周羽西，謝奇君，沈嶸，凌秀鳳，趙純

隨著輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）的發(fā)展，盡管臨床選擇高質量的胚胎植入子宮以提高臨床妊娠率，但仍然有很多患者反復種植失敗（recurrent implantation failure，RIF），RIF至今還沒有一個普遍接受的定義，爭議主要在于移植胚胎周期數、移植胚胎質量和數量、移植胚胎周期類型及年齡[1]。一項薈萃分析提出，RIF應是在連續(xù)2個及以上周期的體外受精（in vitro fertilization，IVF）/胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）或凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）后沒有著床，其中累計移植的卵裂期胚胎數≥4個，囊胚胚胎數≥2個，且所有胚胎均為優(yōu)質胚胎[2]。

RIF的病因主要包括子宮內膜容受性降低、胚胎質量缺陷（如異常受精）、女性高齡、子宮異常、子宮內膜異位癥和輸卵管積水等，排除以上這些原因，仍無法成功妊娠，則稱為不明原因RIF。免疫因素可通過降低子宮內膜容受性而導致著床失敗，其可能是不明原因RIF的重要發(fā)病機制。RIF的免疫因素主要包括免疫耐受失衡和自身抗體的存在。妊娠是對母體免疫系統(tǒng)的一個重大挑戰(zhàn)，因為妊娠必須耐受父親同種抗原的持續(xù)存在，成功的妊娠依賴于母體免疫系統(tǒng)對胚胎產生免疫耐受，即母胎免疫耐受，許多不明原因RIF可能與母胎界面免疫耐受異常有關，這使得免疫耐受缺陷理論成為可能。近年來，越來越多的證據表明，生殖功能障礙可能與多種自身免疫性疾病有關，如抗磷脂綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。不論臨床是否存在自身免疫性疾病，血清自身抗體如抗磷脂抗體、抗甲狀腺抗體或抗核抗體可能與不孕癥直接相關。本文總結了與RIF相關的免疫因素，就RIF免疫學發(fā)病機制及治療的進展進行綜述。

1 免疫耐受失衡

1.1 自然殺傷（natural killer，NK）細胞固有免疫細胞特別是巨噬細胞（macrophages，MΦ）、樹突狀細胞（dendritic cells，DC）和子宮自然殺傷（uNK）細胞群，大量存在于著床時的黃體期蛻膜中，以NK細胞為主。據報道，在RIF婦女中黃體期外周血自然殺傷（pNK）細胞的百分比顯著增加[3]。早期胚胎植入部位底蛻膜的uNK細胞分泌大量因子，這些因子在早期蛻膜中介導血管生成以增強子宮動脈血流量，但異常增加的uNK細胞可能對子宮內膜容受性產生負面影響，引發(fā)過度氧化應激，從而導致胚胎植入失敗。但也有研究者認為外周血CD3-CD56+NK細胞水平與植入失敗或流產無關，不應作為RIF治療的推薦指標[4]。Chernyshov等[5]在取卵后立即取子宮內膜標本，子宮內膜活檢前25～30 min同時采集外周血，結果發(fā)現子宮內膜CD3-CD56+NK細胞水平高于外周血。因此，在RIF人群中檢測pNK和uNK細胞對妊娠結局的預測價值仍然不確定。

1.2 MΦ和DCMΦ和DC是最主要的抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）。子宮內膜APC最先與胎兒抗原接觸，在妊娠期母胎免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用。DC是免疫應答的重要啟動和調節(jié)者，其作為免疫系統(tǒng)中最強大的APC，不僅參與初始免疫應答的啟動，而且在誘導免疫耐受和調節(jié)T細胞介導的免疫應答中起重要作用。與外周血單核細胞相比，MФ具有抗原提呈、免疫抑制活性和產生白細胞介素1（interleukin 1，IL-1）的能力。MФ影響早孕子宮內膜細胞內膜生化事件，促進子宮容受性，促進胚胎附著和著床。M1型MФ促進早孕胚胎著床，并積極參與保護胎兒免受宮內感染、宮頸成熟和分娩，而M2型MФ為胎兒在整個妊娠過程中在子宮內分娩提供了一個免疫耐受環(huán)境[6]。

