李波 嚴(yán)莉洪 施碧紅

摘 要：真菌的核型分析是指對(duì)真菌細(xì)胞染色體的形態(tài)特征及表征進(jìn)行分析，包括染色體的數(shù)目、長度、著絲粒位置等內(nèi)容的研究，可以為真菌分類、遺傳進(jìn)化及染色體變異等提供重要依據(jù)。介紹了真菌核型分析的常用方法及其原理、樣品制備等，比較了各方法的優(yōu)劣，為真菌染色體核型研究的方法選擇與改進(jìn)提供參考。

關(guān)鍵詞：真菌;核型分析;染色體;展望

中圖分類號(hào)：Q 933 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）01-0068-06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.01.012

Abstract：The karyotype analysis of fungi refers to the analysis of the morphological characteristics and characterization of the chromosomes of fungal cells， including the study of the number and length of chromosomes and the position of centromeres， etc.， which can provide an important basis for the classification， genetic evolution and chromosome variation of fungi. The common methods of fungal karyotype analysis， its principle and sample preparation were introduced in this paper， and the advantages and disadvantages of each method were compared， so as to provide reference for the selection and improvement of methods for the study of fungal karyotype.

Key words：Fungi; Karyotype analysis; Chromosome; Prospect

真菌種類繁多，數(shù)量可達(dá)數(shù)萬種，在人類活動(dòng)中發(fā)揮著各種各樣的作用。有益的作用包括曲霉、青霉等屬的真菌能夠產(chǎn)生廣泛的次生代謝物，是各種藥物（如青霉素、洛伐他汀、生物堿等），以及有機(jī)酸、工業(yè)酶的重要生產(chǎn)者;還有些真菌被直接用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)，如米曲霉和黑曲霉等長期用于清酒、醬油和普洱茶等的生產(chǎn)，是人類重要的經(jīng)濟(jì)物種[1]。有害的影響是有些真菌產(chǎn)生的毒素可直接對(duì)動(dòng)植物帶來危害，如黃曲霉毒素會(huì)引起人及動(dòng)物肝臟的病變;由真菌引起的植物真菌病害占了植物病害的70%～80%，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失等[1]。

真菌核型分析是指對(duì)真菌細(xì)胞染色體的表型特征及表征進(jìn)行分析，包括染色體的形態(tài)、數(shù)目、大小、帶型等內(nèi)容的研究。據(jù)報(bào)道的真菌核型分析顯示，在不少真菌物種中，存在染色體大小或數(shù)量的變異[2]，而且這種變異往往伴有表型差異，包括形態(tài)[3]、抗生素生產(chǎn)[4]或宿主范圍[5]。對(duì)于無性植物病原真菌，染色體大小和數(shù)量的變異則導(dǎo)致有毒菌株或致病菌株的出現(xiàn)[2]。核型分析作為真菌分類及遺傳研究的重要手段，它為真菌的進(jìn)化與分類、染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與變異以及基因定位等提供了重要的研究基礎(chǔ)和理論。開展真菌核型分析也是解析各類真菌對(duì)人類積極或消極影響的遺傳機(jī)制的重要途徑。

目前，真菌的核型分析方法主要分為細(xì)胞學(xué)方法和分子生物學(xué)方法兩類，細(xì)胞學(xué)方法主要有傳統(tǒng)顯微鏡法、掃描電鏡法、胚芽管爆裂法;分子生物學(xué)方法主要有脈沖電泳法和HiC法等。通過概述上述方法的原理、創(chuàng)建與發(fā)展過程、樣本制備等內(nèi)容，比較分析了其各自的長處與缺陷，以期為真菌核型分析研究的方法選擇與技術(shù)改進(jìn)提供參考。

1 真菌核型分析方法

1.1 細(xì)胞學(xué)方法

1.1.1 傳統(tǒng)顯微鏡法 真菌核型分析最關(guān)鍵的是確立真菌染色體的數(shù)目，染色體的數(shù)目是最準(zhǔn)確、最直接的倍性測(cè)定方法[6-7]。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡法是觀察真菌染色體最早的方法。一般來說，利用傳統(tǒng)顯微鏡法觀察處理真菌細(xì)胞樣本的主要步驟有：首先獲得有絲分裂中期的真菌細(xì)胞，再通過秋水仙素處理，其次用卡諾氏固定液（一般為3∶1）處理，最后使用Orcein染料染色觀察。

