徐真諦 李潤芝 李元寬 楊小生

1 材料與方法

1.2 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)基置于37℃、5%的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞刺激:A549細(xì)胞以5×105個(gè)/孔鋪于24孔板中，加入10 ng/ml的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17A、TNF-α或GM-CSF進(jìn)行刺激24 h，或加入10 μmol/L的BAY 11-7082(NF-κB抑制劑組)、STAT5-IN-1(STAT5抑制劑組)、AS1517499(STAT6抑制劑組)、Fludarabine(STAT1抑制劑組)、FLLL32(STAT3抑制劑組)或DMSO(與抑制劑中的DMSO含量相當(dāng)，DMSO組)以及培養(yǎng)基(對照組)預(yù)先孵育1 h，然后清洗掉孔中的培養(yǎng)基，再加入新的RPMI 1640培養(yǎng)基，同時(shí)利用10 ng/ml 的IFN-γ進(jìn)行刺激24 h，收集A549細(xì)胞，用于PD-L1的水平檢測。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù):胰酶消化培養(yǎng)的A549細(xì)胞，利用無菌PBS清洗2次，然后加入PE標(biāo)記的抗人PD-L1抗體及相應(yīng)的同型IgG抗體，于4℃孵育30 min，隨后用PBS清洗2次，加入4%的多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗2次后重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞表達(dá)PD-L1的情況。

1.3.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離:取體檢健康人的外周血，用無菌PBS按照1∶1的體積比進(jìn)行稀釋，50 ml離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液，并將稀釋后的血液輕柔的加在淋巴細(xì)胞分離液的上層，放入離心機(jī)中，以2 000 r/min的速度離心20 min，吸取中間的白膜層細(xì)胞即為所需的單個(gè)核細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的檢測 體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞經(jīng)重組人細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17A、TNF-α或GM-CSF刺激后，檢測PD-L1的表達(dá)水平。與同型對照染色比較，PD-L1抗體染色顯示未刺激細(xì)胞中PD-L1陽性細(xì)胞比例為(39.6±5.8)%，提示A549細(xì)胞可組成性的表達(dá)PD-L1分子；當(dāng)利用IFN-γ刺激后，可觀察到PD-L1陽性細(xì)胞比例為(94.3±4.9)%，與未刺激組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示IFN-γ可誘導(dǎo)A549細(xì)胞上調(diào)表達(dá)PD-L1；A549細(xì)胞經(jīng)IL-17A、TNF-α或GM-CSF刺激后，PD-L1陽性的細(xì)胞比例分別為(40.5±14.3)%、(43.7±16.1)%和(41.3±10.4)%，與未刺激組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示IL-17A、TNF-α或GM-CSF刺激未能有效改變A549細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平。見圖1，表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)染色檢測不同細(xì)胞因子刺激A549細(xì)胞表達(dá)PD-L1的水平

表1 不同細(xì)胞因子刺激A549細(xì)胞表達(dá)的PD-L1水平

2.2 IFN-γ經(jīng)STAT1信號(hào)參與誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá) 基于IFN-γ能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞上調(diào)表達(dá)免疫抑制性分子PD-L1，我們進(jìn)一步利用信號(hào)通路抑制劑預(yù)先處理A549細(xì)胞，然后再加入IFN-γ進(jìn)行刺激以探討其中的信號(hào)機(jī)制。結(jié)果顯示：在IFN-γ刺激的情況下，STAT1抑制劑Fludarabine組中PD-L1的表達(dá)水平顯著低于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而NF-κB抑制劑BAY 11-7082組、STAT3抑制劑FLLL32組、STAT5抑制劑STAT5-IN-1組和STAT6抑制劑AS1517499組中PD-L1的表達(dá)水平與DMSO組基本持平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此提示IFN-γ通過STAT1信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)上調(diào)。見表2，圖2。

表2 不同信號(hào)通路抑制劑對IFN-γ誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)PD-L1的影響

圖2 不同信號(hào)通路抑制劑對IFN-γ誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)PD-L1的水平比較

