王志鵬,尹晶晶,許文黎,孫鴿,高潔,張偉,秦秀軍,李建國,劉歡

(中國輻射防護研究院藥物安全性評價中心，太原，030006)

原發(fā)性肝癌(PLC)是一種最常見的惡性腫瘤，我國每年有約13萬人死于原發(fā)性肝癌[1]。目前肝癌的臨床治療主要包括手術(shù)切除、放療、化療、靶向治療等。近年來，放療栓塞治療(TARE)，因其能夠?qū)⒎派湫运幬锞珳?zhǔn)栓塞于腫瘤部位，成為臨床應(yīng)用研究的熱點[2]。但是相關(guān)療法和藥物的研發(fā)，需要類似人肝癌轉(zhuǎn)移的動物模型和相關(guān)介入療法的臨床前試驗來驗證其安全性和有效性。VX2兔肝癌原位模型是迄今為止唯一能夠在較大動物建立的肝轉(zhuǎn)移性腫瘤模型，該模型多用于肝臟腫瘤的影像學(xué)和治療學(xué)研究[3-6]。該模型腫瘤發(fā)展過程與人肝癌相似，是最理想的肝癌實驗?zāi)Ｐ?，在該模型上開發(fā)出的藥物和療法對指導(dǎo)臨床選擇腫瘤治療方案有重大意義。目前臨床上介入手術(shù)相當(dāng)成熟，且主要集中于栓塞治療，但目前我國仍然沒有TARE相關(guān)藥物，缺乏TARE臨床經(jīng)驗，因此對于VX2兔肝癌原位模型進行TARE的方法建立尤為重要，能夠為臨床治療提供重要參考價值[7]。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔8只，雌雄各半；5～6月齡，北京市昌揚西山養(yǎng)殖場 SCXK(京)2016-0007；兔VX2肝癌瘤塊來源于東南大學(xué)；實驗動物飼養(yǎng)于中國輻射防護研究院放射性實驗動物設(shè)施普通環(huán)境，單籠飼養(yǎng)SYXK(晉)2019-0002，輻射安全許可證號：國環(huán)輻證(00346)。

1.2 主要儀器和試劑

鹽酸利多卡因注射液，山東華魯制藥有限公司；眼科剪，揚州市華宏醫(yī)療器械有限公司；GE Light Speed 64層螺旋CT掃描儀，美國 GE公司；碘帕醇注射液，上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司；肝素鈉注射液，天津生物化學(xué)制藥有限公司；DSA，美國 GE公司。放射性90Y微球，按照全肝吸收劑量100 Gy進行給藥，90Y為理想的治療用放射性核素，半衰期為64 h，釋放純β輻射(2.288 MeV)。目前上市的90Y 微球主要有90Y-玻璃微球和90Y-樹脂微球，臨床用于治療晚期肝癌，給藥途徑為肝動脈介入給藥[8]。

2 實驗方法

2.1 兔VX2肝癌模型建立

將瘤塊于37 ℃下解凍，先將瘤塊上的壞死組織和肌肉組織去除，然后將瘤塊上的魚肉樣組織剪碎成大小約為1～2 mm3小塊，將其浸泡在無菌鹽水中，用注射器抽取瘤塊。

采用開腹直視下瘤組織塊穿刺注入法接種。實驗兔接種前12小時禁食但不禁水，術(shù)前給予兔戊巴比妥鈉麻醉，在以標(biāo)準(zhǔn)外科方式準(zhǔn)備和覆蓋腹部后，用小刀片做垂直方向的劍突下小切口，并使用鈍性剝離通過無血管白線暴露腹膜，仔細劃分腹膜可以看到肝臟，逐層入腹，暴露肝臟下緣。使用擴開器將切口擴開，動作溫和的將暴露肝臟內(nèi)側(cè)段和外側(cè)段拉出體外，注意避免肝包膜撕裂，暴露的器官應(yīng)用濕紗布保持濕潤。將含有瘤塊的注射器換用18G穿刺針斜穿刺入肝左葉，注射瘤塊混合液0.1 mL，隨后迅速拔出穿刺針，穿刺點滲出的少量血用無菌棉簽壓迫止血。將肝臟左頁放回體內(nèi)后，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚。縫合后在皮膚創(chuàng)口處涂撒少量注射青霉素粉針劑。術(shù)后連續(xù)4天在實驗兔大腿外側(cè)肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手術(shù)創(chuàng)口來預(yù)防感染。

