張楠茜，李春楠，呂經(jīng)緯，高曉晨，張齡予，張 輝，孫佳明

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其患者通常出現(xiàn)記憶功能減退、語(yǔ)言障礙、時(shí)間定向力障礙等癥狀，目前已嚴(yán)重威脅到老年人的健康及生活[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣血虧虛、營(yíng)衛(wèi)不和、五臟失衡可致神明受損、腦髓空虛、神失所養(yǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致老年癡呆。人參味甘而微苦，微溫不燥，功善大補(bǔ)元?dú)猓B(yǎng)血生津，廣益五臟，為“治虛勞內(nèi)傷之第一要藥”[2]；鹿茸味甘咸性溫，《本草綱目》載曰：“生精補(bǔ)髓，養(yǎng)血益陽(yáng)，強(qiáng)健筋骨”。二者一擅補(bǔ)益元?dú)猓荒苎a(bǔ)腎益精，合用則陽(yáng)得陰助，陰得陽(yáng)化，養(yǎng)陰補(bǔ)髓、填精充腦。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道較多改善記憶功能的方劑均含有人參、鹿茸，故將“人參-鹿茸”配伍，可精簡(jiǎn)組分，提高其藥效。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新方法，因其具有整體性和系統(tǒng)性的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方及單味藥的作用機(jī)制研究中[3-4]。介于“人參-鹿茸”化學(xué)成分復(fù)雜且用于治療阿爾茨海默癥的作用機(jī)制尚不明確，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的特點(diǎn)通過網(wǎng)絡(luò)分析方法篩選出人參和鹿茸中的潛在活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)，并構(gòu)建藥物分子靶點(diǎn)-疾病之間的協(xié)同作用關(guān)系，最后系統(tǒng)解析藥對(duì)間的相互作用關(guān)系，為深入研究“人參-鹿茸”藥對(duì)治療阿爾茨海默癥提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 建立人參-鹿茸化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù) 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php）及中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析平臺(tái)（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）挖掘人參、鹿茸相應(yīng)化學(xué)成分。同時(shí)，還從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了7 種重要的藥理學(xué)相關(guān)性數(shù)據(jù)，包括分子量（MW），脂水分配系數(shù)（AlogP），氫鍵供體數(shù)（Hdon），氫鍵受體數(shù)（Hacc），生物利用度（OB），藥物細(xì)胞穿透性（Caco-2），類藥性（DL）。

1.2 有效成分篩選 以利賓斯基五法則（ADME）為理論依據(jù)，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性指數(shù)（drug-like lndex，DL）≥0.18 為指標(biāo)對(duì)人參、鹿茸中的有效成分進(jìn)行篩選。同時(shí)滿足OB ≥30%，DL ≥0.18 這2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的有效成分可進(jìn)行下一步分析。同時(shí)，利用Google Scholar 進(jìn)行大規(guī)模的文本挖掘，將含量高或活性強(qiáng)的化合物也歸入有效成分庫(kù)中。

1.3 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 首先，將有效成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch），通過2D 和3D 結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測(cè)有效成分的靶點(diǎn)。在 TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“Alzheimer”關(guān)鍵詞搜索與阿爾茨海默癥相關(guān)的靶點(diǎn)，所得靶點(diǎn)即為阿爾茨海默癥靶點(diǎn)。將有效成分與阿爾茨海默癥相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，可得 “人參與鹿茸”與阿爾茨海默癥進(jìn)行相互作用的核心靶點(diǎn)，同時(shí)使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（uniprot database）選擇物種為“homo sapiens（human）”的靶點(diǎn),將靶點(diǎn)名稱和基因名稱進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