采用傳統(tǒng)顯微鏡觀察真菌染色體操作簡便，但要求真菌的染色體較大才能具有較好的效果。然而對(duì)大多數(shù)真菌來說，由于其染色體很小，即便細(xì)胞處于有絲分裂中期，染色體也是處于凝縮狀態(tài)，在這種情況下，對(duì)真菌進(jìn)行染色體形態(tài)分析以及計(jì)數(shù)就很困難。通常只能通過多次觀察收集大量的數(shù)據(jù)求平均值來減少染色體計(jì)數(shù)的誤差。但是這種誤差在一些具體的真菌菌株上仍然不可避免，如在Nectria haematococca[8]中，使用傳統(tǒng)顯微鏡法觀察的染色體數(shù)目遠(yuǎn)小于其他方法所獲得的染色體數(shù)目。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡對(duì)染色體可視化的效果比較差，極大地限制了其在真菌核型分析中的應(yīng)用。以目前的研究條件，使用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡觀察真菌染色體的具體特征如著絲粒、隨體等難度仍然較大，反之亦很難通過著絲點(diǎn)或者著絲粒等特征來識(shí)別染色體。但是通過一些真菌獨(dú)有的特性可以輔助觀察染色體。如Shirane等[9]利用染色體頂端的絲狀結(jié)構(gòu)來識(shí)別灰霉病菌Botrytis染色體。

然而通過獨(dú)有特征方式來觀察染色體不具有普適性。因此除了以上少數(shù)例子外，利用傳統(tǒng)顯微觀察法，大部分真菌染色體的區(qū)分都是基于染色體相對(duì)長度的比較和排序。如，在Tuber aestivum中，Poma等[10]利用碘化丙啶染色通過共聚焦顯微鏡觀察到5～6條染色體;在Erysiphe graminis中，Borbye等[6]則通過光學(xué)顯微鏡觀察到7～8條染色體。

1.1.2 掃描電子顯微鏡法 掃描電子顯微鏡在觀察真菌細(xì)胞樣本時(shí)，其工作原理是電子束逐點(diǎn)在真菌樣本表面掃描產(chǎn)生二次電子，采集二次電子信息以獲得真菌樣本的表面特征圖像。在利用掃描電鏡觀察真菌樣本前，首先真菌細(xì)胞需培養(yǎng)至有絲分裂中期時(shí)期，再用羥基脲或者噻苯咪唑處理培養(yǎng)以獲得其有絲分裂中期的細(xì)胞核;其次分別用2.5%戊二醛溶液和卡諾氏固定液（6∶1，具體視真菌菌種而定）處理真菌細(xì)胞，其中卡諾氏固定液一般處理30 min;最后DAPI染色。

掃描電子顯微鏡具有圖像分辨率高、有效放大倍數(shù)高以及景深長的優(yōu)點(diǎn)。但是，它要求樣本制備時(shí)選取有絲分裂中期的真菌細(xì)胞以方便觀察;真菌細(xì)胞樣本表面具有良好的導(dǎo)電性，并且樣本里不能有太多的水分。對(duì)于一些不能導(dǎo)電的樣品，一般需要噴金。這無疑增加了真菌細(xì)胞樣本制備的步驟和試驗(yàn)成本[11]。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡一樣，也需要多視野觀察，以此來確定染色體形態(tài)。掃描電鏡法很少單獨(dú)使用，常常是作為其他方法的補(bǔ)充，特別是在使用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡觀察真菌染色體形態(tài)不清晰時(shí)使用。一般來說，在對(duì)真菌細(xì)胞進(jìn)行核型分析時(shí)，不建議單獨(dú)使用掃描電鏡法，除非是實(shí)驗(yàn)室對(duì)真菌核型分析的研究方法已經(jīng)成熟建立。

1967年，Neurath等[12]利用掃描電鏡對(duì)人的染色體三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了廣泛的研究。2004年Tsuchiya等[13]首次將掃描電子顯微鏡應(yīng)用于真菌染色體的超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞核的可視化，利用掃描電鏡觀察到異旋孢腔菌Cochliobolus heterostrophus和粗糙脈孢霉Neurospora crassa有絲分裂中期染色體的三維圖像，觀察到高度濃縮且整體形狀似圓柱形的染色體，并且著絲粒明顯收縮。從掃描電鏡中獲得的三維信息可以揭示真菌細(xì)胞核分裂過程中染色質(zhì)緊實(shí)形成濃縮染色體的方式[14]。