1.3 補體系統(tǒng)補體系統(tǒng)是先天免疫防御系統(tǒng)的一部分，以補體組分3（complement component 3，C3）為代表的補體系統(tǒng)是一種血漿蛋白水解酶級聯反應體系，為固有免疫的上游調節(jié)因子。反復流產、早產、宮內生長受限和子癇前期等妊娠并發(fā)癥與補體過度激活有關，而補體級聯的阻斷可能導致妊娠結局的改善[7]，但仍需要隨機對照試驗來驗證。而C3表達降低對胎盤發(fā)育和胎兒發(fā)育的不利影響已在C3缺陷小鼠中被證實[8]。因此，保持C3的平衡非常必要，C3的低表達和過表達可能都是有害的。

1.4 T淋巴細胞在妊娠早期，T淋巴細胞占蛻膜免疫細胞的10%～20%，其在成功著床中起著重要作用，當輔助T細胞1（T helper 1，Th1）、Th2、Th17和調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）之間達到平衡時，才能成功著床。

有研究表明，Th1 細胞因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2對妊娠有不良影響，而Th2細胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10對妊娠有積極影響。Th1/Th2比值在控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）期間波動，可能影響IVF的妊娠結局，Th1/Th2比值的升高對胚胎的細胞毒性可能增加，導致植入失敗[9]。Th1/Th2比值有可能成為檢測不孕婦女子宮內膜和移植胚胎之間免疫排斥反應的一個有用指標。

Tregs是CD4+T細胞的一個亞群，Tregs通常占小鼠和人類外周CD4+T細胞的5%～15%，特異性分子標記為CD25。Foxp3是Tregs的特異性轉錄因子，通過阻止自身抗原的免疫反應和自身免疫反應在維持免疫耐受中起主導作用。RORγt是調節(jié)Th17細胞分化的最重要的轉錄因子。Th17細胞可能負責Th1或Th2免疫不能解釋的炎癥過程，Tregs在對抗Th17細胞等效應細胞方面起著關鍵性調節(jié)作用。胚胎植入時，由Tregs介導的母體免疫耐受的活躍狀態(tài)是必不可少的。Tregs數量不足或功能不充分與特發(fā)性不孕、復發(fā)性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）有關[10]，Tregs的缺陷引發(fā)了由于胎兒免疫排斥而導致的妊娠失敗?；虮磉_分析顯示，與RIF患者相比，Foxp3基因在可育婦女中高表達，RORγt的表達水平較低。相反，與可育婦女相比，RIF患者RORγt的表達水平較高，Foxp3基因在可育婦女中低表達[11]。既往研究報道RSA患者植入窗口期間Th17/Tregs比值升高[12]，提示Th17/Tregs失衡與RIF發(fā)病有關，可作為IVF患者妊娠結局的預測因素。

2 自身抗體

2.1 抗磷脂抗體（antiphospholipid antibody，APA）APA是一組針對膜磷脂或磷脂結合血漿蛋白的自身免疫抗體。目前臨床常檢測的為抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACA）、狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant，LA）和抗β2糖蛋白Ⅰ（β2 glycoproteinⅠ，β2GPⅠ）抗體。在不明原因不孕癥和有RIF史的婦女中，8%～9%存在一種以上的APA陽性[13]。APA主要通過3個靶點導致著床失?。簝绕ぜ毎⒆甜B(yǎng)層細胞和植入前胚胎。APA對內皮細胞的作用會導致血栓形成和血管生成減少，從而導致RIF；其對滋養(yǎng)層細胞分化、增殖或侵襲的抑制作用也會表現為種植失?。黄鋵χ踩肭芭咛サ闹苯佣拘宰饔靡矔е虏幻髟騌IF。APA還可誘發(fā)炎癥性免疫反應，如外周血中NK細胞比例和Th1/Th2比例升高，導致反復妊娠丟失和多次種植失敗[14]。

