鄒云雷，劉小慧，趙 云，劉朝奇，劉愛華*

(1.三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443000；2.重慶市梁平區(qū)婦幼保健院超聲科，重慶 405200)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是臨床常見惡性腫瘤之一[1]。肝移植和外科手術是治療早期HCC的最佳選擇，但由于移植器官供體缺乏、復發(fā)風險高，且多數(shù)HCC確診時已為晚期，導致僅有小部分患者獲益于上述治療方法。經導管動脈化療栓塞術為治療中期HCC最常用的方法[2]，但栓塞所致缺血性損傷及藥物非特異性毒性可能進一步損傷肝功能。分子層面的靶向基因療法正在成為治療各期HCC的新策略，調控特異性微RNA(microRNA， miRNA)水平能控制HCC進展[3]，可于超聲引導下將藥物或基因傳遞到靶器官。與傳統(tǒng)基因載體相比，超聲微泡用于傳遞非侵入性基因或藥物的安全性、穩(wěn)定性及轉染效率均較高[4]，已有研究[5]將超聲微泡用于治療胰腺癌，并驗證了其安全性及有效性。本文對超聲微泡介導的miRNA治療HCC研究進展進行綜述。

1 超聲微泡介導miRNA轉染機制

1.1 超聲空化效應 超聲和微泡介導的空化通過聲穿孔在血管壁上產生短暫或永久性的孔而顯著增強ROI內藥物濃度[6]?？栈肝馀菰诟?、低壓超聲波交替作用下產生的膨脹和收縮。微氣泡在聲場中穩(wěn)定振蕩，可見穩(wěn)定空化現(xiàn)象；微氣泡劇烈膨脹或崩塌時，即產生慣性空化現(xiàn)象。穩(wěn)定空化和慣性空化對鄰近組織施加機械力時，慣性空化的微泡潰滅導致額外的撞擊效應，如沖擊波和液體噴射，進一步增強超聲的空化效應[7]。目前相關研究主要針對孤立環(huán)境中的單個微泡動力學，卻很少關注體內多個微泡及其與周圍環(huán)境的相互作用。微泡間的距離或微泡與邊界間的距離均可影響空化現(xiàn)象，距離較小時會限制微泡膨脹，從而減輕空化效應。2個或多個膨脹的微氣泡可在高壓超聲下合并成單個微泡，稱為融合微氣泡；這種空化會產生更大的機械力并導致更大的孔徑，但也可能增加組織損傷范圍[8]。

1.2 腫瘤的高通透性和滯留效應 與正常組織相比，惡性腫瘤血管系統(tǒng)滲透性更強、內皮細胞間隙更寬，淋巴引流不暢且靜脈回流緩慢，有助于滲透納米級物質，增加藥物在血管外空間滯留或積聚時間；這種高通透性和滯留效應(enhanced permeability and retention effect， EPR)介導的累積稱為被動靶向，10～200 nm粒徑納米粒子可通過這種方式積聚于腫瘤部位，超聲成像所用納米級微泡、納米液滴(nano droplets， ND)的作用原理亦如此[9]。

2 超聲微泡介導miRNA轉染的遞送方式

微泡介導miRNA的主要遞送方式為微泡與miRNA不耦聯(lián)遞送、miRNA或miRNA基因裝載于微泡內或微泡殼。微米級微泡僅能到達血管，卻無法向周圍腫瘤組織滲透，故需采用微泡與miRNA不耦聯(lián)遞送方式，另將miRNA或編碼miRNA的基因裝載于其他載體。質粒是最常用于構建表達miRNA基因的載體之一，但循環(huán)過程中載有基因的質粒極不穩(wěn)定，可被血清中的核酸內切酶分解。聚乳酸-聚乙醇酸納米粒(poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles， PLGA-NP)通過超聲穿孔進入血管外腔室，被腫瘤細胞迅速內吞后，在細胞內緩慢釋放miRNA，可獲得持續(xù)治療效果[10]，且具有良好的生物相容性和降解性，是臨床所用最有效的聚合物藥物遞送載體之一[11]。采用親水分子如聚乙二醇修飾PLGA-NP表面可延長其循環(huán)時間。CHOWDHURY等[12]發(fā)現(xiàn)載有miRNA的PLGA-NP粒徑多為100～150 nm，封裝率可達70%；即使在極高濃度下，均未見PLGA-NP對癌細胞和非癌細胞產生明顯毒性。