1.1.3 胚芽管爆裂制片法 胚芽管爆裂制片法（Germ tube burst method，即GTBM法）是Shirane等[9]于1989年創(chuàng)立的一種使用光學(xué)顯微鏡觀察真菌染色體特有的方法。作者用甲醇、冰醋酸按照一定的比例混合處理分生孢子胚芽管或幼菌絲使其破裂，并進(jìn)一步通過低滲高溫處理使其排出染色體，在載玻片的表面擴(kuò)散，此時(shí)和吉姆薩染料結(jié)合，可以較為準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)真菌的染色體數(shù)目。

GTBM法依賴于顯微鏡觀察，但相對(duì)于傳統(tǒng)顯微鏡法處理真菌細(xì)胞樣本的方式較為新穎，一方面，對(duì)絲狀真菌特別是有絲分裂中期的真菌具有良好的通用性;另一方面，GTBM法可以對(duì)染色體數(shù)量進(jìn)行合理的估計(jì)，并給出染色體形態(tài)的信息[8]。但是，GTBM法無法精確測(cè)量真菌染色體大小。另外，GTBM法的效果依賴于能否準(zhǔn)確找到真菌有絲分裂時(shí)間以及染色劑的效果。后續(xù)學(xué)者們從不同種類的真菌樣品的處理方法以及固定液的配比等方面對(duì)GTBM法進(jìn)行了改進(jìn)[11，15]，也有用熒光染料（一般為DAPI染料）代替吉姆薩染料或者是利用兩種染料共同作用來觀察和確定真菌染色體條數(shù)。

Taga等利用改進(jìn)的GTBM法建立了真菌的有絲分裂細(xì)胞學(xué)模型[16]，該模型確立了3種刺盤孢霉（Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum graminicola和Colletotrichum higginsianum）的染色體形態(tài)以及染色體數(shù)量。目前使用GTBM法確定了真菌染色體數(shù)目的真菌主要有綠僵菌Metarhizium acridum菌株（10條）[15]、咖啡刺盤孢Colletotrichum kahawae菌株（11～14條，其中有多條小染色體）[17]、果生刺盤孢Colletotrichum fructicola菌株（>10條）等[11]。

1.2 分子生物學(xué)方法

1.2.1 脈沖電泳法 脈沖電泳是真菌核型分析的重要技術(shù)，其原理是將真菌的染色體DNA樣品放在變電場(chǎng)中改變樣本DNA的遷移方向，以分離不同大小的DNA分子，凝膠染色后觀察DNA條帶的位置和亮帶個(gè)數(shù)來推算真菌染色體的大小以及數(shù)目。1984年Chwartz等首次將脈沖電泳技術(shù)用于酵母染色體的分離[18]，1993年脈沖電泳技術(shù)被應(yīng)用于真菌核型分析[19]。在真菌中較常用的脈沖電泳系統(tǒng)是箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)脈沖電泳系統(tǒng)（即CHEF系統(tǒng)），運(yùn)用此法首先分離了啤酒酵母和栗酒裂殖酵母的染色體[20-21]，這2種酵母的染色體已經(jīng)被作為參照物來測(cè)量其他真菌的染色體大小以及衡量真菌染色體的數(shù)目。一般來說，采用箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)脈沖電泳（CHEF）時(shí)，要用低熔點(diǎn)瓊脂糖對(duì)經(jīng)酶解處理的真菌原生質(zhì)體制作包埋塊，此時(shí)要注意瓊脂糖的濃度[22]。設(shè)置CHEF電泳條件時(shí)，也需要根據(jù)真菌的種類特別是真菌的染色體DNA分子大小進(jìn)行調(diào)整。

脈沖電泳的分辨率主要取決于脈沖時(shí)間、電場(chǎng)強(qiáng)度等因素，其中最為關(guān)鍵的因素是脈沖電泳時(shí)間。若要分離長度較大的分子，可適當(dāng)增加脈沖電泳時(shí)間。反之可適當(dāng)減少脈沖時(shí)間?，F(xiàn)階段的脈沖電泳已經(jīng)克服了失真嚴(yán)重的缺陷且可以分辨長度超過6 Mb的片段。雖然利用脈沖電泳法有許多優(yōu)點(diǎn)，比如無須考慮所選的真菌細(xì)胞是否處于分裂中期，即可通過電泳圖來測(cè)算染色體的大小和數(shù)目，但是無法從肉眼上直觀地去觀察染色體，且脈沖電泳所能分離的條帶亦有一定的范圍（10 kb～10 Mb）[11，15]。此外，若真菌的多條染色體大小接近且都重疊在一起，脈沖電泳法亦無法分離之。