2.2 抗甲狀腺抗體（antithyroid antibody，ATA）甲狀腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）是指血液中存在ATA。ATA通常指的是抗甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）抗體和抗甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）抗體?；加蠺AI的女性在ART周期和隨后的妊娠過程中很容易出現甲狀腺功能障礙，從而導致種植失敗和妊娠丟失。Kim等[14]研究發(fā)現TNF-α/IL-10比值及CD3+/CD4+細胞比值、CD56+NK細胞水平、APA陽性率和其他非特異性抗體陽性率在患有TAI女性中顯著高于無TAI女性，表明TAI對生殖的影響主要是由于免疫失調，而不是簡單的內分泌失調。但也有部分研究發(fā)現，與ATA陰性患者相比，ATA陽性患者在著床率、妊娠率、活產率等方面無差異，IVF-胚胎移植（ET）后流產的風險也不高[15]。因此對于TAI是否會導致RIF仍存在爭議。

關于補充左旋甲狀腺素（levothyroxin，LT）能否改善存在ATA的這部分RIF患者的妊娠結局，目前觀點不一。Rao等[16]基于隨機對照試驗的薈萃分析證實了補充甲狀腺素（LT4）可降低患有TAI接受IVF/ICSI周期患者的流產風險，然而，其并不能提高臨床妊娠率、活產率和早產率。一項近期的Meta分析卻提示LT的使用可能會改善TAI患者ART的妊娠結局[17]。

2.3 抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）傳統(tǒng)認為ANA是與細胞核內容物結合的自身抗體，但實際上其在細胞質和細胞器中也存在。通常將ANA分為抗DNA、抗組蛋白、抗非組蛋白、抗核仁抗體和抗其他細胞成分抗體5類。ANA常與自身免疫性疾病相關，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化和干燥綜合征等。Ying等[18]發(fā)現ANA水平升高會對卵母細胞和胚胎發(fā)育產生不利影響，從而推測ANA水平升高與RIF和RSA有關。ANA譜中抗dsDNA的存在被認為與妊娠失敗相關[19]。研究還發(fā)現，抗scl-70抗體、抗PM-scl抗體也與IVF/ICSI妊娠結局高度相關[20]。抗著絲?？贵w（anti-centromere antibody，ACA）具有胚胎毒性，在小鼠模型中證實胚胎可能是ACA在植入前的直接靶點[21]。以上研究提示為RIF患者檢測ANA可能是有必要的，對當前的臨床實踐有一定的指導意義。但其局限性在于大多數的研究并沒有強有力的證據支持，也很少有隨機對照試驗驗證。

針對RIF患者，可選擇篩查同種免疫（NK細胞、MΦ、DC、補體、Th1/Th2、Tregs等）及自身免疫型（APA、ATA、ANA等）相關指標。同種免疫指標過高或過低均不利于胚胎的成功植入，自身抗體陽性也是胚胎種植失敗的重要因素。

3 治療

目前對于免疫因素的治療主要是抗血栓和免疫調節(jié)，使用免疫調節(jié)劑或免疫抑制劑調節(jié)和抑制免疫系統(tǒng)是治療RIF的關鍵途徑之一。

3.1 阿司匹林、肝素阿司匹林是非甾體類抗炎藥，具有抑制血小板聚集和預防血栓形成的作用。肝素除具有抗血栓作用外，還具有抗炎作用，包括防止白細胞黏附于內皮細胞，其可結合選擇素和整合素并干擾補體激活。阿司匹林、低分子肝素早已被用于RSA和RIF的患者。薈萃分析表明在分別使用低分子肝素和安慰劑的RIF患者中，干預組的活產率顯著增加（29% vs.16%），而植入率無顯著改善[22]；低劑量阿司匹林（50 mg/d）抗凝治療可使APA陽性患者的活產率由19.1%提升至37.0%[23]；肝素和阿司匹林聯合應用于APA陽性的RSA婦女活產率為80%，而單用阿司匹林的婦女活產率為44%[13]。羅希等[24]認為FET前對高D-二聚體的患者行早期抗凝干預治療（低分子肝素或阿司匹林）可能改善患者的妊娠結局。

3.2 糖皮質激素糖皮質激素由于其強大的廣譜抗炎和免疫抑制特性，一直是抑制促炎介質表達和活性的首選藥物，并被用作許多免疫調節(jié)方案的關鍵組成部分，是世界范圍內對RIF患者的主要治療方法。Lédée等[25]認為只有子宮內膜Th1/Th2不平衡的RIF患者才能從強的松中獲益，而這類人群不到RIF患者的一半。Zhang等[26]首次報道了宮腔內灌注地塞米松對種植窗期uNK細胞增加的RIF患者是有益的，其潛在機制是通過下調uNK細胞的比例，從而提高子宮內膜的容受性，促進了胚胎著床。

