秦平偉，張 艷，黃寶銀，劉雪松，馮萬宇，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

奶牛乳房炎是乳腺組織在感染致病性微生物，或受到物理、化學等因素的刺激后，乳房間質或實質組織發(fā)生的一種炎性變化。其特征是乳房腫脹，皮膚發(fā)紅，乳房發(fā)熱，疼痛，乳汁變性，患牛產(chǎn)奶量和乳汁品質下降，重癥乳房炎患牛可引起奶牛體溫升高，食欲減退或廢絕等全身癥狀，癥狀嚴重奶牛因產(chǎn)乳量明顯減少或失去泌乳能力而被淘汰，因此，該病具有重要的經(jīng)濟意義。

引起奶牛乳房炎的常見鏈球菌為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌，在這三種鏈球菌中無乳鏈球菌是最常見的病原菌。大量研究結果表明，奶牛無乳鏈球菌性乳房炎占奶牛乳房炎發(fā)病率的30%～70%。據(jù)作者統(tǒng)計2010年以后發(fā)表的相關文獻，在分離的奶牛乳房炎病原菌中，無乳鏈球菌約占分離病原菌的11.04%，乳房鏈球菌的占比率約為8.30%，停乳鏈球菌的占比率約為4.39%，由此可見，無乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎較常見的病原菌之一。

無乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎多呈隱型型，相對臨床型乳房炎而言，隱型乳房炎所造成的經(jīng)濟損失更大，約占乳房炎總損失的70%～80%,此外，無乳鏈球菌是一種人獸共患病的典型致病菌之一，該菌可通過乳腺和牛奶等途徑感染人類，因此，無乳鏈球菌乳房炎的所造成的危害不可低估，應充分引起人們重視。

1 病原及致病特性

無乳鏈球菌(S.agalactiae)屬于B族鏈球菌，革蘭氏染色為陽性，細菌圓形或卵圓形，直徑小于2.0 μm，呈鏈狀排列。依據(jù)無乳鏈球菌莢膜多糖的差異，該菌分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ共計10個血清型。有學者建立了更為快捷的鑒別方法，Imperi等針對莢膜多糖相關基因建立了多重PCR血清型分型鑒定方法，能夠快速精準鑒定無乳鏈球菌的血清類型，與傳統(tǒng)的血清學鑒定方法相較，兩種方法的復合率高達100%。

無乳鏈球菌具有溶血能力，目前，已發(fā)現(xiàn)的無乳鏈球菌主要致病因子包括：莢膜多糖、溶血素、透明質酸酶、環(huán)磷酸腺苷因子、超氧化物歧化酶、絲 。

無乳鏈球菌多引起奶牛乳房發(fā)生隱型性感染，疾病初期無乳鏈球菌主要感染乳區(qū)的底部。無乳鏈球菌感染后可在乳腺細胞中迅速生長繁殖，損傷乳腺上皮細胞、導管及乳腺組織，并導致的炎癥反應組織碎片和白細胞數(shù)量大量上升，影響乳區(qū)下部的導管系統(tǒng)，引起產(chǎn)奶量下降和乳汁品質降低。隨著病情的加重，組織碎片和白細胞可阻塞乳腺管，導致產(chǎn)奶量急劇降低，體細胞數(shù)增多。重者可導致乳腺導管堵塞，引起泌乳組織功能衰退，乳腺組織逐步萎縮，乳房喪失泌乳功能。

2 流行病學

無乳鏈球菌是高度傳染性細菌，且在牛群中傳播速度較快。無乳鏈球菌曾被認為是奶牛乳房內(nèi)專性寄生和嚴格傳染性病原菌，常存在于奶牛的皮膚、乳頭及乳房內(nèi)。后期研究證實，在奶牛體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中，如奶牛糞便、水槽、料槽、臥床、擠奶廳等均能分離出無乳鏈球菌，這說明無乳鏈球菌在牛場廣泛存在。無乳鏈球菌屬于接觸性感染菌，感染途徑主要發(fā)生在擠奶過程中，通過擠奶員、清洗奶牛乳房的毛巾、用水、擠奶設備等途徑發(fā)生感染。此外，通過污染的飼料、飲水等媒介也可感染。

