蘇曉梅，張丹參,2

（1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，河北 石家莊 050000；2.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050000）

腦卒中是引發(fā)死亡和身體殘疾的主要原因，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）約占腦卒中發(fā)病率的80%。IS的主要治療方法是通過溶栓或機械取栓實現快速再通。組織型纖溶酶原激活劑是1996年以來美國食品藥品監(jiān)督管理局唯一批準的治療急性IS的有效藥物，但由于治療窗狹窄，應用受限［1］，且即使在有效時間內再通后，梗死面積也常由于缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷而繼續(xù)增大［2］，開發(fā)新的治療方法勢在必行。

線粒體是細胞有氧呼吸的主要場所，是細胞內的能量工廠，可通過調節(jié)鈣信號、細胞代謝和細胞凋亡維持細胞穩(wěn)態(tài)。線粒體發(fā)生功能障礙后可參與腦缺血的發(fā)病機制，導致IS后神經元損傷和細胞死亡［3］，修復線粒體功能可阻斷上述損傷過程。研究表明，在IS后，星形膠質細胞（astrocyte，AST）可感知應激，并將線粒體作為“help-me”信號轉移到臨近的損傷神經元中［4］。然而，細胞間釋放和進入的潛在機制仍有待確定。將細胞間線粒體轉移到受損細胞是治療IS的新方法，可改善受損神經元的細胞生存狀態(tài)、神經突再生以及其他功能特性［5］。其中，介導細胞間線粒體轉移的方法包括形成細胞間隧道納米管（tunneling nanotubes，TNT）或細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）、縫隙連接蛋白43（connexin-43，Cx43）、細胞融合和線粒體擠壓等過程。本文綜述了線粒體功能障礙在IS病理過程中的作用、介導細胞間線粒體轉移的主要機制以及調控細胞間線粒體轉移的關鍵蛋白，為線粒體功能障礙相關疾病的治療提供新的潛在靶點和思路。

1 線粒體功能障礙在缺血性腦卒中發(fā)病中的作用

線粒體在細胞中發(fā)揮重要作用，包括產生ATP、維持氧化還原平衡和調節(jié)細胞凋亡等［6］。IS引起大腦氧和葡萄糖缺乏，觸發(fā)一系列破壞神經元的細胞和分子過程，其中斷會導致神經元線粒體穩(wěn)態(tài)受損［7］。腦缺血首先誘導基質Ca2+超載，氧化應激升高，隨后線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP）開放［8］；MPTP的開放使線粒體通透性增加，允許溶質如水、大分子和離子自由進入線粒體基質，引起線粒體腫脹，外膜破裂，電子傳遞鏈受損，釋放大量活性氧（reac?tive oxygen species，ROS）［9］；ROS的過量產生與神經元死亡密切相關，進而導致缺血后腦組織的功能和結構損傷［10］。此外，線粒體通透性升高也會促使膜電位降低，進一步加劇線粒體ATP水平降低和細胞內Ca2+濃度升高，加劇神經元損傷［11］。因此，改善線粒體功能可能是治療IS的有效策略。

2 細胞間線粒體轉移

線粒體是電子傳遞鏈消耗氧氣并產生ATP的能量核心，為細胞和組織提供生命活動所必需的能量。長期以來的觀點都認為線粒體終生保留在細胞內，是從母體遺傳的［12］。但在某些情況下，線粒體可釋放到細胞外，在細胞間進行轉移［13］。多種細胞具有供出或接收其他細胞（包括淋巴、神經元或心肌細胞等）線粒體的能力［14］。細胞器交換是一種特殊的細胞間通訊形式，它允許單向或雙向運輸小分子或離子及細胞內結構，包括線粒體、溶酶體、內體小泡和質膜組件等［15］。研究表明，線粒體從一個細胞轉移到另一細胞是一種保護機制，負責將受損細胞從線粒體功能障礙中拯救出來，以應對應激［16］。補充受體細胞中受損線粒體的方法很多，共孵育是最簡單的方法，不同細胞系的轉移效率不同；顯微注射和其他侵入性技術如納米刀也可向人體細胞注射線粒體并快速替換其內源性的固有線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），但其效率比共孵育方法低［17］。為促進線粒體內化進入受體細胞，其他技術也已開發(fā)出來，如將線粒體與細胞穿透肽Pep-1結合，用線粒體外膜轉位酶磁珠標記線粒體，以及通過MitoCeption技術增加線粒體攝取等［18-20］。

