陳云 王金山 王云飛 張大鵬

骨肉瘤(osteosarcoma)是骨的原發(fā)性腫瘤，主要起源于間葉組織，惡性程度極強，好發(fā)于血運豐富的長骨干骺端，在12～20歲青少年中發(fā)病率最高[1,2]。臨床上多見脛骨近端和股骨遠端，易復發(fā)和轉移，患者致殘致死率極高，一般患者生存率在70%左右且預后極差[3]。因此，探究骨肉瘤相關的生物分子標志物，對骨肉瘤早期發(fā)現(xiàn)，患者的生存與預后極為重要。黏蛋白(mucin，MUC)主要由體內多種上皮細胞分泌而來，根據結構可分為分泌型和膜結合型，生理功能包括防護外來異物、識別和保護細胞、粘性維持等[4]。研究表明MUC與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展緊密相關，在腫瘤組織中常呈異常表達[5,6]。MUC5B和MUC6同屬MUC一族，均為分泌型，由不同的黏蛋白基因編碼而成，具有不同特定功能。研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌變過程中，長期的炎癥刺激導致黏膜上皮細胞增殖、轉化，促使MUC5B高表達，從而保護上皮組織[7]。MUC6一般表達在表面小凹上皮細胞、胃竇深部腺體、黏液腺頸細胞和幽門腺細胞，屬于胃腸型免疫標志物[8]。近幾年，MUC5B和MUC6在其他腫瘤組織表達情況逐漸成為研究熱點，而筆者發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中表達水平研究較少。本研究擬采用免疫組化法測定骨肉瘤組織中MUC5B和MUC6的表達水平，探討二者與骨肉瘤患者臨床病理特征及預后的關系，以期為骨肉瘤的臨床診治和預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2014年4月至2017年4月經手術切除的骨肉瘤標本67例，其中男41例，女26例；年齡10.12～61.47歲，平均年齡(30.64±3.79)歲；腫瘤部位為肱骨、脛骨和股骨；直徑4.12～17.35 cm，平均直徑(10.91±0.85)cm。組織學分類按照Dahlin標準，骨母和軟骨細胞型29例，纖維母細胞型38例。組織學分級按照Price標準，Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ期24例。另取骨纖維異常增殖73例和正常組織標本87例。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)受試者及家屬對本研究知情，并簽訂協(xié)議書；(2)受試者在術前未曾接受放療或化療等抗腫瘤治療且無手術禁忌；(3)患者經病理診斷確診為骨肉瘤。排除標準：(1)受試者患有心臟病、肝病、高血壓等疾病；(2)受試者資料不完整，無法進行術后隨訪。

1.3 實驗試劑 鼠源人抗MUC5B、MUC6購自上海信裕生物科技有限公司；免疫組化試劑盒，DAB顯色劑，通用型二抗購自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.4 實驗方法 采用免疫組化法進行操作：將石蠟包埋的組織進行切片(厚度3～5 μm)，每個組織切6片，烘干(60℃，2 h)，烘干后經二甲苯脫蠟，依次用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度洗脫脫水、行抗原修復，其中3片滴加鼠抗人MUC5B單克隆抗體，剩余3片滴加鼠抗人MUC6單克隆抗體，25℃孵2 h。之后PBS沖洗3次，滴加通用型二抗，25℃孵育24 h，用DAB 顯色和蘇木素復染，最后用中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察拍照。用已知陽性的病理切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.5 結果判定 實驗結果采用半定量法進行描述，即通過所取樣品的陽性染色強度和陽性細胞所占百分比來共同判定。每個實驗結果由3位專業(yè)人員獨立判斷評定，具體評分標準如下，MUC5B陽性表達為細胞漿中出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒，MUC6陽性表達為細胞質或細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽性強度評分：樣品無染色0分，樣品呈淺黃色1分，樣品為黃色2分，樣品為棕黃色3分。在顯微鏡下，每張切片任意選擇3個高倍視野，按照陽性細胞所占百分比評分，評分標準：0分(陽性細胞所占比例<10%)，1分(陽性細胞所占比例10%～30%)，2分(陽性細胞所占比例30%～60%)，3分(陽性細胞所占比例>60%)。根據染色指數(shù)(staining index,SI)(即染色強度與陽性細胞所占比例的評分乘積)大小將免疫組化結果進行等級劃分：0～1分表示為陰性(-)，2～3分表示為弱陽性(+)，4～6分表示中度陽性(++)，7～9分表示強陽性(+++)。其中陰性和弱陽性表示低表達，中度陽性和強陽性表示高表達。

1.6 隨訪 所有骨肉瘤患者治療后均接受常規(guī)隨訪，隨訪時間12～48個月，本次隨訪截止日期2018年4月30日，死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時間，本次隨訪中位時間26.08個月。觀察并記錄骨肉瘤患者在隨訪期間復發(fā)和生存情況。

