郎鵬，時曉丹，張軍強

精準醫(yī)學是一種將個人基因、環(huán)境與生活習慣差異考慮在內(nèi)的疾病預防與處置的新興方法，其本質(zhì)是通過基因組、蛋白質(zhì)組等組學技術和二代測序等醫(yī)學前沿技術，對大樣本人群與特定疾病類型進行生物標記物的分析與鑒定、驗證與應用，從而精確尋找到疾病的原因和治療的靶點，并對一種疾病不同狀態(tài)和過程進行精確分類，最終實現(xiàn)對于疾病和特定患者進行個性化精準治療的目的，提高疾病診治與預防的效益[1]。自2015年初前美國總統(tǒng)奧巴馬在美國國情咨文中提出“精準醫(yī)學計劃”以來[2]，精準醫(yī)學的概念迅速傳播普及，已成為未來醫(yī)學的發(fā)展方向，開啟了醫(yī)學發(fā)展的新時代。近年來，生殖醫(yī)學的飛速發(fā)展也得益于精準醫(yī)學概念的普及，高通量測序、全基因組關聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）、生物大數(shù)據(jù)分析等成功用于不孕不育癥的診斷、遺傳病檢測和胚胎植入前遺傳學檢測（pre-implantation genetic testing，PGT）等臨床實踐是目前精準醫(yī)學臨床應用的典范。本文主要對精準醫(yī)學在輔助生殖領域的應用以及目前得到的一些成果進行綜述。

1 精準醫(yī)學與多囊卵巢綜合征（PCOS）

PCOS是一種臨床表現(xiàn)多樣、激素變化不一的生殖內(nèi)分泌和代謝異常綜合征，影響著5%～10%的育齡期女性，臨床表現(xiàn)主要包括無排卵或稀發(fā)排卵、月經(jīng)不調(diào)、高雄激素血癥以及不孕等[3]。早在1935年Stein和Leventhal就提出了這一綜合征，但時隔85年，其致病原因尚不清楚，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)，診斷標準、治療方案均未達到統(tǒng)一[4]。

山東大學陳子江團隊通過GWAS確定了中國漢族婦女的11個基因座與PCOS有很強的相關性，包括17個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[5-6]。隨后有外國學者在白種人中驗證了這17個位點，確認了其中12個位點存在同樣的風險效應，表明這些位點在不同人群中具有類似的遺傳效應，但是這些位點出現(xiàn)的概率在不同人群中是不同的[7]。Jones等[8]研究發(fā)現(xiàn)，非肥胖PCOS患者STON1-GTF2A1L基因和LHCGR基因表達增加，而肥胖PCOS患者胰島素受體基因（INSR）的表達下降，表明肥胖PCOS患者和非肥胖PCOS患者之間的基因表達也是不同的。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）在PCOS患者的卵泡膜細胞、顆粒細胞、卵泡液等中異常表達，并且影響機體內(nèi)許多重要的生物過程[9]。McAllister等[10]通過小RNA深度測序技術發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡膜細胞中存在18個差異表達的miRNA，其中，miR-130b-3p與PCOS患者DENND1A.V2和CYP17A1的表達相關，生物信息學分析顯示miR-130b-3p可能的作用靶點與PCOS患者的高雄激素血癥有關。有研究發(fā)現(xiàn)miR-126-5p和miR-29a-5p表達在PCOS患者中顯著降低，其可通過Klotho信號通路影響PCOS患者的顆粒細胞凋亡[11]。miR-27a-3p在PCOS患者的顆粒細胞中表達顯著升高，進一步研究發(fā)現(xiàn)其表達異?？赡苁怯捎赑COS患者的胰島素抵抗導致，為研究PCOS患者顆粒細胞功能障礙提供了重要線索[12]。

因此，結(jié)合最新發(fā)現(xiàn)的基因?qū)用娴淖兓约盎ヂ?lián)網(wǎng)大數(shù)據(jù)對我國PCOS表型、癥狀和診斷策略進行全面綜合評價和判定，融入精準醫(yī)療的理念，才能在臨床上更加精確地做出PCOS的診斷，對不同患病人群給出更加精準的建議，實現(xiàn)個性化治療。

2 精準醫(yī)學與人類配子/胚胎發(fā)育障礙

關于人類配子和早期胚胎發(fā)育異常在基因?qū)用娴难芯恳恢焙苌?，隨著體外受精（IVF）技術和測序技術的發(fā)展及其廣泛應用，人類配子及早期胚胎發(fā)育的過程現(xiàn)在可以更加精準地進行評價和研究。