目前，脈沖電泳已廣泛應(yīng)用于真菌物種中染色體的計(jì)數(shù)和大小測(cè)算以及染色體的表征，如利用脈沖電泳測(cè)得Penicillium janthinellum[23]和Penicillium purpurogenum[24]的染色體數(shù)目分別為8條和5條，其大小則分別為2.0～8.0 Mb和2.3～7.1 Mb。經(jīng)CHEF系統(tǒng)分離出染色體核型的真菌有構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans[25]、里氏木霉Trichoderma reesei[26]、白假絲酵母Candida albicans[27]、粗糙脈孢霉Neurospora crassa[28]、稻瘟病菌Magnaporthe grisea[29]等模式真菌。這些模式真菌染色體核型的測(cè)定，為后續(xù)其他真菌的染色體核型的測(cè)定提供了參考。

1.2.2 HiC技術(shù)法 染色體構(gòu)象捕獲（chromosome conformation capture，3C）及其衍生技術(shù)（HiC等）的發(fā)展補(bǔ)充了顯微鏡研究染色體的方法，可以從細(xì)胞群中獲得關(guān)于染色體更高分辨率的數(shù)據(jù)[30]。尤其是HiC技術(shù)（High throughput 3C），作為高通量測(cè)序技術(shù)和染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)相結(jié)合而衍生的新技術(shù)，可以更清晰地觀察染色體的空間構(gòu)象，深刻地理解染色體結(jié)構(gòu)與功能、基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，許多處于重疊群水平的真菌基因組被公布。HiC技術(shù)可以將真菌零散基因組序列片段組裝到染色體水平，并且可以明確這些序列在染色體上的順序與方向。利用HiC技術(shù)分析真菌染色體的主要步驟有：首先使用固定劑（一般為甲醛）對(duì)真菌樣品進(jìn)行處理;其次，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行酶切處理;最后，利用親和素特異性結(jié)合生物素的原理，通過添加生物素標(biāo)記的核苷酸結(jié)合測(cè)序技術(shù)，預(yù)測(cè)真菌的染色體3D結(jié)構(gòu)[31]。利用高分辨率的HiC技術(shù)可以清晰地揭示真菌染色體層次分明的系列亞結(jié)構(gòu)，如在細(xì)胞核內(nèi)的線性一級(jí)結(jié)構(gòu)、染色體當(dāng)中的DNA的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）等結(jié)構(gòu)以及多染色體的3D結(jié)構(gòu)[31]。

HiC技術(shù)在研究真菌染色體方面遇到的難點(diǎn)在于基因位點(diǎn)間形成的接觸數(shù)據(jù)規(guī)模的增加和HiC數(shù)據(jù)的偏差[32]，以及缺乏精細(xì)的單倍體三維結(jié)構(gòu)的特征及功能分析[33]。影響HiC技術(shù)流程的因素主要有細(xì)胞總量、樣品降解、DNA總量、交聯(lián)作用和生物素化標(biāo)記[34-39]。另外，HiC技術(shù)的成本較高，也是阻礙其廣泛應(yīng)用于真菌染色體核型分析的原因之一。

2010年Tanizawa等[40]和Duan等[41]利用HiC技術(shù)成功構(gòu)建了芽殖酵母和裂殖酵母的染色體3D結(jié)構(gòu)。鄧優(yōu)錦等[42]則利用此技術(shù)將銀耳的基因組組裝至接近染色體水平。Hervé Marie-Nelly等[43]將全基因組染色體構(gòu)象捕獲及GRAAL算法應(yīng)用于里氏木霉Trichoderma reesei的裝配，獲得了與已知的該物種核型一致的疊群數(shù)。但是，以上方法對(duì)于其他物種的通用性仍然有待檢驗(yàn)。

2 真菌核型分析方法的比較

表1比較了上述幾種真菌核型分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)。研究者可根據(jù)具體的真菌物種以及實(shí)驗(yàn)室的自身?xiàng)l件選擇2～3種方法進(jìn)行分析。總的來說傳統(tǒng)顯微鏡結(jié)合胚芽管爆裂法以及脈沖電泳法是目前真菌核型分析較通用的方法;掃描電鏡法和HiC法成本較高，尤其是HiC法在真菌中的應(yīng)用仍在完善與發(fā)展中。