另一方面，將miRNA或miRNA基因裝載于微泡內或微泡殼的裝載技術較為復雜，目前用于遞送miRNA至HCC細胞的微泡載體主要為相變陽離子ND及納米級陽離子脂質微泡。ND具有微泡聲學特性，體內循環(huán)時間長，且靶向性、安全性和穩(wěn)定性均較高。ND粒徑<400 nm，可經EPR外滲至周圍腫瘤組織，并在循環(huán)中保持納米級液態(tài)，直至被超聲觸發(fā)聲波液滴汽化轉變成微泡。GUO等[13]以超聲觸發(fā)相變且粒徑改變的ND遞送miR-122至HCC細胞，顯著提高了基因遞送效率。納米級陽離子脂質微泡粒徑<1 μm，氣泡殼主要為脂類物質，微泡內填充氟烷乳劑或氟烷氣體。載miRNA基因的質粒可通過靜電作用吸附于微泡殼。載質粒納米微泡可被動靶向腫瘤組織，由EPR介導滯留于腫瘤的時間更長，且納米微泡易與組織中微氣泡結合，進一步增強其聲學特性和檢測敏感度。

3 超聲微泡介導miRNA應用于HCC

3.1 miR-122/反義miR-21 miR-122在各階段HCC均顯著下降，因此上調miR-122可能減緩腫瘤細胞生長，提高腫瘤對阿霉素的敏感度[14]。相反，miR-21在HCC中高表達，以反義miR-21沉默miR-21可抑制HCC細胞增殖、遷移及侵襲，同時減輕其耐藥性[15]。CHOWDHURY等[12]將miR-122、反義miR-21分別載入PLGA-NP并經尾靜脈注射于小鼠體內，通過超聲成像引導超聲聚焦輻照小鼠一側皮下肝癌移植瘤，發(fā)現(xiàn)多次重復治療效果優(yōu)于單次治療，且聯(lián)合應用兩種互補的miRNA不僅可顯著縮小腫瘤體積、降低HCC細胞增殖、侵襲及遷移，還可提高腫瘤對阿霉素的敏感度。

WISCHHUSEN等[16]觀察超聲微泡介導miR-122、反義miR-21對免疫活性的Hepa1-6同基因HCC小鼠模型的免疫調節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction， UTMD)聯(lián)合miRNA治療可引起短暫性細胞因子風暴；miR-122和反義miR-21通過降低腫瘤的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子水平而調節(jié)腫瘤近端淋巴結中促癌因子IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-6和抗腫瘤因子IL-2、IL-12水平，從而影響免疫微環(huán)境；UTMD局部靶向治療可明顯降低治療側和對側腫瘤淋巴結IL-12和IL-17濃度，提示局部治療引起了系統(tǒng)反應。但該研究僅觀察了UTMD介導miRNA釋放后24 h內的細胞因子變化，為證實此類假設并了解反復治療后HCC免疫微環(huán)境的長期變化，仍需對更多時間點及多種治療條件下進行深入研究。除細胞因子譜外，免疫細胞群的特征也可能有助于了解該療法的免疫調節(jié)潛力。

3.2 miR-221/miR-199a miR-221高表達與HCC臨床分期、腫瘤包膜浸潤及淋巴結轉移顯著相關[17-18]。實驗研究[19]證明miR-221高表達與索拉非尼耐藥相關。HCC患者miR-221與細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor， CDKN)1B/p27、CDKN1C/p57呈負相關，可通過靶向p27和p57啟動腫瘤發(fā)生。GUO等[13]以超聲微泡將反義miR-221轉染至人肝癌細胞(human hepatoma cells， Hep)——G2細胞，發(fā)現(xiàn)CDKN1B/p27和CDKN1C/p57表達上調，HepG2凋亡增加。HCC患者miR-199a下降多提示預后不良。miR-199a可通過靶向低氧誘導因子-1a、分化簇44及調節(jié)細胞周期，抑制HCC細胞增殖。此外，miR-199a可上調CDKNlB/p27和CDKN1A/p21抑制細胞周期，誘導細胞凋亡。有學者[13]通過超聲微泡介導基因轉染觀察反義miR-21、反義miR-221和miR-199a對HepG2細胞的影響，發(fā)現(xiàn)miR-199a可在最大程度上抑制細胞增殖。