復旦大學王磊團隊收集在輔助生殖治療過程中發(fā)現(xiàn)的卵子及早期胚胎發(fā)育異常特殊病例，相繼發(fā)現(xiàn)了卵子成熟障礙的第一個致病基因TUBB8[13]、第二個致病基因PATL2[14]及與人類早期胚胎停育相關的第一個致病基因PADI6[15]。同時，該研究團隊先后在4個受精障礙患者家系中發(fā)現(xiàn)WEE2基因存在不同的純合突變，通過進一步研究揭示了WEE2突變的致病機制，WEE2突變通過破壞CDC2及WEE2蛋白自身的磷酸化使得成熟促進因子（maturationpromoting factor，MPF）活性升高，進而導致第二次減數(shù)分裂中期（MⅡ）卵子激活障礙，最終引起授精失敗[16]。后續(xù)對患者卵子成功進行了分子干預，逆轉(zhuǎn)了受精障礙表型，為此類患者未來的基因治療奠定了基礎。最近，該團隊對4個在IVF/胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精前后一段時間內(nèi)出現(xiàn)卵子退化凋亡的病例展開研究，發(fā)現(xiàn)糖基化蛋白PANX1相關基因突變，引起PANX1通道異常激活，加速了卵子內(nèi)部ATP釋放，最終導致卵子死亡，并明確“卵子死亡”是一種新的孟德爾顯性遺傳病[17]。

此外，還有學者研究發(fā)現(xiàn)確保卵母細胞表觀基因組正確建立的核心調(diào)控因子SETD2，在卵母細胞中特異性敲除SETD2，卵母細胞中表觀遺傳修飾的分布情況發(fā)生了巨大改變[18]。通過對SETD2的深入研究系統(tǒng)地闡明了表觀遺傳修飾之間如何通過相互作用建立包括基因印記的卵子表觀基因組，及其如何對早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生至關重要的影響。

人類卵子及早期胚胎發(fā)育中隱藏著大量前所未知的新基因，在輔助生殖治療過程中，對那些發(fā)育異常的卵子和胚胎在基因?qū)用孢M一步診斷和治療，以實現(xiàn)輔助生殖中的精準醫(yī)學。

3 精準醫(yī)學與男性不育

在全世界約15%的不孕不育夫婦中，有近乎一半是由男性原因?qū)е碌腫19]。隨著遺傳學檢測技術和組學分析技術的發(fā)展，臨床上對男性不育的檢測和治療愈發(fā)精準高效。當前，對不育癥患者基因缺陷方面的檢查主要包括染色體分析、Y染色體特定缺陷篩查[如無精子癥因子（AZF）缺失]、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子（CFTR）突變檢測、先天性低促性腺激素所致性腺功能減退癥相關的基因檢測[20]。

最近有研究對實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）擴增后的無精癥患者精漿外泌體miRNA做高通量表達譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-31-5p、miR-539-5p和miR-941可能可以作為預測無精癥的標志物[21]。

隨著蛋白組學技術的發(fā)展，對精液和精漿蛋白組學的研究也越來越深入。已經(jīng)通過組學分析證實精液或精漿中的一些蛋白可以作為無精癥的生物標志物，其中PTGDS、ACRV1、ECM1和TEX101已經(jīng)得到驗證和應用[22]。最近有學者對精索靜脈曲張的精子線粒體進行蛋白組學分析，確定了22個與精子線粒體結(jié)構(gòu)和功能相關的差異表達蛋白，這些蛋白通過影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能可能進一步導致氧化應激，從而影響精子質(zhì)量。分析這些差異表達標志物將有助于預測精索靜脈曲張患者的不育趨勢，以及為后續(xù)的抗氧化治療提供靶向路徑[23]。

4 精準醫(yī)學在PGT中的應用

以往用于PGT的方法主要有熒光原位雜交（FISH）、比較基因組雜交（CGH）、微陣列比較基因組雜交（microarray-CGH）和SNPs芯片。近年來，隨著高通量測序技術、單細胞全基因組擴增（single-cell whole genome amplification，eWGA）及其衍生技術的出現(xiàn)，植入前遺傳學診斷不斷向高分辨率、高特異性、無創(chuàng)的方向發(fā)展，同時分析單基因病和進行全面染色體診斷也成為可能[24]。

eWGA是指在單細胞水平對全基因組進行擴增的新技術。應用到PGT中，就可通過分析植入前胚胎中的單個細胞推斷出卵子本身的全部基因組信息，從而減少先天性遺傳缺陷嬰兒的出生，降低輔助生殖的醫(yī)源性風險。多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術（MALBAC）是一種全新的eWGA方法，該方法均一性高、等位基因脫扣率低、重現(xiàn)性好[25]。近年來有研究報道通過MALBAC-PGT對1例攜帶遺傳性多囊腎基因（PKD1）患者的胚胎進行基因診斷，篩選出一個不帶致病基因的胚胎進行移植，最終獲得了一個健康后代[26]。