2.2 CT腫瘤觀察

接種后14天，將動物麻醉后置于螺旋CT下進行胸腹部掃描。CT參數(shù)為管電壓 80 kV，管電流 60 mA。先平掃定位，后序貫動態(tài)三期增強掃描，采集時間分別為動脈期(15 s)、靜脈期(25 s)和延遲期(45 s)。

2.3 VX2兔肝癌原位模型介入給予放射性微球

隨機選取4只動物開展介入給予放射性微球試驗。將模型兔麻醉后，平躺體位將四肢拉直，將動物固定于手術(shù)臺，先用手觸摸找出股動脈位置，再用手術(shù)刀逐層切開皮膚，分離出股動脈；用穿刺針穿刺股動脈，并置入5F動脈鞘后立即插入2.7F微導(dǎo)管避免動物失血，用手術(shù)縫合線將血管鞘與股動脈結(jié)扎固定。操作導(dǎo)絲末端手柄將導(dǎo)管導(dǎo)絲送至肝總動脈。于DSA儀器下進行碘帕醇注射液造影，確認(rèn)微導(dǎo)管位置是否在肝總動脈，并確認(rèn)附近血管走形找出肝固有動脈的位置；之后繼續(xù)操作微導(dǎo)絲上行至肝固有動脈，進行碘帕醇注射液造影，確認(rèn)肝臟輪廓和腫瘤輪廓。

上述操作確認(rèn)微導(dǎo)管行至肝固有動脈后，將導(dǎo)管位置固定，使用三通連接器連接裝有放射性微球的注射器、裝有生理鹽水的注射器和微導(dǎo)管，緩慢推注給藥。裝有放射性微球的注射器裝入注射器鉛防護套。給藥后用三通連接器連接的生理鹽水沖洗微導(dǎo)管。給藥后再次使用碘帕醇注射液造影，觀察肝臟和腫瘤血管栓塞情況。上述操作結(jié)束后拔出微導(dǎo)管和血管鞘，將股動脈穿刺位置前后1 cm處結(jié)扎，結(jié)扎股動脈穿刺位置，逐層縫合肌肉、皮膚?？p合后在皮膚創(chuàng)口處涂撒少量注射青霉素粉針劑。術(shù)后連續(xù)4天在實驗兔大腿外側(cè)肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手術(shù)創(chuàng)口來預(yù)防感染。

3 結(jié)果

3.1 VX2兔肝癌原位模型構(gòu)建及生長情況

動物接種試驗后，有3只動物出現(xiàn)傷口發(fā)炎情況，14天后CT檢查時可見所有動物肝臟部位均有低密度結(jié)節(jié)，判斷為腫瘤，腫瘤平均直徑為1.2 cm。CT結(jié)果表明，VX2兔肝癌原位模型構(gòu)建成功，且成功率達100%。

未進行介入給予放射性微球的4只荷瘤兔于瘤塊種植后30天解剖檢查，可見肝臟腫瘤接種部位有直徑較大的實質(zhì)腫物，同葉肝臟有多處轉(zhuǎn)移灶，在肝臟網(wǎng)膜、腹壁開腹部位、肺臟可見多處轉(zhuǎn)移病灶。結(jié)果表明，本實驗所用方法構(gòu)建的VX2兔肝癌原位模型成功，且成功率達100%，未見動物因感染和手術(shù)因素死亡。

