丁聚賢 ，謝興文，許偉，李鼎鵬，李寧，蘇積亮，柳博，李建國，柴利軍

0 引言

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）好發(fā)于青少年以及兒童，是臨床最多見的原發(fā)惡性骨腫瘤，常見部位為四肢關節(jié)附近，早期易出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，病死率高，惡性程度高[1]。目前，新輔助化療聯(lián)合手術是早期OS治療的一線選擇方案，術前化療可殺死部分OS細胞和微小的跳躍灶、縮小腫瘤體積，有利于手術切除。但仍有部分患者面臨治療失敗，導致早期局部復發(fā)或遠端轉(zhuǎn)移，其主要原因是腫瘤細胞對抗癌藥物耐藥及低敏感度[2]。近年來，逆轉(zhuǎn)OS耐藥的制劑逐漸應用于臨床，但效果不佳且不良反應大，因此尋求全新的有效逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的方法迫在眉睫。中醫(yī)藥具有高效、低毒、多靶點、多通路協(xié)同作用的優(yōu)勢，近年來關于中醫(yī)中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究較多，ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)參與了腫瘤細胞多藥耐藥的重要進程，已有大量研究證實部分中藥可通過調(diào)控ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)OS細胞的化療耐藥[3]。本文從ABC跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與OS化療耐藥性產(chǎn)生的關系及中醫(yī)藥通過調(diào)控ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)的機制作一概述，以期為中醫(yī)藥輔助治療OS提供臨床依據(jù)。

1 ABC跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

近年來，對于腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生機制已取得了大量的突破性進展，發(fā)現(xiàn)化療藥物的攝取與轉(zhuǎn)運及活化障礙、轉(zhuǎn)運藥物的酶活性異常、腫瘤細胞損傷修復能力增強、細胞周期阻滯與凋亡失衡、自噬等都會影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感度[4]，其中化療藥物攝取、轉(zhuǎn)運及活化障礙尤為重要，腫瘤細胞可借某些膜蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運功能將化療藥物排出細胞外，從而達到降低細胞內(nèi)有效藥物濃度的目的，進而降低化療藥物的殺傷作用。ABC（ATP-binding cassette,ABC）跨膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族在腫瘤細胞中的主要作用是將那些進入細胞內(nèi)的化療藥物轉(zhuǎn)運出去，它參與了腫瘤細胞多藥耐藥的重要進程，目前發(fā)現(xiàn)該家族有48個成員，研究較多的如P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、多藥耐藥相關蛋白1（MDR-associated protein,MRP1），可作為化療藥外泵系統(tǒng)，降低腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度，最終對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥[5]。

1.1 P-gp介導的腫瘤化療耐藥機制

P-gp是有MDR編碼的分子量為170 kDa的蛋白質(zhì)，約包含1276～1280個氨基酸，依賴ATP產(chǎn)生的能量發(fā)揮其功能[6]。P-gp與轉(zhuǎn)運毒物及藥物等的解毒功能有關，位于細胞膜上，由結(jié)構相似的兩半組成，每一半都有1個跨膜結(jié)構域（MSD）和1個高度保守的ATP結(jié)合域（NBD）[7]。P-gp與多種腫瘤細胞的多藥耐藥性的產(chǎn)生有關，腫瘤細胞膜表面高表達的P-gp能抑制抗腫瘤藥物的吸收并促其外排（如蒽環(huán)類、紫杉醇、長春堿、依托泊苷），導致腫瘤細胞對抗腫瘤藥的低敏感度。綜合現(xiàn)有研究，P-gp參與化療耐藥途徑的機制有三種：（1）藥物與P-gp直接結(jié)合并排除胞外；（2）抗腫瘤藥與P-gp在脂質(zhì)分子層結(jié)合，從而化療藥未進入胞內(nèi)便被排出；（3）部分抗腫瘤藥最終進入腫瘤細胞內(nèi)，P-gp會將其泵入細胞質(zhì)內(nèi)膜腔，出胞作用將其排出細胞[8]。此外，P-gp還可通過各種方式參與腫瘤細胞的凋亡、增殖、遷移及促進腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等。目前已有大量研究證實P-gp的高表達與腫瘤惡性程度及化療耐藥性的產(chǎn)生密切相關，Sugawara[9]報道，在腎上腺腫瘤、胰島素腫瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、腎細胞癌、膀胱癌組織中P-gp均存在高表達，與腫瘤的惡性組織學行為呈正相關。Leonard等[10]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、腎癌、白血病和乳腺癌等惡性腫瘤化療后腫瘤的進展與P-gp的表達也呈正相關。楊力[11]研究發(fā)現(xiàn)P-gp在OS組織中多呈陽性表達，可作為判斷OS性質(zhì)及評估其化療預后的指標。由此可見，多種腫瘤組織內(nèi)存在P-gp的異常表達，且與腫瘤組織的惡性程度及對化療藥物的敏感度密切相關。

