方宇 王海娟 李征洋 張黎

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌兩種病理類型，是臨床常見的惡性腫瘤之一，近年來，其臨床發(fā)病率及死亡率均呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，盡管隨著醫(yī)療技術(shù)及設(shè)施設(shè)備的提高和改進(jìn)，患者生存時間有所延長，但患者術(shù)后5年生存率仍只有50%左右[1,2]。腫瘤的發(fā)病涉及多基因、多通道、多步驟等復(fù)雜過程，其發(fā)展多與機體免疫相關(guān)，通過對免疫檢查點的免疫檢測作用來實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的分化和增殖[3]。細(xì)胞程序死亡配體1(PD-L1)是免疫家族負(fù)性調(diào)節(jié)因子PD-1的配體蛋白，PD-L1與PD-1分子的結(jié)合而組成PD-1/PD-L1通路，通過提高及活化體內(nèi)過氧化氫和活性氧水平來促進(jìn)體內(nèi)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)凋亡，抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的攻擊[4]。腺苷2a受體(A2aR)為1種免疫逃逸因子，可通過激活T、B細(xì)胞中腺苷酸環(huán)化酶生成環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，負(fù)性調(diào)節(jié)CTL對腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷[5]。目前，而由PD-1/PD-L1通路與腺苷介導(dǎo)的免疫逃逸之間是否在腫瘤發(fā)展過程中存在協(xié)作關(guān)系尚不十分明確。因此，本研究通過研究PD-L1與A2aR在大腸癌及其對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。從而探討兩者在大腸癌發(fā)生、發(fā)展、臨床治療及預(yù)后中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年12月至2018年7月治療的76例大腸癌患者癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織石蠟標(biāo)本作為研究對象。所選標(biāo)本患者術(shù)前均未接受放化療及其他輔助治療，患者術(shù)后經(jīng)實驗室病理學(xué)檢查證實為大腸癌，臨床病歷資料完整，研究經(jīng)院倫理會批準(zhǔn)同意。其中，男47例，女29例；年齡32～69歲，平均年齡(62.35±4.46)歲；<60歲31例，≥60歲45例；腫瘤直徑(5.24±1.23)cm：<5 cm 52例，≥5 cm 24例；TNM分期：Ⅰ 期15例，Ⅱ期24例，Ⅲ 期26例，Ⅳ 期11例；癌分化程度Broders分級：Ⅰ 期16例，Ⅱ期39例，Ⅲ 期21例；浸潤深度：漿膜內(nèi)42例， 漿膜外34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：有32例，無44例；脈管侵犯情況：有47例，無29例。

1.2 檢測方法 PD-L1、A2aR均采用免疫組化染色法進(jìn)行檢測，其中，兔抗人多克隆抗體 Anti-PD-L1，(貨號E07C0574)，anti-A2aR(貨號E07C0865)均購自上海自藍(lán)基生物科技有限公司，免疫組織化學(xué)相關(guān)試劑盒購自賽默飛世爾科技公司，PD-L1、A2aR檢測操作過程均嚴(yán)格按照試劑盒所提高的使用說明書進(jìn)行。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判斷 PD-L1、A2aR陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)[6,7]對免疫染色結(jié)果的評價方法，采取雙盲獨立觀察法進(jìn)行評估，以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃或褐色顆粒為陽性表達(dá)。根據(jù)PD-L1、A2aR陽性細(xì)胞所占的比例及顯色強度進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞比例計分方法：陽性細(xì)胞比例0～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；顯色強度計分方法：未出現(xiàn)黃色或褐色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，褐色計3分。以陽性細(xì)胞所占比例和顯色強度兩項計分之乘積為PD-L1、A2aR染色陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中，PD-L1兩項乘積結(jié)果3分級以上判斷為陽性表達(dá)，A2aR兩項乘積結(jié)果5分級以上判斷為陽性表達(dá)。分別計算PD-L1、A2aR的陽性表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1、A2aR蛋白在大腸癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率(56.68%)明顯高于其腸癌旁組織(31.58%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A2aR蛋白在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率(71.05%)顯著高于其腸癌旁組織(34.21%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1，圖1。

表1 PD-L1、A2aR蛋白在大癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)結(jié)果比較 n=76

圖1 癌組織中PD-L1陽性表達(dá)(a)，癌旁組織中PD-L1陽性表達(dá)(b)，陰性對照(c)；腸癌組織A2aR陽性表達(dá)(d)，癌旁組織中A2aR陽性表達(dá)(e)，陰性對照(h)(PV×40)