3.2 VX2兔肝癌原位模型介入給予放射性微球

VX2兔肝癌原位模型腫瘤為富血管瘤，經(jīng)DSA下造影檢查，可見肝臟部位清晰的腫瘤輪廓為球狀，且其中血管極其豐富。在肝總動脈入口進行碘帕醇造影，可見在腹腔干動脈上的主要血管走形，在分支中較細的一支行向左下為脾動脈，胃左和肝總動脈共行一段，之后胃左動脈行于胃小彎，肝總動脈向右上走行；肝總動脈之后分出胃十二指腸動脈和肝固有動脈，微導(dǎo)管行至此肝固有動脈(即供養(yǎng)肝臟腫瘤的血管)，再次使用碘帕醇造影檢查，可見血管顯象出肝臟輪廓，且腫瘤清晰可見，將導(dǎo)管位置固定后使用三通連接器連接裝有放射性藥物的注射器、裝有生理鹽水的注射器和微導(dǎo)管，緩慢推注給藥。給藥后再次造影，可以看到之前清晰的腫瘤輪廓變成只有外周一圈的輪廓，內(nèi)部不可見豐富的血管，表明藥物進入腫瘤組織，且將腫瘤內(nèi)部血管栓塞，表明給藥成功。

將試驗動物于給藥后16天解剖檢查，可見動物肝臟腫瘤接種位置有直徑較大實質(zhì)腫物，但同葉肝臟、肺臟均無轉(zhuǎn)移灶，在肝臟網(wǎng)膜可見少許轉(zhuǎn)移病灶。

4 放射微球介入試驗操作中的輻射防護策略

因為藥物具有放射性且DSA機器亦通過釋放X射線進行顯像，因此在整個給藥過程中操作人員的受照劑量會很高，在相關(guān)操作中應(yīng)注意人員防護，采取屏蔽防護、時間防護、距離防護相結(jié)合的方式，最大可能保護操作人員。

屏蔽防護：在DSA機器球管與介入手術(shù)操作人員之間增加10 mm的鉛防護，在動物固定臺于動物下腹部部位增加3 mm的鉛防護，人員穿戴鉛防護服(0.5 mm Pb)，穿戴鉛防護手套(0.02 mm Pb)，佩戴鉛眼鏡(0.5 mm Pb)。

時間防護：熱藥試驗前先進行冷藥的模擬試驗，使各崗位人員能熟練操作縮短操作時間，熱藥試驗時將各個環(huán)節(jié)分解為流水線操作，保證人員接觸放射性藥物時間最短化，在介入手術(shù)和給藥環(huán)節(jié)進行人員輪崗工作，每人一只。

距離防護：人員在給藥后進行縫合、清創(chuàng)、觀察、清潔等操作時進行鉛簾(0.5 mm Pb)屏蔽，并保持一定距離，飼養(yǎng)期間動物個體之間保持大于2 m的距離。上述試驗的注意事項以及相關(guān)防護措施能夠為我國非臨床TARE的相關(guān)藥效學(xué)和毒理學(xué)試驗操作提供一些經(jīng)驗和建議。

5 討論

為了確保VX2兔肝癌原位模型成功建立，需要注意以下幾點：(1)選取靠近腫瘤邊緣生長旺盛的質(zhì)嫩灰白色魚肉樣組織進行移植，能夠相應(yīng)的提高腫瘤細胞的成活率；(2)建模前對動物進行禁食，可以減小實驗動物的腸道返流，避免不必要的不良反應(yīng)；(3)于肝左葉進行腫瘤組織植入，肝左葉血液豐富體積較大，有利于腫瘤組織生長。

肝動脈介入試驗操作中需要注意：(1)為減小試驗人員受照劑量，采取雙人配合操作，需先進行模擬訓(xùn)練，提高配合默契度，提高操作成功率；(2)造影找到肝固有動脈后，盡量繼續(xù)上行導(dǎo)絲導(dǎo)管至肝左動脈，使藥物能夠更好的富集于肝左葉腫瘤部位，但是在繼續(xù)上行過程中需要極其緩慢小心，肝左動脈很細小稍有不慎就會引起血管破裂。

放射微球藥物給藥時注意：采用三通連接器，盡量減少不必要的污染，在微球給藥時應(yīng)將微導(dǎo)固定，避免位移，之后需要將抽好藥量的注射器進行稀釋，避免濃度較大的微球堵塞微導(dǎo)管，在給藥后用適量生理鹽水沖洗導(dǎo)管，將微導(dǎo)管內(nèi)的殘留要物沖洗到肝臟；

放射性藥物介入操作和放射性微球給藥操作中的輻射防護策略，可以用于其他放射性藥物的非臨床研究中。