝臺面污染最嚴重，但污染水平均能低于控制值要求(小于40 Bq/cm2)，操作人員是在鉛屏蔽等防護條件下進行，季度有效劑量均遠遠低于職業(yè)人員年有效劑量限值[8-9]，表明采取的各項防護措施可保障人員輻射安全。由于放射性藥物是帶有放射性的特殊制劑，在實際操作中應根據(jù)不同核素性質(zhì)采取不同防護措施，例如本研究中锝[99mTc]GSA注射液為低毒類放射性診斷藥物，锝[99mTc]主要發(fā)射低能量 γ 射線，可穿透機體和空氣介質(zhì)，實驗操作人員存在潛在暴露風險，這就要求操作過程穿戴鉛衣、鉛圍脖等個人防護裝備，實施嚴格的個人受照劑量監(jiān)測以及環(huán)境污染的監(jiān)測[10-11]；操作125I和131I藥物形成的放射性碘蒸氣容易形成放射性氣溶膠，引起嚴重的放射污染，這些放射性氣溶膠可以通過粘附人體產(chǎn)生外照射以及被人體吸入產(chǎn)生內(nèi)照射，這就要求操作過程中佩戴防護面罩、保持室內(nèi)通風以及加強污染監(jiān)測等措施[12]。

對于放射性顯像藥物的臨床前安全性評價最初主要依據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)《Developing Medical Imaging Drug and Biological Products Part 1: Conducting Safety Assessments》[13]對制劑的安全性進行規(guī)范化的研究，其中的注射劑也需進行血液相容性和刺激性以及過敏性的評估和研究。目前我國國家藥監(jiān)局藥審中心2020年頒布實施的《放射性體內(nèi)診斷藥物非臨床研究技術(shù)指導原則》對注射劑的臨床前安全性評價做了詳細全面的闡述，使放射性診斷藥物的臨床前安全研究具備較為統(tǒng)一和完善的政策和法規(guī)指導。