通過內源性或外源性線粒體轉移可維持受損細胞中的線粒體功能，這在帕金森病、脊髓損傷和腦卒中模型中得到證實，強調了線粒體轉移治療在中樞神經系統(tǒng)損傷后功能恢復中的有效性［21］。線粒體轉移提供了一種有利于腦卒中后神經元存活和再生的治療新模式。由于線粒體內化進入病變組織的有效性取決于線粒體細胞器的數量、質量及其合適的輸運方式，因此線粒體治療的療效在患者之間可能存在差異。如將線粒體轉移應用于臨床，需要更好地了解線粒體傳遞和細胞攝取的機制。

在神經元中，線粒體集中于突觸前神經末梢，轉運到胞體距離較遠，因而缺血后胞體自身的線粒體不能迅速得到補充。可見，神經元正常功能的發(fā)揮對線粒體尤為依賴，細胞外線粒體轉移為保護神經元開辟了一條新途徑。神經元中存在一系列與線粒體相關的調控信號，在它們的調控下，線粒體通過適時適度的動力學變化以響應神經元在不同時期和不同區(qū)域的能量需求，影響神經元的存活［22］。Huang等［23］通過原位注射或系統(tǒng)給藥轉移外源性線粒體，用溴尿苷（BrdU）預先標記線粒體追蹤其分布，發(fā)現其被神經元、AST和小膠質細胞攝取，如阻斷供體線粒體的電子傳遞，其對神經元的保護作用明顯減弱。在體實驗中，原位注射線粒體可減輕大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery oc?clusion，MCAO）模型中大鼠的腦梗死體積，并改善其運動功能。此外，若通過側腦室注射肌肉來源的自體線粒體，可減弱細胞氧化應激和凋亡，減輕反應性AST增生，促進神經發(fā)生，逆轉IS后的神經功能損傷［24］，表明外源性線粒體轉移是保護損傷神經元的有效措施。

2.1 AST線粒體轉移治療缺血性腦卒中損傷的神經元

在中樞神經系統(tǒng)中，AST與神經元之間存在廣泛而復雜的信息傳遞，以直接、相互作用的方式與神經元發(fā)生聯(lián)系，在神經系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、調控信息處理與信號傳遞、離子平衡、調節(jié)神經和突觸的可塑性等方面均發(fā)揮重要作用［25］。Hayakawa等［4］報道，AST可直接為神經元提供功能性線粒體，將神經元從缺血性損傷中拯救出來，表明線粒體的動態(tài)轉移過程并不局限于細胞內，而是包含了細胞間相互作用，該作用體現在以下2方面：①在細胞水平上的氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型中，用熒光染料MitoTracker Red CMXRos熒光標記AST培養(yǎng)液（astrocyte-conditioned medium，ACM）中的線粒體，再將ACM與損傷后的神經元共孵育后，即可在神經元內檢測到AST線粒體，表明AST可將健康線粒體轉移給鄰近神經元，使損傷后的神經元ATP水平得以恢復，細胞存活率及細胞可塑性增強；但若從ACM中去除細胞外線粒體，則該神經保護作用消失。②在MCAO動物模型造模3 d后，在梗死區(qū)周圍皮質直接注射來源于AST的線粒體，可在神經元中發(fā)現該線粒體，并可通過增加磷酸化蛋白激酶B和Bcl-xL的水平而增加神經元的存活率。上述結果表明，AST可以通過轉移正常線粒體來拯救腦卒中后受損的神經元。此外，神經元還可釋放受損線粒體并將其轉移至AST，進行處置和再循環(huán)［26］。