強的松聯合阿司匹林作為抗血栓藥物治療可改善前次IVF失敗的ANA陽性患者的著床率和生殖結局[27]。然而對接受ART的無自身抗體陽性的婦女，目前尚無明確的證據表明在ART周期中使用糖皮質激素可以顯著改善患者的臨床結局。

3.3 羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）HCQ是一種抗瘧藥，已廣泛應用于各種自身免疫性疾病。其具有免疫調節(jié)、血管保護和抗血栓形成等作用，在免疫調節(jié)方面，HCQ通過抑制一些Toll樣受體的激活而影響固有免疫。HCQ能降低IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，此外，HCQ還能減少補體依賴性抗原抗體反應和增加Tregs數量。另外，HCQ可降低APA血漿水平，干擾內皮細胞活化和TNF-α的產生，這兩個是抗磷脂抗體綜合征（antiphospholipid antibody syndrome，APS）的主要作用途徑[28]?，F已證實在妊娠期使用HCQ是安全的，HCQ可能與先天性缺陷、自然流產、胎兒死亡、早產或活產數量減少的風險增加無關。長期使用HCQ有視力損害性色素性視網膜病變的風險，但Klinger等[29]對21名妊娠期平均每日服用317 mg HCQ、平均暴露時間為7.2個月的孕婦所生的兒童進行了眼科檢查，所有兒童均未發(fā)現眼部異常，因此在妊娠期間使用HCQ治療可能不會對后代造成明顯的眼部毒性風險。種植窗期高TNF-α/IL-10比值的RIF婦女采用HCQ治療該比值可以降低，HCQ能夠調節(jié)具有高Th1/Th2比值的RIF婦女的免疫系統(tǒng)[9]。

3.4 環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）CsA是一種免疫抑制劑，被廣泛用來降低移植后排斥反應的風險和治療自身免疫性疾病。CsA可干擾T淋巴細胞激活和IL-2轉錄所必需的鈣依賴信號通路，通過在細胞質中與親環(huán)素形成特殊的復合物，并與鈣調磷酸酶結合形成復合物，該復合物可防止淋巴細胞增殖和淋巴因子轉錄，從而導致免疫抑制。Azizi等[30]對反復妊娠失敗婦女使用CsA治療后，Th1細胞比例顯著降低，Th2細胞比例明顯升高，Th1/Th2比值也顯著降低，治療組活產率（81.5%） 顯著高于對照組（42.1%）。另外在胚胎植入過程中，趨化因子CXCL12和趨化因子受體CXCR4是必不可少的，在妊娠早期，CsA增加了這些分子的產生，CsA可通過阻斷絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號通路上調趨化因子配體12（CXCL12）/趨化因子受體4（CXCR4）的相互作用，促進滋養(yǎng)層細胞與蛻膜基質細胞的作用，從而增加滋養(yǎng)層細胞的數量和侵襲力[31]。此外，CsA還可調節(jié)MMP-9和MMP-2的轉錄[32]，在妊娠早期，CsA可增加滋養(yǎng)層細胞中MMP-9和MMP-2的蛋白質翻譯和蛋白水解酶活性，從而提高了滋養(yǎng)層細胞的侵襲能力。提示CsA可能將是一個良好的治療策略。

3.5 靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIg）IVIg是由數千健康者的血漿純化制成的免疫制劑，其含有多種非致病性的天然抗體和自身抗體、抗細菌等外源性抗原的抗體、IgG的Fab片段、CD95等免疫調節(jié)肽和各種細胞因子，具有免疫調節(jié)和免疫替代的雙重作用。目前認為針對RIF患者的最佳劑量為400 mg/kg。IVIg可能是RIF患者一個很好的選擇，可引起Th2型反應和細胞因子分泌的改變，降低Th1/Th2比值和NK細胞水平，從而改善妊娠結局[33]。Ahmadi等[34]認為IVIg通過影響Tregs等免疫調節(jié)機制，可以提高植入率和妊娠率。其他機制還包括IVIg可以抑制或下調B淋巴細胞產生自身抗體、阻止補體C1q、C3和C4的結合等。