雖然不同地域、不同牛場乳房炎病原菌的發(fā)生區(qū)系及發(fā)生率均有差異，但相似之處是無乳鏈球菌乳房炎的發(fā)生率均較高。張亞茹等采集甘肅某奶牛場臨床型乳腺炎奶樣，細菌分離結果顯示，在125份奶樣中共檢出細菌128株，病原菌區(qū)系分布主要為大腸桿菌32.03%、無乳鏈球菌19.53%、腸桿菌10.94%、停乳鏈球菌1.56%。在無乳鏈球菌中Ⅰa型菌株占72.0%，Ⅱ型菌株28.0%。張哲等采取我國30多個城市的120余個奶牛場的臨床型乳房炎乳樣3 134份，從中分離出致病菌12種共計2106株，統(tǒng)計結果表明，無乳鏈球菌的分離率最高，為38.61%。李新圃等在我國一些地區(qū)的奶牛場采取乳房炎乳樣，在采集的302份樣品中分離幾率最高的病原菌為無乳鏈球菌，其在病原菌的占比是27.6%。黃瑛等采集臨床型乳房炎乳樣105份，從中分離出病原菌76株，其中主要為無乳鏈球菌，占比高達76.32%。易明梅等采集上海地區(qū)的4個規(guī)?；膛鋈闃?26份，從乳樣中分離出病原菌3種共計107株，在這些病原菌中無乳鏈球菌占比為25.23%。2012～2013年李勝利等在采集的894份大罐奶樣中，無乳鏈球菌的檢出率最高，達到92.2%。上述結果表明，無乳鏈球菌在國內(nèi)奶牛場的流行廣泛，感染率較高。

在無乳鏈球菌流行血清型中，我國流行血清型主要為Ⅰa型和Ⅱ型。杜琳等在華北地區(qū)采集不同區(qū)域奶牛場的乳房炎乳樣，分離鑒定病原離，并對無乳鏈球菌進行定型，結果表明，無乳鏈球菌主要為Ⅰa型。劉龍海等采集我國部分地區(qū)奶牛場乳房炎乳樣，從中分離鑒定出無乳鏈球菌81株，經(jīng)多重PCR對血清型進行鑒定，其中，無乳鏈球菌Ⅰa型占比為50.62%，無乳鏈球菌Ⅱ型占比為48.15%。王丹等采集江蘇省部分牛場的乳房炎乳樣，進行細菌的分離鑒定，檢驗結果表明，無乳鏈球菌Ⅱ型是該地區(qū)奶牛場無乳鏈球菌流行株的優(yōu)勢血清型。

3 臨床癥狀與病理變化

3.1 臨床癥狀

無乳鏈球菌可引起奶牛發(fā)生急性、亞急性、慢性和隱型乳房炎。奶牛感染無乳鏈球菌通常引起多乳區(qū)感染，且引起周期性復發(fā)的臨床型乳房炎。

輕癥臨床型乳房炎感染奶牛臨床癥狀較為溫和，一般無全身癥狀，臨床表現(xiàn)為乳汁變稀，感染乳區(qū)產(chǎn)奶量降低，通常下降約40%。有的輕癥慢性感染奶牛乳區(qū)乳汁外觀輕度異常，產(chǎn)奶量持續(xù)低產(chǎn)，長期感染乳區(qū)外觀有些萎縮。