2.2 干細胞作為線粒體供體治療缺血性腦卒中

線粒體從AST向損傷神經元的內源性轉移是短暫的，不足以產生強而穩(wěn)定的神經保護作用，如無外源性治療干預，AST的線粒體轉移不能終止腦卒中引發(fā)的繼發(fā)性細胞死亡。因此，利用干細胞治療線粒體功能障礙相關疾病，在腦卒中研究領域引起了極大的興趣，以干細胞為基礎的線粒體轉移是提供正常線粒體的有效方法［27］。多項研究將干細胞作為線粒體供體，將線粒體從人干細胞轉移到線粒體受損的細胞，可恢復無功能線粒體的哺乳動物細胞的有氧呼吸［28］。在MCAO模型大鼠中，給予間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），使線粒體從MSC轉移至損傷神經元，減少腦梗體積，改善神經學指標［31］。此外，在魚藤酮誘導的體外帕金森病模型中，多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）衍生的AST可自發(fā)將功能性線粒體釋放到培養(yǎng)基中，顯著逆轉魚藤酮誘導多巴胺能神經元退行性病變和軸突縮短，表明iPSC衍生的AST可作為損傷多巴胺能神經元的線粒體供體，減弱其病理反應，挽救多巴胺能神經元變性［32］。因此，可利用干細胞作為線粒體供體進行線粒體轉移，以治療腦卒中或其他線粒體功能障礙疾病。

3 介導細胞間線粒體轉移的主要機制

多種信號分子可參與細胞間線粒體轉移，影響細胞間線粒體轉移的機制包括形成TNT、EV、Cx43、細胞融合以及線粒體擠壓等過程。TNT和Cx43通過膜管結構維持2個連接細胞之間進行通信，而EV則允許2個分離細胞之間進行信息傳遞，確保長距離通訊［33］。事實上，細胞間線粒體轉移提供了一種細胞間信號傳遞的新模式，它可在體內發(fā)生，并在各種病理條件下發(fā)揮作用，恢復受損細胞功能［34］。因此，靶向線粒體轉移有望成為治療線粒體功能障礙疾病的新方法。

3.1 隧道納米管

在體外和體內實驗中，不同類型細胞間都會形成TNT，其可促進細胞器、膜囊泡、小分子可溶性細胞質和膜分子的選擇性交換。建立納米管首先要形成一個類似于偽足狀的膜突起，在到達受體細胞后收縮，留一個與底物分離的超細結構，TNT對于有效的線粒體轉移至關重要，若用化學抑制劑或機械應激抑制TNT的形成則可減少線粒體交換［35］。線粒體通過TNT的轉移通常是單向的，從啟動TNT形成的細胞到受體細胞［36］。然而，也有少數雙向轉移的報道［37］。

線粒體損傷是基于TNT線粒體轉移的主要觸發(fā)因素。線粒體功能完全缺失后（包括mtDNA損耗或加入線粒體抑制劑），激活線粒體轉移。在I/R損傷中，MSC通過TNT樣結構將線粒體轉移至損傷內皮細胞，并通過搶救有氧呼吸抑制內皮細胞凋亡［38］；同樣，MSC可通過TNT結構將線粒體轉移至I/R損傷后的心肌細胞，改善細胞存活率［39］。而在大腸桿菌性肺炎模型中，線粒體通過TNT在MSC和先天免疫細胞之間進行轉移，可增強肺泡巨噬細胞吞噬入侵細菌的能力［40］。其他有利于TNT形成的條件是血清饑餓或過氧化氫誘導及刺激海馬AST和神經元中P53和納米管的形成［41］。同樣，高血糖或酸化的培養(yǎng)基以及刺激上皮細胞間充質轉化的細胞因子，會通過TNT的形成增加線粒體轉移［42］。