3.3 叉頭狀轉錄因子P3-miRNA 叉頭狀轉錄因子P3(forkhead box p3， Foxp3)可調控調節(jié)性T細胞(regulatory T cells， Treg)的免疫抑制功能[20]。SHI等[21]通過UTMD介導的Foxp3-miRNA轉染Treg，以降低Foxp3，結果顯示Foxp3-miRNA可下調HCC模型小鼠Treg/T細胞比例、IL-10、轉化生長因子-β及血管內皮生長因子水平，并上調IFN-γ及IL-2水平，提示其可在體外解除Treg對HCC的免疫抑制功能，通過增強免疫功能和抑制血管內皮生長因子產生，抑制腫瘤生長。目前尚不清楚UTMD介導的Foxp3-miRNA對免疫功能和腫瘤生長的長期影響，并需進一步研究如何調控Treg細胞產生精確的免疫反應及減少Treg細胞，以期增強對于腫瘤的免疫力，而不引起嚴重的自身免疫反應。

3.4 抑制磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit alpha， PIK3CA)基因的前體miRNA 編碼p110α蛋白亞基的PIK3CA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。HCC患者生存率與PIK3CA表達水平相連緊密，HCC中PIK3CA表達高于非瘤肝組織[22]，因此，抑制PIK3CA表達對于治療HCC具有重要意義。DONG等[23]篩選出4種在HCC下調且抑制PIK3CA表達的miRNA(miR-139、203a、378a及422a)，并構建了高表達載體(前體miRNA質粒)，利用超聲觸發(fā)可相變的載質粒ND，在體外通過聲穿孔傳遞基因治療荷瘤裸鼠，結果顯示前體miR-139和miR-378a可有效抑制腫瘤生長。目前應用前體miRNA聯(lián)合超聲微泡治療HCC的研究較少。此外，一種前體miRNA可產生不止一種成熟的miRNA，例如miR-17-5p和miR-17-3p均來自同一前體miR-17，靶向位點卻不同，可能出現(xiàn)不可預想的結果，有待進一步研究可控性和可行性。

3.5 miR-206聯(lián)合可溶性程序性死亡因子1 miR-206是強大的腫瘤抑制因子。結合生物信息學預測和分子細胞方法，WU等[24]發(fā)現(xiàn)miR-206可通過抑制肝細胞生長因子受體C-Met、細胞周期素D1和細胞周期蛋白依賴性激酶6表達而延緩3種不同Hep的細胞周期，誘導其凋亡及抑制增殖?？扇苄猿绦蛐运劳鲆蜃?(soluble programmed cell death 1， sPD-1)是腫瘤免疫治療的靶基因，通過阻斷程序性死亡因子1(programmed cell death 1， PD-1)/PD-1配體(PD-1 ligand， PD-L1)的相互作用而激活機體免疫系統(tǒng)。HCC中miR-206表達通常顯著降低，而靶基因C-Met表達增加。譚妍迪等[25]利用超聲介導載miR-206和sPD-1基因納米微泡治療小鼠H22肝癌皮下移植瘤，發(fā)現(xiàn)sPD-1與miR-206聯(lián)合治療可有效阻斷PD-1與PD-L1結合，上調干擾素-γ并下調PD-L1，解除T細胞的抑制，提高T細胞及自然殺傷細胞活性，進一步增強細胞毒性T淋巴細胞的抗腫瘤作用；基因治療后，腫瘤組織中B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2， BCL-2)表達降低，BCL-2相關X蛋白(BCL-2 associated X， BAX)表達增加，以聯(lián)合治療后更為明顯。上述結果進一步證實了miR-206可通過靶向C-Met促進HCC細胞凋亡；miR-206與sPD-1聯(lián)合可更有效地阻斷PD-1/PD-L1信號通路，表現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果。

4 小結與展望

超聲微泡介導miRNA治療HCC相關研究雖已取得重大進展，但在復雜多變的機體微環(huán)境中實現(xiàn)具有高診斷敏感度、高特異度和良好治療效果的靶向系統(tǒng)仍面臨諸多挑戰(zhàn)：①治療基因的定位和靶向傳遞是治療HCC的首要問題；②對超聲能量的安全強度、基因治療的復雜性和不良反應及基因載體和微泡的毒性仍需深入研究；③既往研究采用的超聲參數(shù)、動物模型和微泡濃度均有所不同，使得結果的可比性有限，亟需開發(fā)在治療期間可監(jiān)測聲學效應、估計靶組織中傳遞藥物量的系統(tǒng)；④進一步優(yōu)化微泡制備方法，提高其精度、可控性和重復性，以實現(xiàn)標準化。