1.4 GO 生物過程注釋富集及KEGG 信號(hào)通路分析利用 Cytoscape 軟件中的“ClueGO”插件對(duì)的核心靶點(diǎn)進(jìn)行 GO（gene ontology）生物過程注釋富集，建立 GO 生物過程注釋層級(jí)關(guān)系圖，分析核心靶點(diǎn)在體內(nèi)強(qiáng)有效性的生物過程注釋。KEGG 信號(hào)通路分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）將核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genesand genomes）信號(hào)通路富集，物種與背景設(shè)置均為“homo sapiens”（智人），研究關(guān)鍵靶點(diǎn)投射的 KEGG 信號(hào)通路與疾病之間的相互關(guān)系，明確可能的藥理機(jī)制。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)：1）成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（CT 網(wǎng)絡(luò)），將 “人參-鹿茸”有效成分與其相應(yīng)的靶點(diǎn)構(gòu)建CT 網(wǎng)絡(luò)；2）成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（CTP網(wǎng)絡(luò)），建立由成分、靶點(diǎn)及其相應(yīng)通路組成的CTP網(wǎng)絡(luò)。所有可視化網(wǎng)絡(luò)圖由Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）構(gòu)建，利用 Network Analyzer 插件計(jì)算 Degree 值，對(duì)核心靶點(diǎn)與信號(hào)通路間的作用關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.6 貢獻(xiàn)指數(shù)計(jì)算 為了預(yù)測(cè) “人參-鹿茸”中每種有效成分治療阿爾茨海默癥的貢獻(xiàn)值，提出了基于成分網(wǎng)絡(luò)效能（NE）的文獻(xiàn)加權(quán)貢獻(xiàn)指數(shù)（CI）計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 潛在活性成分篩選結(jié)果 由于單味藥材及中藥復(fù)方中的成分繁多且復(fù)雜，為了得到具有良好藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性的有效成分，本研究選擇ADME（吸收，分布，代謝和排泄）參數(shù)作為篩選指標(biāo)。利用TCMSP和TCM 在“人參-鹿茸”中共篩選得到230 個(gè)化合物，其中人參190 個(gè)，鹿茸40 個(gè)。以O(shè)B ≥30%和DL ≥0.18 為指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最后在“人參-鹿茸”藥對(duì)中得到29 個(gè)具有良好ADME 性質(zhì)的潛在活性成分。其中人參中包括Stigmasterol、β-Sitosterol、Kaempferol 和Ginsenoside Rh2 等16 個(gè)潛在活性成分；鹿茸中包括17-Beta-Estradiol、Glicosamine 和Adenosine Triphosphate 等13 個(gè)潛在活性成分。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道可知，Kaempferol 具有抗炎、抗腫瘤作用[5-6]；FrutinoneA表現(xiàn)出有效的抗細(xì)菌和真菌的特性[7]；Adenosine Triphosphate 具有調(diào)節(jié)突觸傳遞和膠質(zhì)細(xì)胞的作用[8]；Ceramide 可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡和衰老等生命活動(dòng)[9]。

2.2 “人參-鹿茸”治療阿爾茨海默癥靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 目前可用來(lái)篩選新藥與阿爾茨海默癥相關(guān)靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法有限且耗時(shí)較長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)利用計(jì)算機(jī)模擬的思路來(lái)篩選“人參-鹿茸”有效成分和阿爾茨海默癥的目標(biāo)靶點(diǎn)。通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，映射出40 個(gè)“人參-鹿茸”有效成分與阿爾茨海默癥相關(guān)的靶點(diǎn)，其中排名前5 的目標(biāo)靶點(diǎn)分別 為muscarinic acetylcholine receptor M2（CHRM2）、acetylcholinesterase（ACHE）、butyrylcholinesterase（BCHE）、peroxisome proliferator-activated receptor gamma（PPARG）、dopamine D2 recepto r（DRD2）。

2.3 抗阿爾茨海默癥的生物過程注釋及通路分析 為了進(jìn)一步闡明“人參-鹿茸”與阿爾茨海默癥相關(guān)靶點(diǎn)的作用機(jī)制，利用Cytoscape 軟件中的“Clue GO”插件和Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“人參-鹿茸”治療阿爾茨海默癥的40 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物過程注釋富集及KEGG 信號(hào)通路分析。以P＜0.01 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)26 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物過程注釋富集分析，得到12 個(gè)GO 生物過程注釋，包括分子功能層面的淀粉樣β 蛋白的反應(yīng)和G 蛋白偶聯(lián)受體活性，以及細(xì)胞組分中的突觸傳遞的負(fù)調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)突觸后膜電位等系列生物過程注釋。

在KEGG 通路富集分析中共得到 32 條信號(hào)通路，根 據(jù)P＜0.01 篩選出排名靠前的9 條信號(hào)通路，分別為神經(jīng)活性配體-受體相互作用（hsa04080）、癌癥的途徑（hsa05200）、5-羥色胺能突觸（hsa04726）、cAMP信號(hào)通路（hsa04024）、PI3K-Akt信號(hào)通路（hsa04151）、磷脂酶D 信號(hào)通路（hsa04072）、味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)（hsa04742）、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)（hsa04610）和阿爾茨海默癥（hsa05010）。

潘玲珍等[10]研究了長(zhǎng)期使用地西泮對(duì)小鼠神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路的影響。通過長(zhǎng)期且逐量遞增的方式給小鼠連續(xù)灌胃地西泮60 d，提取小鼠全腦總mRNA，進(jìn)行小鼠全基因組芯片檢測(cè)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選出差異表達(dá)基因，并通過《京都基因與基因組百科全書》的基因功能通路數(shù)據(jù)庫(kù)分析神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，地西泮組的神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路上的16 個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了顯著性變化，其中表達(dá)上調(diào)的基因有9 個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有7 個(gè)。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體配體的集合。