3.2 細胞外囊泡

幾乎每種細胞均可在細胞外培養(yǎng)基中分泌不同類型的囊泡，大小在40～1000 nm之間，稱為EV。EV是由細胞脫落的含有膜的囊泡，包含蛋白質、脂類和核苷酸，在細胞間通訊中發(fā)揮重要作用。根據起源、大小和分子組成，EV可分為微泡、外泌體和凋亡小體。EV是細胞間通訊的工具，存在于許多生理和病理過程，可作為健康和疾病的生物標志物［43］。不同EV中裝載的線粒體蛋白和mtDNA雖尚不清楚，但已在其中檢測到線粒體成分。較大的EV可包含完整的線粒體顆粒和mtDNA，這在MSC中可見，并參與其細胞間線粒體轉移。研究發(fā)現，MSC可脫落EV，包括外泌體（直徑50～100 nm）和微囊泡（直徑0.1～1 mm），進入細胞外空間，進行線粒體吞噬和運送微RNA（microRNA，miRNA）［44］。此外，在AST中也出現EV，從AST釋放的EV含有線粒體，可在OGD或IS時轉運至損傷神經元，發(fā)揮神經保護作用［4］。迄今，游離mtDNA跨線粒體內膜和外膜的細胞間轉移機制仍不清楚，而在細胞間線粒體轉移過程中，最可能通過EV介導整個線粒體顆粒進行轉移，恢復線粒體功能。

3.3 細胞融合

細胞融合是2個獨立細胞通過融合細胞膜共享細胞器和胞質化合物的過程。永久性細胞融合使得細胞共享細胞質并具有獨特核型，而部分細胞融合則允許短暫而直接的細胞間通訊，并交換多種蛋白質復合物和細胞器（包括線粒體）。據報道，成熟干細胞和胚胎干細胞可與心肌細胞、肝細胞和神經元融合，有助于細胞的分化和可塑性維持［45］。損傷和炎癥可促進靶器官的細胞融合，髓細胞和淋巴細胞在損傷或炎癥反應時可與不同組織融合［46］；采用干細胞治療心肌梗死時，干細胞與心肌細胞之間可發(fā)生部分或整體的細胞融合，恢復線粒體功能并促進心肌細胞再生［47］。Acquistapace等［48］將人脂肪干細胞與小鼠心肌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現細胞間形成F肌動蛋白連接，表明線粒體可通過部分細胞融合參與細胞功能恢復過程［49］。將MSC與線粒體疾病患者的皮膚成纖維細胞共培養(yǎng)，觀察到皮膚成纖維細胞異常的線粒體形態(tài)從裂變狀態(tài)被拯救到融合狀態(tài)，線粒體功能恢復［50］。

3.4 縫隙連接蛋白43

連接蛋白在低聚化后形成縫隙連接，允許細胞連接和轉移小分子細胞成分，其中Cx43在調節(jié)細胞間線粒體轉移過程中發(fā)揮重要作用，其以Ca2+依賴的方式，通過形成TNT和EV調控細胞間線粒體從MSC轉移到脂多糖損傷的肺泡上皮細胞，恢復肺泡生物能，從而保護急性肺損傷［51］。此外，縫隙連接可介導線粒體微粒與質膜連接，形成通道，小分子物質可通過由Cx43組成的連接蛋白半通道，擴散進入受損的神經元［52］。

3.5 線粒體擠壓

線粒體擠壓是線粒體轉移的另一種機制，在特定條件下細胞中可釋放線粒體或線粒體成分。如在ROS大量產生的情況下，HeLa細胞可擠壓釋放出線粒體碎片［53］。線粒體擠壓不僅在體外發(fā)生，在體內也可發(fā)生，如血小板擠壓包裹于微粒和游離細胞器中的功能性線粒體，以此增強炎癥反應［54］。此外，用抗FAST抗體處理小鼠肝細胞，在竇周間隙和血清中檢測到線粒體，表明發(fā)生線粒體擠壓［55］。