1.2 MRP1介導的腫瘤化療耐藥機制

MRP1基因位于人類染色體16p13.1上，與P-gp的功能相似，都可通過外排作用泵出抗癌藥物發(fā)揮腫瘤細胞的解毒作用，但二者轉(zhuǎn)運底物和機制存在差異，MRP1優(yōu)先運載親水分子和有機陰離子，無法轉(zhuǎn)運未被修飾的抗腫瘤化合物，在泵出化療藥物前抗癌藥物需要與谷胱甘肽（glutathione,GSH）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）耦合為有機陰離子結(jié)合物，然后再依靠細胞膜上的ATP泵出細胞外，從而降低化療藥在細胞內(nèi)的有效作用濃度[12]。同時，MRP1可改變細胞內(nèi)藥物的分布，阻斷細胞的解毒系統(tǒng)，從而介導耐藥[13]。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)MRP1蛋白的表達率與多種腫瘤細胞的耐藥性相關，且與患者的預后相關，介導著如OS、肝癌等多種惡性腫瘤的耐藥過程[14]。Li等[15]研究了缺氧與人OS細胞Notch信號通路和MRP1的表達關系，發(fā)現(xiàn)低氧條件下OS細胞可通過Notch信號途徑上調(diào)MRP1蛋白的表達，從而導致對化療藥物的敏感度降低?？傊?，MRP1的表達與OS密切相關，與OS惡性程度、耐藥程度呈正相關。

2 中藥逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療耐藥的研究

2.1 通過調(diào)控P-gp的表達逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥

中藥逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥常見的機制是通過鈣離子阻滯作用及調(diào)控某些信號通路的表達，從而抑制P-gp的表達起到逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用。中藥粉防己主要活性成分粉防己堿具有抗炎、鈣通道阻滯及抗氧化的作用[16]，高濃度粉防己堿具有強大的逆轉(zhuǎn)阿霉素對OS耐藥的作用，可通過抑制細胞膜上P-gp的表達增加化療藥在人OS耐藥U2OS細胞內(nèi)的積聚，抑制外排[17]。姜黃素與粉防己堿相似，亦可通過抑制P-gp的表達增加化療藥在耐藥細胞內(nèi)的有效作用濃度，體外研究發(fā)現(xiàn)，2 μg/ml的姜黃素對U-2OS/ADM細胞的抑制率接近50%[18]。我國著名傳統(tǒng)方劑片仔癀的抗腫瘤作用已得到廣泛證實，可通過誘導OS細胞凋亡、抑制其遷移和侵襲能力，有效地在體內(nèi)外水平抑制OS細胞生長[19]。同時，體外研究發(fā)現(xiàn)[20]片仔癀具有顯著逆轉(zhuǎn)OS細胞耐藥的作用，與姜黃素、粉防己堿相比，片仔癀似乎更具優(yōu)勢，其不僅可通過抑制P-gp的表達，增加化療藥在耐藥細胞U-2OS/ADM內(nèi)的有效積聚，還可通過調(diào)控凋亡蛋白家族（下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2，并上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達）顯著增加耐藥OS細胞U-2OS/ADM的凋亡作用，因此片仔癀可通過多途徑有效逆轉(zhuǎn)OS細胞的耐藥作用。蘆薈酮B是中藥苦豆子的黃酮類化合物，具有黃酮類化合物典型的抗炎、抗氧化作用。Xia等[21]通過體外研究發(fā)現(xiàn)蘆薈酮B可以通過NF-κB信號途徑抑制P-gp的轉(zhuǎn)錄和表達有效逆轉(zhuǎn)MG-63/DOX細胞對多柔比星的耐藥性，同時，研究還發(fā)現(xiàn)無毒濃度下的蘆薈酮B可以增加多柔比星誘導的OS細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)中藥砒霜主要活性成分三氧化二砷[22]與川芎嗪[23-24]均可通過下調(diào)細胞膜P-gp和Bcl-2蛋白增強OS細胞的化療敏感度，誘導其凋亡，川芎嗪可以顯著增強U-2OS細胞對阿霉素、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺的敏感度，三氧化二砷聯(lián)合阿霉素能顯著抑制MG63/DOX細胞的增殖。綜上，我們發(fā)現(xiàn)，許多中藥單體具有明確的逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥的作用，最主要的機制是抑制細胞膜表面的P-gp表達，部分中藥單體還與細胞內(nèi)信號通路、抑凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的協(xié)同調(diào)控有關。