3.6 宮腔灌注

3.6.1 粒細胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）G-CSF可由uNK細胞、黃體細胞合成。G-CSF通過對淋巴細胞、MΦ和Th2細胞的作用，暫時抑制免疫應答，在胚胎著床和妊娠過程中發(fā)揮作用。G-CSF在系統(tǒng)性給藥時對胚胎發(fā)育、著床和滋養(yǎng)層生長均有作用，并且在宮內局部給藥時對子宮內膜重塑和容受性有改善作用。因此，補充G-CSF被認為是生殖醫(yī)學中一種有前途的創(chuàng)新療法。但最近的一項前瞻性隨機對照試驗發(fā)現對子宮內膜正常的RIF患者進行宮腔灌注G-CSF不能改變子宮內膜厚度、臨床妊娠率和活產率[35]。

3.6.2 人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）當著床的第一步開始，囊胚黏附于母體子宮內膜時，胚胎組織就開始積極分泌hCG。在整個妊娠早期，hCG濃度會穩(wěn)步增加，因為其是由正在形成的胎盤持續(xù)釋放出來的。越來越多的證據表明，hCG在胚胎植入和胎盤形成中具有重要作用。hCG不僅參與調節(jié)早期妊娠事件，還支持母體免疫細胞在建立適當的胚胎-子宮內膜關系中發(fā)揮輔助作用。hCG參與上調Foxp3+Tregs，在ET前將hCG注入宮腔，可以通過增加Tregs來改善RIF患者的胚胎植入[36]。

目前關于宮腔灌注hCG的療效存在爭議。Xie等[37]認為宮腔灌注hCG可有效提高2次或2次以上植入失敗婦女的臨床妊娠率和活產率。而Volovsky等[38]證實了宮腔灌注hCG對臨床妊娠率和活產率有負面影響，尤其是對于沒有明確RIF的患者。不同Meta分析之間的異質性可能歸因宮腔灌注hCG的時間即ET前注射hCG的確切時間點、ET的時間點（卵裂期或囊胚期）、hCG制劑的選擇及應用劑量。綜上所述，ET前宮腔灌注hCG的總體效果尚不明確，有待進一步研究。

3.7 TNF-α拮抗劑TNF-α拮抗劑阿達木單抗（adalimumab，ADA）可通過其對T細胞的作用直接降低TNF-α/IL-10比值，從而改善RIF的妊娠結局[39]。此外，ADA可能在DC成熟過程中誘導耐受性表型并增強隨后對Tregs的誘導?；加凶陨砻庖咝约膊〉膵D女使用ADA并不會增加新生兒的畸形率。

母胎界面免疫失衡及自身抗體的存在可能導致植入失敗。因此，使用免疫抑制劑或免疫調節(jié)劑有助于預防免疫攻擊。最初，免疫調節(jié)治療重點放在抗血栓和糖皮質激素上，然后IVIg因其各種作用機制被引入。如今，新的治療策略正逐漸形成，例如單克隆抗體和宮腔灌注G-CSF等。最近，用于預防移植排斥的他克莫司和CsA也被用作免疫抑制因子來調節(jié)對胎兒的免疫反應。盡管已經有大量文獻表明免疫耐受異常及自身免疫抗體在RIF中的作用，但仍需要進一步的研究來闡明免疫調節(jié)策略的有效性和安全性。

4 結語

在過去的幾年中，生殖免疫學在RIF的研究中甚至發(fā)揮了主導作用，母胎免疫耐受失衡及自身抗體的存在可以解釋相當一部分不明原因RIF。但對于RIF的免疫研究是否有用以及免疫治療是否有益，目前還尚無共識。在現有研究的基礎上，免疫治療應用于常規(guī)臨床實踐改善生殖結局仍有爭議，不推薦將免疫調節(jié)治療作為常規(guī)的治療。但對于不明原因RIF，推薦進行免疫學相關篩查，選擇合適的人群進行免疫調節(jié)治療，以改善RIF的結局。未來迫切需要進行更好的隨機對照試驗深入RIF人群相關免疫因素的研究。