3 討論與展望

真菌核型分析的關(guān)鍵在于對(duì)真菌染色體的形態(tài)觀察以及數(shù)量確定。然而不同真菌的細(xì)胞生長繁殖方式差異大，許多真菌生活史中有性生殖和無性生殖并存。對(duì)這些真菌進(jìn)行核型分析時(shí)，不同的方法得出的結(jié)論常常不同。如在Nectria haematococca[8]中，利用傳統(tǒng)顯微鏡法、GTBM法以及脈沖電泳法對(duì)其進(jìn)行染色體數(shù)目確定時(shí)，不同方法得到的染色體數(shù)目存在明顯差異，這一方面由于真菌的染色體過小處于極限，而光學(xué)顯微鏡的分辨率不足以分辨其差異導(dǎo)致檢測(cè)損失;另一方面因?yàn)檎婢旧w的聚集、凝縮，使得對(duì)真菌染色體形態(tài)分析以及準(zhǔn)確計(jì)數(shù)誤差增加。

研究表明，使用單一的核型分析方法同時(shí)清晰地觀察真菌的染色體形態(tài)、準(zhǔn)確地確定染色體數(shù)量以及大小是非常困難的，聯(lián)合使用細(xì)胞學(xué)方法和分子生物學(xué)方法是優(yōu)選方案。Taga等[16]在3種刺盤孢霉（C.orbiculare、C.graminicola和C.higginsianum）聯(lián)合GTBM法和脈沖電泳法準(zhǔn)確地確定了其染色體數(shù)量和大小并且清晰觀察到了其有絲分裂間期、中期以及后期染色體的形態(tài)，使真菌染色體核型分析技術(shù)取得較大突破;Ayukawa等[44]亦聯(lián)合了GTBM法和脈沖電泳法在Fusarium oxysporum上觀察到了其有絲分裂間期和中期時(shí)的染色體形態(tài)并且確定了其染色體數(shù)目和大小。這種染色體核型分析方法的建立為其他真菌完整的染色體核型分析提供了參考。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)絲狀真菌灰黃青霉Penicillium griseovulfum的染色體核型分析中發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡法很難觀察到染色體形態(tài)，但結(jié)合GTBM法，初步觀察到了灰黃青霉的染色體形態(tài)和數(shù)目（數(shù)據(jù)未發(fā)表），后續(xù)將結(jié)合脈沖電泳法確認(rèn)觀察到的染色體數(shù)目的準(zhǔn)確性，并運(yùn)用Hi-C技術(shù)進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)室已完成的灰黃青霉基因組序列組裝到染色體水平。

與傳統(tǒng)單一的核型分析方法對(duì)絲狀真菌進(jìn)行染色體核型分析相比，聯(lián)合使用GTBM法和脈沖電泳法有著明顯的優(yōu)勢(shì)，如觀察效果好、成本低等。但是GTBM法和脈沖電泳法在實(shí)際操作中也存在各自的難點(diǎn)。GTBM法是一種可以較好地分散真菌染色體的技術(shù)，但是它需要有絲分裂中期且其細(xì)胞核剛好裂開的真菌細(xì)胞。在實(shí)際操作中，真菌細(xì)胞有絲分裂中期的時(shí)間較難確定，需要間隔不同培養(yǎng)時(shí)間取樣，并配合最適的固定液配比以及合適的染料等以準(zhǔn)確確定細(xì)胞有絲分裂各個(gè)時(shí)期。在脈沖電泳實(shí)際操作中，凝膠濃度、脈沖時(shí)間、電壓以及交換時(shí)間這些參數(shù)，需要根據(jù)具體的真菌染色體DNA分子大小，在充分的預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)置。

總之，真菌核型分析的關(guān)鍵在于對(duì)真菌的染色體的形態(tài)觀察以及數(shù)量和大小的確定，這也是衡量真菌核型分析方法優(yōu)劣與技術(shù)改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)。相比于動(dòng)植物核型分析研究，真菌核型分析的研究相對(duì)滯后，為獲得全面的真菌染色體形態(tài)圖以及染色體正確的數(shù)量和大小，仍需創(chuàng)建發(fā)展新的技術(shù)手段。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，目前多種真菌的全基因組序列已被測(cè)序。3C及其衍生技術(shù)Hi-C等技術(shù)的發(fā)展及其在真菌核型分析中的應(yīng)用，將為真菌的染色體核型分析提供精細(xì)的全方位解析圖。真菌核型分析方法的發(fā)展與完善將與真菌的外部形態(tài)鑒定、基因組序列測(cè)序等一起為真菌分類和遺傳學(xué)深層研究提供重要手段。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）