基于高通量測序及MALBAC技術，北京大學謝曉亮團隊開發(fā)出“高通量測序揭示突變等位基因同時進行染色體異常和連鎖分析（MARSALA）”的方法，通過對MALBAC擴增產(chǎn)物進行PCR擴增檢測單基因疾病相關的單核苷酸變異（single-nucleotide variant，SNV）、拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）以及非整倍體變異，檢測中的假陽性和假陰性可以采用基于高通量測序的連鎖分析規(guī)避；采用該方法，該團隊對一個父方含有常染色體單堿基突變和一個母方含有X染色體單堿基突變的胚胎做精準選擇，成功誕生兩個沒有繼承父母單基因疾病的健康嬰兒[27]。

長讀長測序是近年來出現(xiàn)的基于高通量測序的檢測方法，其具有超長讀長、極低GC偏好性等優(yōu)勢，可以精確檢測結(jié)構(gòu)變異、串聯(lián)重復序列，不過其應用成本相對較高，檢測時間也偏長。Miao等[28]通過Nanopore全基因組長讀長測序技術，發(fā)現(xiàn)了以往短讀測序未能捕獲到的G6PC等位基因上的7.1 kb雜合缺失，結(jié)合短讀測序檢測到的另一個等位基因上的點突變，鑒定出患者家系常染色體隱性遺傳的Ⅰa型糖原貯積病的發(fā)病原因和致病基因來源，聯(lián)合qPCR和微衛(wèi)星連鎖分析篩選出僅攜帶母源點突變的胚胎進行移植，最后成功分娩一個健康女嬰。

在精準醫(yī)療的發(fā)展中，PGT無疑是最為重要的部分之一。技術的進步使得PGT能更精準地篩查出最合適的胚胎移植到母體，提高遺傳病家庭生育健康子代的可能。

5 輔助生殖領域中的大數(shù)據(jù)

5.1 輔助生殖與基因組學、轉(zhuǎn)錄組學2003年第一個人類基因組計劃的完成敲開了后基因組時代和基因組醫(yī)學的大門，生殖醫(yī)學也迅速地進入了后基因組時代的應用領域，我國的基因組分析技術走在世界前列，基因組分析技術已成功應用于對人卵母細胞和早期胚胎發(fā)育的研究。北京大學喬杰研究組和湯富酬研究組合作，利用微量細胞甚至單個細胞DNA甲基化高通量測序技術首次解析了人類早期胚胎的DNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡[29]；后期又揭示了人類早期胚胎DNA去甲基化和從頭加甲基化的動態(tài)變化、父母本基因組差異甲基化等關鍵特征，精確繪制了人類植入前胚胎和胎兒生殖細胞發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化組圖譜[30]。這一系列研究成果對于加深對人類早期胚胎發(fā)育表觀遺傳調(diào)控機制的認識、改進輔助生殖技術的安全性評估以及促進臨床上早期胚胎發(fā)育異常疑難病例的診治具有非常重要的意義。

上海同濟大學薛志剛和南京醫(yī)科大學劉嘉茵等學者利用單細胞RNA測序技術，全面分析了鼠、人類卵母細胞以及早期胚胎不同發(fā)育階段基因轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)胚胎早期發(fā)育各階段均存在母源或父源的單等位基因表達差異；胚胎早期發(fā)育各階段關于細胞周期、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯以及代謝通路的基因轉(zhuǎn)錄變化以逐步啟動的方式依序發(fā)生，胚胎早期發(fā)育由一些階段特異的關鍵樞紐基因來驅(qū)動[31]。這些研究結(jié)果闡明了哺乳動物早期胚胎不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組表達的特點，對于探討人類胚胎發(fā)育機制、對人類胎源性疾病的臨床診斷、預防和治療均具有重要意義。

5.2 大數(shù)據(jù)用于輔助生殖領域的臨床研究隨著互聯(lián)網(wǎng)時代的到來，醫(yī)療和健康數(shù)據(jù)越來越系統(tǒng)地被收集，并鏈接生物和基因數(shù)據(jù)庫，產(chǎn)生了具有海量的數(shù)據(jù)規(guī)模、高速的數(shù)據(jù)流轉(zhuǎn)、多樣的數(shù)據(jù)類型等特征的醫(yī)學“大數(shù)據(jù)”。這些大范圍的大數(shù)據(jù)研究具有很高的代表性和統(tǒng)計效能，通過分析和比對這些數(shù)據(jù)實現(xiàn)生殖醫(yī)學領域更高效益、更細致、更全面的研究，幫助實現(xiàn)最理想的孕育目標。