2.2 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的陽性表達(dá)與Broders分級、侵襲深度、TNM分期、脈管侵犯有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在高Broders分級、侵襲深度至漿膜外、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期以及存在脈管侵犯的病理特征中具有高表達(dá)；而與年齡、腫瘤直徑及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PD-L1與A2aR在大腸癌組織中表達(dá)的關(guān)系 PD-L1與A2aR共同陽性表達(dá)37例，共同陰性表達(dá)16例，采用 Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PD-L1與A2aR陽性表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=0.305，P=0.019)。見表3。

表3 PD-L1與A2aR在大腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 例

2.4 A2aR蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 A2aR蛋白在大腸癌組織中的陽性表達(dá)與Broders分級、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管侵犯有關(guān)(P<0.05)，其中，在高Broders分級、侵襲深度至漿膜外、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期以及存在脈管侵犯的病理特征中具有高表達(dá)；而與年齡、腫瘤直徑無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 A2aR蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

腫瘤抗原激活T細(xì)胞活性和免疫應(yīng)答包括2個信號通路，即通過由組織相容性復(fù)合體-抗原肽復(fù)合物、共刺激或共抑制蛋白分子與T細(xì)胞的相互作用來實現(xiàn)，兩者缺一不可，否則會導(dǎo)致T細(xì)胞活化及失活狀

態(tài)失衡，造成T細(xì)胞免疫效應(yīng)下降甚至細(xì)胞凋亡[8]。其中，共刺激或共抑制蛋白分子稱為免疫檢查點，包括CD28/B7家族成員。近年來，隨著臨床對免疫檢查點阻滯劑的不斷深入研究，通過抑制免疫檢查點來重建機體對腫瘤的免疫應(yīng)答體系，為臨床治療晚期惡性腫瘤提高了新方法，在晚期惡性腫瘤的治療中起到較大的作用[9,10]。

PD-L1又稱為B7-H1，為B7家族重要成員之一，也是程序性細(xì)胞死亡因子PD-1的兩種配體之一，是負(fù)責(zé)腫瘤免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的重要負(fù)性因子。癌組織中的PD-L1蛋白通過與NK 、T及B淋巴細(xì)胞中PD-1進(jìn)行結(jié)合進(jìn)行PD-1/PD-L1結(jié)合體，激活CD28/B7相關(guān)信號通路，引發(fā)T、B淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能障礙，誘發(fā)IL-10等炎性因子生成，保護(hù)腫瘤自身細(xì)胞受到CTL介導(dǎo)的免疫攻擊，從而為腫瘤的生長創(chuàng)造條件[11]。臨床研究表明，近年來，由PD-1/PD-L1通路介導(dǎo)下的免疫抑制在乳腺癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)展中均具有重要的作用，PD-L1在以上各種癌組織中均具有高表達(dá)，且PD-L1的陽性表達(dá)與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、分化程度及遠(yuǎn)期生存率存在密切關(guān)系[12-14]。本研究結(jié)果顯示，PD-L1在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于其腸癌旁組織(P<0.05)，結(jié)果提示，PD-L1可能在大腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用。此外，本研究通過對不同病理特征癌組織中PD-L1表達(dá)情況的分析結(jié)果顯示，PD-L1在Broders分級及TNM分期越高、侵襲深度越深以及發(fā)生脈管侵犯的病理特征中表達(dá)水平越高(P<0.05)。因此，通過對PD-L1表達(dá)水平的檢測，有助于了解大腸癌病情進(jìn)展，在臨床診斷和治療中具有重要意義。

有學(xué)者指出，A2aR與PD-L1存在一定的相關(guān)性[19]，通過阻斷 A2aR的表達(dá)可起到增強抗PD-1/PD-L1信號通路的作用，進(jìn)而減低腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和浸潤的幾率[20]。因此，我們設(shè)想能否通過分析A2aR與PD-L1兩者的關(guān)系給大腸癌臨床診斷和治療提供一定指導(dǎo)依據(jù)。本研究結(jié)果中，A2aR與PD-L1均在分化程度、病理分期、侵襲深度等大腸癌組織中具有高表達(dá)，應(yīng)用Spearman對進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果顯示，A2aR與PD-L1在大腸癌組織中的陽性表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)果提示，A2aR與PD-L1可能在大腸癌的發(fā)展中存在某種協(xié)調(diào)作用，其具體作用機制有待臨床進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，A2aR與PD-L1在大腸癌組織中均具有高表達(dá)，與癌組織分期、分化程度、侵襲深度以及脈管侵犯有關(guān)，通過對兩者的監(jiān)測，可為大腸癌的臨床診斷、治療及預(yù)后提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。