重癥乳房炎患牛出現(xiàn)全身性臨床癥狀。在感染的初期有些患牛表現(xiàn)間歇性發(fā)熱，外觀乳房腫脹，乳汁變的較稀薄，乳汁中出現(xiàn)塊狀、片狀的乳凝塊，乳汁呈淡紅色血乳，有的奶牛乳房有硬結。有的感染青年奶牛產(chǎn)頭胎犢時存在瞎乳區(qū)現(xiàn)象。急性發(fā)病奶牛乳房水腫嚴重，呈彌漫性水腫，乳汁變質，產(chǎn)奶量急劇下降甚至停產(chǎn)。

3.2 病理組織學變化

患病乳腺小葉增生，有的乳腺實質有直徑0.2～0.5 cm大小的黃色結節(jié)，并向管腔和乳池內(nèi)腔突出，其中散布著白色薄膜。乳腺出現(xiàn)散發(fā)性或中度炎性浸潤，由腺泡和導管內(nèi)的中性粒細胞，以及間質中的中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞組。

4 病原分離鑒定

乳樣采集：用清潔水洗凈患病奶牛乳房，用潔凈紙巾擦干，然后用75%酒精棉擦拭采樣乳頭，棄掉前3～4把乳，將乳汁樣品采集到采樣管中，蓋好采樣管蓋子，并注明奶牛號及乳區(qū)，盡快送實驗室檢驗。

細菌分離與鑒定：取采集的擬檢驗乳樣搖勻，接種含5%血液的瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，依據(jù)細菌實際生長情況可適當延長培養(yǎng)時間。在5%血液瓊脂平板培養(yǎng)24 h，無乳鏈球菌一般生長成灰白色、圓形、光滑凸起、邊緣整齊、濕潤、直徑為0.5～1.0 mm的小菌落，多呈β溶血。接種營養(yǎng)肉湯，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，初期肉湯外觀呈均勻性渾濁，培養(yǎng)后期肉湯變得較為清亮透明，管底出現(xiàn)絮狀、顆粒狀的沉淀，沉淀物易搖散。細菌革蘭氏染色為陽性，細菌呈紫色，鏈狀排列。

CAMP試驗：取血瓊脂平板，接種金黃色葡萄球菌，劃種一條直線，然后再接種分離菌株，與金黃色葡萄球菌劃線垂直接種，同樣劃種一條直線，但兩接種劃線不能相交，且兩者相距在0.5～1.0 cm之間，37 ℃孵育18～24 h。由于無乳鏈球菌可產(chǎn)生CAMP因子，該因子能激發(fā)金黃色葡萄球菌β溶血素的活性，因此，在血瓊脂平板兩種細菌的交界處因溶血力增強而形成箭頭狀的透明溶血區(qū)。

5 藥物治療

無乳鏈球菌對青霉素類抗生素較為敏感，臨床病例治愈率較高，可達70%以上。然而，隨著藥物長期大量不科學使用，無乳鏈球菌的耐藥性也日顯突出，并嚴重影響著臨床治療效果。由于一些無乳鏈球菌產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶或生物被膜，導致無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺酶類等藥物產(chǎn)生了耐藥性。

在牛源無乳鏈球菌耐藥性研究方面，張莉莉等檢測了82株奶牛乳房炎無乳鏈球菌的青霉素耐藥性，結果表明，在82株受試菌中對青霉素耐藥菌株占21.95%，說明奶牛乳房炎無乳鏈球菌對青霉素的耐藥率較高，試驗同時證明，無乳鏈球菌對青霉素的耐藥性受β-內(nèi)酰胺酶、細菌生物被膜等多因子的調控。張成虎等試驗表明，無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素和四環(huán)素的耐藥率較高，在分離的無乳鏈球菌中，對青霉素耐藥的63.64%，對四環(huán)素耐藥的占34.55%。易明梅等試驗證實，分離的無乳鏈球菌均對氨芐青霉素產(chǎn)生了耐藥性，對四環(huán)素和紅霉素也產(chǎn)生了部分耐藥性。上述學者研究證實，一些無乳鏈球菌菌株對四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生了抗藥性，因此，在治療無乳鏈球菌乳房炎時有條件牛場最好測定病原菌的藥敏性。