表3 IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1抑制T細(xì)胞增殖

3 討論

自PD-L1被鑒定發(fā)現(xiàn)后，其在腫瘤中的生物學(xué)功能得到了廣泛的研究和探討[11-13]。大量研究證實(shí)：腫瘤微環(huán)境中惡變的上皮細(xì)胞、浸潤的巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞等多個(gè)細(xì)胞均可上調(diào)表達(dá)PD-L1分子[14,15]，并通過與其特異性的受體PD-1結(jié)合抑制抗腫瘤免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能，進(jìn)而有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究利用A549細(xì)胞作為非小細(xì)胞肺癌來源的腫瘤細(xì)胞模型，探討PD-L1分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控及其對T細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞可組成性的表達(dá)PD-L1，而促炎性因子IFN-γ則進(jìn)一步通過STAT1信號(hào)誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而通過結(jié)合PD-1分子以抑制T細(xì)胞的增殖，最終促使腫瘤細(xì)胞得以躲避免疫監(jiān)視。

PD-L1是1個(gè)大小為40 kD的跨膜蛋白，最早由華人科學(xué)家陳列平教授所發(fā)現(xiàn)并將其命名為B7-H1。當(dāng)時(shí)的研究顯示其能夠影響T細(xì)胞的活性和分化功能，但并不結(jié)合CD28、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)以及誘導(dǎo)性共刺激子(ICOS)，因此，他認(rèn)為PD-L1是1個(gè)新的共刺激分子，在T細(xì)胞的活化中起著正調(diào)控作用。然而，后續(xù)的研究鑒定出PD-L1是免疫抑制分子PD-1的特異性配體，功能學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示PD-L1與PD-1結(jié)合后能夠抑制T細(xì)胞的功能，從而有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，由此證實(shí)PD-L1為免疫抑制性分子[16]。目前，PD-L1已被發(fā)現(xiàn)廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，且其在腫瘤細(xì)胞中的上調(diào)表達(dá)受到組織炎性微環(huán)境的影響。早期文獻(xiàn)報(bào)道，Wang等[17]發(fā)現(xiàn)在體外利用炎性細(xì)胞因子IL-17A或TNF-α刺激前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，兩種細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)水平均顯著上調(diào)；此外，Concha-Benavente等[18]在頭頸癌的研究中顯示IFN-γ亦可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上調(diào)PD-L1的表達(dá)，而GM-CSF則被報(bào)道能夠誘導(dǎo)胃癌組織浸潤的中性粒細(xì)胞上調(diào)表達(dá)PD-L1，由此提示腫瘤微環(huán)境中PD-L1的表達(dá)水平可由多個(gè)炎性因子所介導(dǎo)。然而，這些炎性細(xì)胞因子是否能夠直接作用于肺癌細(xì)胞，進(jìn)而上調(diào)PD-L1的表達(dá)水平并不清楚。因此，本研究以A549細(xì)胞作為研究對象，在體外利用IFN-γ、IL-17A、TNF-α或GM-CSF分別刺激細(xì)胞，然后檢測其表面的PD-L1水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IFN-γ能夠刺激A549細(xì)胞上調(diào)表達(dá)PD-L1，但I(xiàn)L-17A、TNF-α或GM-CSF對PD-L1的表達(dá)則無明顯影響，由此提示非小細(xì)胞肺癌中腫瘤細(xì)胞的PD-L1高表達(dá)很可能由IFN-γ所調(diào)控。此外，最新研究顯示，腫瘤組織中共表達(dá)IFN-γ和PD-L1的肺癌患者臨床預(yù)后優(yōu)于僅表達(dá)IFN-γ或PD-L1的肺癌患者[19]，進(jìn)一步證實(shí)肺癌微環(huán)境中IFN-γ與PD-L1的表達(dá)密切相關(guān)。盡管IL-17A、TNF-α及GM-CSF在誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞系或中性粒細(xì)胞的PD-L1表達(dá)過程中至關(guān)重要，但它們并不參與影響A549細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，這可能與細(xì)胞的類型不同或腫瘤細(xì)胞的組織來源不同有關(guān)，抑或是A549細(xì)胞未能表達(dá)這些細(xì)胞因子的相應(yīng)受體，后續(xù)研究將深入分析A549細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子相關(guān)的特異性受體表達(dá)情況。