2 結果

2.1 MUC5A和MUC6在各類骨組織上的表達水平 MUC5B在骨肉瘤組織中陽性表達呈現(xiàn)為彌漫性細胞漿染色，MUC6陽性表達呈現(xiàn)為細胞質/細胞膜染色。骨肉瘤組織中MUC5B和MUC6陽性表達率分別為79.10%(53/67)和71.46%(48/67)，均顯著高于正常組織組、骨纖維異常增殖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常組織組與骨纖維異常增殖組骨肉瘤組織中MUC5B和MUC6陽性表達率相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各類骨組織MUC5B和MUC6的表達水平 例(%)

2.2 MUC5B和MUC6水平與骨肉瘤臨床病理指標的關系 MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小、Dahlin分類、Price分級無相關性(P>0.05)，與腫瘤的組織分化程度、有無肺轉移、臨床分期顯著相關(P<0.05)。見表2。

表2 MUC5B和MUC6水平與骨肉瘤臨床病理指標的關系 例(%)

2.3 MUC5B和MUC6表達水平與骨肉瘤患者生存率的關系 MUC5B高表達骨肉瘤患者中位生存時間為17.76個月，顯著短于MUC5B低表達患者中位生存時間(35.77個月)(P<0.05)。MUC6高表達骨肉瘤患者中位生存時間為19.07個月，顯著短于MUC6低表達患者(35.70個月)(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 MUC5B表達水平與骨肉瘤患者生存率關系

2.4 影響骨肉瘤患者預后的危險因素 單因素分析表明，有肺轉移、高中組織分化、MUC5B高表達、MUC6高表達均是影響骨肉瘤患者不良預后的危險因素。多因素分析表明，有肺轉移、MUC5B高表達、MUC6高表達是影響骨肉瘤患者不良預后的獨立危險因素(HR=1.465，95%CI為1.033～2.079；HR=2.378，95%CI為1.889～2.993；HE=2.101，95%CI為1.638～2.694，P均<0.05)。見表3。

圖2 MUC6表達水平與骨肉瘤患者生存率關系

3 討論

目前骨肉瘤的病因尚不清楚，普遍認為可能與病毒感染、遺傳因素、放射線損傷等有關。骨肉瘤臨床主要表現(xiàn)為疼痛(常由間接性發(fā)展成連續(xù)性)和局部軟組織腫塊，早期病患處皮膚發(fā)亮，晚期呈現(xiàn)淺表靜脈充盈[9]。由于臨床癥狀不明顯，易出現(xiàn)誤診現(xiàn)象，大多數(shù)患者在確診時已有微小轉移灶存在，錯過最佳治療時期。因此研究與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展有關的生物標志因子已成為當前研究的熱點。

近幾年MUC在腫瘤組織異常表達情況成為研究熱點，在胃癌、乳腺癌、結直腸癌等有研究報道，隨著臨床研究的發(fā)展，MUC有望為腫瘤早期診斷和預后提供判斷依據[10]。MUC5B和MUC6在其他癌癥中的表達水平已被廣泛研究報道。王平凡等[11]研究表明MUC5B在腸上皮化生和幽門腺的陽性表達率顯著高于膽囊腺癌，推測致癌因素長期刺激引起MUC5B表達下調，黏蛋白對機體保護作用減弱，導致膽囊腺發(fā)生癌變。王云檢等[12]研究表明MUC5B在膽囊結石組織中表達水平顯著高于膽囊息肉組和對照組，分析可能是一些誘導因子會促進MUC5B高表達，從而導致粘液分泌量和粘度增加，導致枸櫞酸鈉或其它鈣鹽的沉積，促進膽囊結石的發(fā)生。鄭瑞等[13]研究表明在不同Siewert分型的早期胃癌患者體內MUC6表達水平有顯著差異，并與早期胃癌的組織學分型、腫瘤大小、浸潤程度、萎縮情況和腸化生顯著相關。陳思敏等[14,15]研究表明在胰腺導管內管狀乳頭狀腫瘤伴浸潤性癌(IPTN)組織中高表達，提示MUC6有助于臨床病理診斷IPTN。

表3 影響骨肉瘤患者預后的危險因素分析

本研究采用免疫組化法測定MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中表達水平，結果表明陽性表達率分別為68.70%(46/67)和71.46%(48/67)，顯著高于正常組織組和骨纖維異常增殖組，提示MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中異常高表達，與骨肉瘤有相關性。本研究還發(fā)現(xiàn)，MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中的表達水平與腫瘤的組織分化程度、有無肺轉移有關，提示MUC5B和MUC6可能參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MUC5B高表達、MUC6高表達骨肉瘤患者中位生存時間分別顯著短于MUC5B低表達、MUC6低表達患者，提示MUC5B高表達、MUC6高表達骨肉瘤患者預后情況較差。最后本研究采用COX多因素分析發(fā)現(xiàn)，有肺轉移、MUC5B高表達、MUC6高表達是影響骨肉瘤患者不良預后的獨立危險因素，提示MUC5B和MUC6可能作為判斷骨肉瘤預后的臨床指標。

綜上所述，MUC5B和MUC6在骨肉瘤患者癌組織中表達水平顯著升高，與骨肉瘤的組織分化程度、有無肺轉移及生存情況有關，有望成為骨肉瘤預后的檢測指標，但是二者參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的機制有待進一步研究。