4 調控細胞間線粒體轉移的潛在靶蛋白

細胞應激是誘導細胞器轉移的必要條件，因為當線粒體功能相對完善時，線粒體轉移很少發(fā)生，而在線粒體功能幾乎完全缺失（如mtDNA缺失或使用線粒體抑制劑處理的情況下）才會觸發(fā)線粒體轉移［56-57］。線粒體轉移是受損細胞應激的后續(xù)反應，旨在推動體內組織修復，改善細胞功能［58］。此外，啟動細胞間功能線粒體轉移與細胞損傷程度有關，細胞內具有觸發(fā)線粒體轉移的機制，以響應來自受體細胞的損傷信號，明確調控線粒體轉移的潛在靶點將有助于闡明線粒體轉移機制，用于線粒體恢復治療。

4.1 線粒體損傷相關分子（damage?associated molecules，DAM）

理論上，細胞接收到來自受體細胞的環(huán)境信號，可導致受體細胞中功能障礙線粒體的氧化應激，觸發(fā)線粒體轉移。在細胞應激時，細胞內釋放DAM（包括受損的線粒體、mtDNA和受損細胞釋放的線粒體產物）到細胞外作為機體的應激信號［59-60］。Mahrouf-Yorgov等［61］發(fā)現，細胞在應激時發(fā)生線粒體功能障礙，并釋放mtDNA；當MSC與受到過氧化氫刺激的心肌細胞或內皮細胞共培養(yǎng)時，MSC吞噬并降解mtDNA，刺激線粒體產生能量，促進MSC的線粒體轉移。此外，細胞在氧化應激和炎癥狀態(tài)下也會釋放ROS，觸發(fā)線粒體轉移，促進受損細胞和MSC之間的交互作用；ROS清除劑則可阻斷損傷細胞釋放mtDNA。

4.2 線粒體Rho GTP酶1（mitochondrial Rho GTPase1，Miro1）

Miro1是線粒體外膜上與微管中線粒體運動相關的鈣敏感銜接蛋白，與驅動蛋白/動力蛋白適配器蛋白結合，促進線粒體通過TNT在2個細胞之間進行遷移。此外，通過調節(jié)細胞骨架運動蛋白可控制線粒體的運動速度，在TNT依賴性細胞間線粒體轉移中發(fā)揮重要作用［62］。研究表明，Miro1可參與TNT介導的線粒體轉移［63］，促進AST的線粒體轉移到神經元中［64］。在MSC和肺泡上皮細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，Miro1的過表達可促進線粒體從MSC轉移到上皮細胞，增強了MSC對上皮細胞的修復能力。此外，ROS的產生可通過Miro1影響線粒體運動［65］。過表達的Miro1也可相應提高與ROS水平升高相關的缺血損傷后的神經恢復作用［66］。在人急性髓系白血病中，ROS驅動TNT形成，并通過NADPH氧化酶-2調控線粒體從骨髓基質細胞轉移到白血病母細胞中［67］；在蒽環(huán)類藥物誘導的心肌病過程中，iPSC中Miro1的表達高于MSC，使得線粒體轉移更高效。相反，用RNA干擾技術敲除Miro1，則線粒體的轉移效率降低。上述研究提示，Miro1在線粒體轉移過程中發(fā)揮重要作用。

4.3 CD38

除來自受損細胞的信號外，細胞的內在信號也有助于線粒體轉移。據報道，CD38可催化線粒體膜中環(huán)狀ADP核糖（cyclic ADP ribose，cADPR）的合成，從而調動Ca2+來觸發(fā)多種細胞反應［68］，如在AST中，CD38催化NAD+轉化為cADPR，隨后CD38將其泵入細胞質基質，產生細胞內游離Ca2+。當皮質或海馬AST與神經元共培養(yǎng)時，無論是在質膜上還是在細胞內，AST細胞中的CD38均顯著過表達。經研究證實，神經元釋放的谷氨酸可誘導AST中CD38過表達，進一步增加了AST和神經元之間雙向通訊的復雜性［69］。研究表明，CD38-cADPR信號可介導線粒體在不同細胞間轉移，如線粒體從骨髓基質細胞轉移到多發(fā)性骨髓瘤細胞［70］以及調控AST與神經元之間的雙向線粒體轉移［71］。IS后，線粒體從AST向神經細胞的轉移就是由CD38-cADPRCa2+信號通路介導的，通過CD38 siRNA抑制CD38信號可減少AST胞外線粒體轉移；若激活AST的CD38信號，則可促進線粒體從AST釋放［4］。此外，從正常人AST中分離出線粒體，立即與饑餓的人膠質瘤細胞（U87）共孵育，線粒體可從正常人AST轉移到U87細胞，該內吞作用是由NAD+-CD38-cADPRCa2+信號通路介導的，可挽救有氧呼吸，增強膠質瘤的體內外放射敏感性［72］。研究發(fā)現，CD38是通過內源性維A酸或外源性維A酸的代謝調節(jié)物調節(jié)的，AST中CD38的調控對圍產期低氧缺血性腦損傷具有神經保護作用［73］。此外，CD38可驅動AST線粒體轉移介導Sigma-1受體激活而發(fā)揮抗抑郁類作用［74］。上述結果表明，正常細胞可檢測到鄰近應激細胞一定程度的代謝紊亂，幫助恢復其功能，從而阻止細胞凋亡的啟動［75］。