Yu等[32]從上海市疾控中心出生登記數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計分析了2005—2016年誕生的共2 243 125例活產(chǎn)嬰兒，其中6 372例是通過輔助生殖技術誕生的，包括1 363例IVF鮮胚移植、2 012例凍胚IVF移植、1 063例ICSI鮮胚移植和1 934例ICSI凍胚移植，研究發(fā)現(xiàn)通過輔助生殖技術尤其是通過ICSI誕生的嬰兒，性別為女性的可能性提高，也更有可能是多胎妊娠的產(chǎn)兒；通過輔助生殖技術出生的嬰兒面臨著更高的出生缺陷風險，但這些風險在凍胚移植和鮮胚移植之間的差異無統(tǒng)計學意義，還需要更大樣本的研究來驗證。

美國杜卡大學的一項研究利用輔助生殖技術注冊協(xié)會（SART）收集的數(shù)據(jù)來比較鮮胚移植和凍胚移植臨床妊娠率和活產(chǎn)率的差異，該研究分析了82 935例胚胎移植（ET）者的移植周期，其中69 102例患者為首次鮮胚移植、13 833例患者為首次凍胚移植，結(jié)果顯示在卵巢低反應和中反應人群中鮮胚移植的妊娠率和活產(chǎn)率高于凍胚移植，而卵巢高反應人群的結(jié)果卻相反[33]。

5.3 輔助生殖領域中的人工智能（artificial intelligence，AI）輔助生殖實驗室最重要的工作是預測和鑒定最有活力和發(fā)育潛能的卵母細胞或胚胎用于移植，胚胎學家通過視覺檢查、利用形態(tài)學特征對胚胎進行分級，已被成熟地應用于臨床胚胎篩選工作當中，但這種通過形態(tài)學評估胚胎的方法具有高度主觀性，在整個行業(yè)乃至單個中心都沒有統(tǒng)一的標準[34]。最近AI提取圖像紋理描述符的能力快速提升，在IVF-ET過程中用于卵母細胞或胚胎選擇的AI方法已經(jīng)顯示出越來越大的優(yōu)勢[35]。

Saeedi等[36]采用自動算法對第5天囊胚特有的生物紋理信息和物理特征進行分析，自動分割出內(nèi)細胞 團 （inner cell mass，ICM） 和 滋 養(yǎng) 外 胚 層（trophectoderm，TE）的區(qū)域范圍。在211枚囊胚中，通過對ICM和TE的自動分割及紋理特征的分析，對TE的識別準確率為86.6%，對ICM識別的準確率為91.3%。

Tran等[37]創(chuàng)建了一個名為IVY的深度學習模型（deep learning model），這是一個客觀的、完全自動化的系統(tǒng)，其直接從原始的胚胎時差成像數(shù)據(jù)（timelapse imaging）來預測妊娠，而不需要手動添加任何有關形態(tài)發(fā)生的注釋或囊胚形態(tài)評估數(shù)據(jù)。該研究對來自4個國家8個IVF中心2014年1月—2018年12月10 638個胚胎的第5天囊胚期時差成像數(shù)據(jù)和臨床結(jié)局進行回顧性分析，運用IVY預測妊娠真陽性率與假陽性率，其準確率曲線下面積（AUC）為0.93，并且具有高度的可重復性。

美國Khosravi等[38]研究實現(xiàn)了基于深層神經(jīng)網(wǎng)絡（DNNs）的AI方法來選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎，該研究根據(jù)Google的初始模型構(gòu)建一個基于DNNs的STORK框架，對美國康奈爾大學醫(yī)學院生殖醫(yī)學中心的10 148枚胚胎超過50 000張時差成像圖片識別胚胎質(zhì)量，準確率達到95%以上，遠遠優(yōu)于單個胚胎學家的判斷。這種STORK框架是完全自動的，并不需要對輸入圖像進行任何手動擴充或預處理，更不需要復雜的計算公式，具有很高的普適性。該研究還根據(jù)2 082枚胚胎的臨床數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個名叫CHAID的智能決策樹，能夠通過培養(yǎng)中的胚胎質(zhì)量結(jié)合患者年齡來預測臨床妊娠率。

6 結(jié)語與展望

不孕不育已成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病，生殖健康更是當今世界的重大課題，受到國際社會的廣泛關注。明確不孕不育癥的病因，提高輔助生殖中篩選胚胎的精準度，開發(fā)出具有針對性的精準治療顯得尤其必要和意義重大。輔助生殖的發(fā)展已和精準醫(yī)學的理念密不可分，加快新一代測序技術、大數(shù)據(jù)分析、人工智能等技術應用于臨床，生殖醫(yī)學必將迎來新的紀元。