IFN-γ通過作用于其相應(yīng)的受體，進(jìn)而激活下游的級聯(lián)信號(hào)，最終誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)后發(fā)揮生物學(xué)作用。文獻(xiàn)報(bào)道包括STAT家族和NF-κB在內(nèi)的多個(gè)信號(hào)不僅能夠介導(dǎo)IFN-γ的下游信號(hào)傳遞，而且可以參與調(diào)控PD-L1的表達(dá)[20,21]，然而，IFN-γ誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞表達(dá)PD-L1的信號(hào)機(jī)制仍不清楚。因此，本研究利用多個(gè)信號(hào)通路抑制劑預(yù)先處理A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在均有IFN-γ刺激的條件下，預(yù)先加入STAT1抑制劑Fludarabine的處理組中，表達(dá)PD-L1的A549細(xì)胞陽性細(xì)胞比例顯著低于未加信號(hào)抑制劑組，而NF-κB抑制劑BAY 11-7082組、STAT3抑制劑FLLL32組、STAT5抑制劑STAT5-IN-1組和STAT6抑制劑AS1517499組中表達(dá)PD-L1的A549細(xì)胞陽性細(xì)胞比例則與未加信號(hào)抑制劑組相當(dāng)，由此提示IFN-γ可刺激非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞上調(diào)表達(dá)PD-L1，其功能的實(shí)現(xiàn)依賴于STAT1信號(hào)通路。因此，雖然IFN-γ可經(jīng)其受體活化下游多個(gè)信號(hào)通路，但是針對某一特定腫瘤細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)則很可能由單一的信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)。研究表明腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)上調(diào)可體現(xiàn)為其基因水平DNA的擴(kuò)增、染色質(zhì)的修飾、轉(zhuǎn)錄水平mRNA的增加、翻譯水平蛋白表達(dá)的增加以及翻譯后的修飾等多個(gè)層次的改變[22]。那么，當(dāng)IFN-γ經(jīng)其特異性受體激活STAT1信號(hào)后，是通過哪一個(gè)或哪幾個(gè)層次的改變以上調(diào)PD-L1的表達(dá)水平仍有待進(jìn)一步證實(shí)。

PD-L1作為免疫抑制性的表面分子，已被公認(rèn)為與其受體PD-1結(jié)合后抑制T細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)因子以及分泌細(xì)胞毒性顆粒[23]，然而，該免疫抑制信號(hào)對T細(xì)胞增殖能力的影響仍不十分清楚。因此，本研究繼續(xù)探討了IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1是否參與抑制了T細(xì)胞的增殖效果。體外實(shí)驗(yàn)顯示，相較于未刺激的A549細(xì)胞，IFN-γ刺激的A549細(xì)胞能夠顯著抑制T細(xì)胞的增殖，而當(dāng)加入抗PD-L1抗體阻斷PD-L1與PD-1的結(jié)合后，T細(xì)胞的增殖能力得以恢復(fù)，由此表明IFN-γ通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞上調(diào)表達(dá)的PD-L1分子參與抑制了T細(xì)胞的功能。然而，既往的研究業(yè)已證實(shí)IFN-γ本身是T細(xì)胞來源的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞因子，其在靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，為什么會(huì)誘導(dǎo)免疫抑制性分子PD-L1的表達(dá)以協(xié)助腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸呢[24]?這可能是在腫瘤的演變進(jìn)化過程中，腫瘤細(xì)胞利用免疫細(xì)胞的效應(yīng)因子IFN-γ上調(diào)表達(dá)PD-L1，進(jìn)而結(jié)合免疫細(xì)胞表面的PD-1分子，以負(fù)反饋的形式抑制免疫細(xì)胞釋放IFN-γ，從而避免了被免疫細(xì)胞殺傷和清除。我們將在后期的研究中，進(jìn)一步探討IFN-γ在非小細(xì)胞肺癌中抗腫瘤和促腫瘤平衡中的兩面性。此外，A549是體外建立的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，雖然能夠作為細(xì)胞模型探討肺癌細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的生物學(xué)功能，但其仍然不能完全替代非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中的原代肺癌細(xì)胞，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將通過收集臨床非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織，并分離純化出腫瘤細(xì)胞加以培養(yǎng)和刺激，深入研究PD-L1分子在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控及其臨床意義。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可通過激活下游STAT1信號(hào)途徑誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞表達(dá)PD-L1，進(jìn)而通過結(jié)合PD-1以抑制T細(xì)胞的增殖能力，為全面闡明PD-L1在非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境中的表達(dá)調(diào)控提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，將為臨床更加有效地靶向設(shè)計(jì)阻斷PD-L1及其相關(guān)調(diào)控信號(hào)STAT1提供了新思路。