4.4 腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）

應激細胞或瀕死細胞會釋放線粒體，作為危險警告信號。當受到TNF-α刺激時，小鼠胚胎成纖維細胞和肝細胞通過自身溶酶體外泌作用排出線粒體［55］。在人T淋巴母細胞白血病細胞和小鼠成纖維細胞中，TNF-α誘導壞死，并伴隨著線粒體的胞外釋放。這是一個激活過程，發(fā)生在細胞膜破裂之前，線粒體是完整的，并無mtDNA釋放［60］。早期研究表明，TNF-α誘導蛋白2可誘導TNT膜突起形成，上調TNF-α/NF-κB/TNF-α誘導蛋白2信號通路，進一步促進TNT的形成［76］。此外，TNF-α可通過上調谷氨酰胺酶的表達促進AST中EV的釋放，用TNF-α處理小鼠AST后，EV釋放增加并伴隨谷氨酰胺酶蛋白水平上調，且TNF-α介導的EV釋放增加可被谷氨酰胺酶抑制劑阻斷，表明谷氨酰胺酶是控制AST神經炎癥過程中EV釋放的重要調節(jié)因子［77］。

5 結語

線粒體功能障礙是IS病理過程中的早期事件，損傷后的線粒體通過增加ROS形成、鈣積累、誘導MPTP開放、控制炎癥和凋亡、激活NLRP3炎癥小體等方式參與細胞死亡過程［78］。近年來，線粒體轉移的研究為細胞間通訊開辟了一個全新的視角。研究發(fā)現，線粒體本身可作為“help-me”信號，響應多種細胞外刺激，并招募相鄰細胞的線粒體來拯救受損細胞，特別是在中樞神經系統(tǒng)中，線粒體集中于神經元的軸突末端和樹突狀突起。因此，轉移外源性的正常線粒體成為治療損傷神經元的有效方法，開啟逆轉人類疾病中線粒體功能的新時代。線粒體轉移雖已成功應用于心肌I/R損傷的兒科患者［79］，但在臨床上廣泛、安全地實施線粒體轉移仍面臨多種挑戰(zhàn)。首先，病理狀態(tài)下線粒體轉移在體內、體外都可發(fā)生，然而，線粒體是否可在生理條件下進行細胞間移動，以及這種轉移的確切作用仍然未知。其次，干細胞可能是重要的細胞器供體，因此，成體干細胞、間充質基質細胞、成纖維細胞和造血干細胞有望成為潛在的線粒體供體，未來針對干細胞動力學調控機制的研究是治療線粒體疾病的重點之一。此外，闡明線粒體轉移的生理意義需要開發(fā)新的熒光和基因線粒體跟蹤工具，然而利用熒光染料來追蹤線粒體轉移，會產生染料泄漏的可能，使得細胞間線粒體轉移可視化成為難點。最后，線粒體從供體細胞釋放和被受體細胞識別的機制尚不明確，闡明細胞間線粒體轉移機制可為線粒體功能障礙相關疾病的治療提供新的潛在靶點和思路。