6 疫苗研發(fā)進展

由于引起奶牛乳房炎的無乳鏈球菌一般不產(chǎn)生明顯的免疫反應，所以至今仍無有效疫苗。然而，隨著科技進步，在奶牛乳房炎無乳鏈球菌疫苗研究方面一些學者取得了一定的進展。

在無乳鏈球菌結構蛋白中，菌體sip蛋白是位于菌體表面的一種保守性蛋白，該蛋白在各種血清型的無乳鏈球菌中均存在。目前，在無乳鏈球菌疫苗研究方面，菌體sip蛋白已成為重要的靶向免疫蛋白，同時，該蛋白還可作為檢測無乳鏈球菌的的候選蛋白。布日額等學者將無乳鏈球菌菌膜表面相關蛋白基因sip與磷酸甘油激酶基因pgk進行串聯(lián)表達，并獲得了融合蛋白，融合蛋白能被無乳鏈球菌抗體識別，試驗小鼠免疫接種sip蛋白后，能夠較好保護小鼠免受多種血清型的無乳鏈球菌的攻擊，該研究為奶牛無乳鏈球菌性亞單位疫苗的研究提供了技術支撐。 吳金花等利用奶牛乳房炎無乳鏈球菌的溶血素基因hly構建重組質粒，試驗表明，表達的產(chǎn)物具有良好的免疫原性。王雪吟等構建了牛乳腺炎無乳鏈球菌菌毛島嶼AP1-AP2-BP三聯(lián)基因，經(jīng)誘導表達后獲得的純化蛋白作為牛乳腺炎無乳鏈球菌菌毛島嶼PI-2a亞單位重組抗原免疫家兔，制備多亞單位免疫抗體，結果表明，AP1-AP2-BP多亞單位抗原有較好的免疫原性，該研究為制備相應多亞單位抗體的制備提供了良好的多價抗原，同時也為將研制新型工程疫苗及檢測試劑提供了科學研究基礎。蔣業(yè)慧等從某一奶牛場分離奶牛隱型乳房炎病原菌，從中篩選具有良好免疫原性的無乳鏈球菌制備滅活疫苗，免疫試驗表明，牛場隱性乳房炎的發(fā)生率降低了37%，疫苗免疫效果較為理想。

7 監(jiān)測與凈化

無乳鏈球菌感染的奶牛是牛場的重要傳染源，因此，應加強牛群的感染監(jiān)測，確保奶牛群的凈化。要加強奶牛的監(jiān)測與診斷，定期對全群奶牛進行抽樣培養(yǎng)，新購奶牛，以及新產(chǎn)奶牛應在產(chǎn)犢后第3～4次擠奶時進行取樣監(jiān)測，確診的陽性病例，應立即隔離并采取及時科學治療措施。

無乳鏈球菌是導致大罐奶體細胞數(shù)上升的主要病原，奶牛感染無乳鏈球菌后，大缸奶樣的體細胞數(shù)急劇升高，且大缸奶細菌總數(shù)顯著升高。如果大罐奶的體細胞數(shù)大于75萬個/mL，提示奶牛無乳鏈球菌感染率可能較高，需要對全群泌乳奶牛進行檢測與治療。大罐奶取樣做PCR檢測更利于掌握全群奶牛乳房健康狀況。據(jù)報道，牛群中如有一頭奶牛的一個乳區(qū)發(fā)生感染，就可能導致100頭奶牛所產(chǎn)奶的桶奶細菌數(shù)上升至10萬/mL。牛群感染牛的治療與清除是保障奶牛健康的中藥途徑之一。無乳鏈球菌患牛須選擇敏感的藥物進行治療，對于治療無效的奶牛應進行淘汰，從而有效控制制無乳鏈球菌感染。產(chǎn)3胎以上，乳汁體細胞數(shù)大于160萬/mL，并持續(xù)時間3個月以上，或患有慢性乳房炎，且對治療不敏感的牛應及時淘汰。