2.2 通過調(diào)控MRP1的表達逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥

MRP1蛋白介導著多種腫瘤細胞對化療藥物，如抵抗蒽環(huán)類、長春新堿、抗葉酸藥物等[25]的耐藥過程，與OS的耐藥機制密切相關，已有部分研究證明中藥有效成分可通過下調(diào)MRP1的表達逆轉(zhuǎn)OS化療的耐藥性。淫羊藿有效成分淫羊藿苷Ⅱ和淫羊藿苷（ICT）對人OS耐藥細胞MG-63/DOX均有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用，且ICT逆轉(zhuǎn)作用更佳，呈劑量依賴性誘導凋亡，機制研究發(fā)現(xiàn)ICT降低了MG-63/DOX細胞內(nèi)MDR1和MRP1基因編碼的蛋白水平[26]。β-欖香烯不僅可以通過多種途徑抑制腫瘤細胞的生長，減少骨肉瘤患者化療不良反應，還可以協(xié)同增強放化療的效果[27-28]。體外研究發(fā)現(xiàn)欖香烯能通過下調(diào)MRP1的表達有效抑制阿霉素所誘導的MG-63細胞耐藥[29]。此外，P-gp/MRP1抑制劑漢防己甲素能夠有效逆轉(zhuǎn)OS細胞對阿霉素、依托泊苷、長春瑞濱的耐藥性，因而對已產(chǎn)生耐藥的OS治療推薦P-gp和MRP1抑制劑聯(lián)合應用[30]。綜上，中藥有效成分在逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥的過程中與下調(diào)MRP1的表達密切相關。另外，屠重棋等[31]應用免疫組織化學法檢測了6例正常骨組織和45例OS組織中MRP1的表達，發(fā)現(xiàn)MRP1在OS中高表達，且與惡性程度呈正相關。因此，抑制MRP1的表達是降低OS侵襲性與逆轉(zhuǎn)化療耐藥的有效手段。

3 小結(jié)

近年來，中藥抗腫瘤研究呈日漸增多的趨勢，中藥可利用多通路、多靶點協(xié)同的優(yōu)勢，不僅能提高機體免疫功能，還具有明顯的化療增敏、改善肝功能、促進造血功能恢復、防止肺轉(zhuǎn)移等輔助抗腫瘤的作用[32]，因此在OS治療過程中具有較好的應用價值和前景。目前中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的主要機制有下調(diào)P-gp的表達、抑制MRP1基因的表達、促進耐藥細胞的凋亡、調(diào)控某些信號通路等[33]，其中P-gp與MRP1是ABC跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的主要成員蛋白，也是目前介導OS化療耐藥的主要分子蛋白，通過上述研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)中藥是通過下調(diào)P-gp與MRP1實現(xiàn)OS逆轉(zhuǎn)耐藥的，但部分中藥單體如欖香烯可通過多種途徑（降低MRP1表達及抑制酶系統(tǒng)表達）逆轉(zhuǎn)OS的化療耐藥，且目前的研究主要集中在體外實驗，因此在未來應注重單體的臨床療效對比研究及部分明確有逆轉(zhuǎn)作用的中藥單體其他機制的再研究，以發(fā)揮中藥抗OS的最大優(yōu)勢。