張泓波等[11]通過觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管性癡呆大鼠海馬組織環(huán)磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）-cREB 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)cAMP 信號(hào)通路可增強(qiáng)多種靶點(diǎn)基因的表達(dá)并增加突觸數(shù)量，進(jìn)而提高記憶能力。其將大鼠隨機(jī)分為補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、尼莫地平組、模型組、假手術(shù)組。用改良Pulsinelli’s 四血管阻斷法建立血管性癡呆大鼠模型,分別給予相應(yīng)的藥物，連續(xù)治療30 d。利用放射免疫分析法檢測(cè)海馬組織cAMP 含量，Western blotting 法檢測(cè)PKA 催化亞基（PKAc）蛋白表達(dá)，電泳遷移率改變分析法檢測(cè)CREB 的DNA 結(jié)合活性。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織cAMP 含量、PKAc 蛋白表達(dá)和CREB 的DNA 結(jié)合活性均降低（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和尼莫地平組cAMP 含量、PKAc 蛋白表達(dá)和CREB的DNA 結(jié)合活性均升高（P＜0.01）。補(bǔ)陽(yáng)還五湯可增加血管性癡呆大鼠海馬cAMP 含量、PKAc 蛋白表達(dá)和CREB 的DNA 結(jié)合活性，增強(qiáng)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的作用進(jìn)而起到改善大鼠血管性癡呆的情況。

GABBOUJ S 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素-PI3K-Akt 信號(hào)通路在大腦的多種生理功能中起著重要的作用，如代謝、突觸形成和細(xì)胞生長(zhǎng)和存活?；诹餍胁W(xué)、臨床和動(dòng)物模型的研究結(jié)果已經(jīng)建立了T2D 和AD 之間的密切聯(lián)系，PI3K-Akt 信號(hào)的改變是這些疾病的共同點(diǎn)。當(dāng)磷脂酰肌醇水平降低時(shí)，在AD 患者的腦中觀察到5-二磷酸3-激酶（PI3K）亞基以及鈍的Akt 激酶磷酸化，其特征與β-淀粉樣和tau 蛋白現(xiàn)象相似。通過鼻內(nèi)胰島素（IN）治療增強(qiáng)了CNS 中PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)，可改善記憶。已知胰島素通過PI3K-Akt 信號(hào)通路增強(qiáng)神經(jīng)元生長(zhǎng)和突觸形成。但是，PI3K-Akt途徑在其他細(xì)胞類型（如小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）中也介導(dǎo)與不同功能相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)。此外，最近發(fā)現(xiàn)有缺陷的Trem2 產(chǎn)生Aβ 噬菌斑的轉(zhuǎn)基因時(shí)，小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致Akt-mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)受損及AMP 活化蛋白激酶的活化。這導(dǎo)致了自噬體的積累，代謝障礙。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞形成周圍簇的能力下降A(chǔ)β 斑塊和營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)突的形成增加。因此，TREM2-DAP12 信號(hào)利用與胰島素部分相同細(xì)胞，通過PI3K-Akt 信號(hào)通路誘導(dǎo)其下游效應(yīng)。由此可見，PI3K-Akt 信號(hào)通路可在細(xì)胞增殖和分化等方面起到重要作用。

2.4 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及貢獻(xiàn)指數(shù)分析 通過Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖和“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖?！俺煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中包含69個(gè)節(jié)點(diǎn)（nodes）和214 條邊（edges），其中2 個(gè)靶點(diǎn)為人參單獨(dú)作用于阿爾茨海默癥，5 個(gè)靶點(diǎn)為鹿茸單獨(dú)作用于阿爾茨海默癥，剩余33 個(gè)靶點(diǎn)為人參、鹿茸共同作用于阿爾茨海默癥，這說明 “人參-鹿茸”配伍可起到協(xié)同作用于阿爾茨海默癥的效果?！俺煞?靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中包括78 個(gè)節(jié)點(diǎn)（Nodes）和284 條邊（Nodes），其中有9 個(gè)節(jié)點(diǎn)為KEGG 通路富集中得到排名靠前的9 條重要通路，人參和鹿茸通過40 個(gè)靶點(diǎn)協(xié)同作用于重要通路中。

網(wǎng)絡(luò)中的高度互聯(lián)源于各節(jié)點(diǎn)的高值，結(jié)合文獻(xiàn)加權(quán)的網(wǎng)絡(luò)功效提出了每個(gè)有效成分的貢獻(xiàn)指數(shù)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果所示，“人參-鹿茸”中17-Beta-Estradio（LR-1）、Adenosine Triphosphate（LR-3）、Retinol（LR-8）、Kaempferol（RS-3）、Ginsenoside Rb1（RS-16）和Panaxadiol（RS-12）6 個(gè)有效成分對(duì)治療阿爾茨海默癥的貢獻(xiàn)最大，置信區(qū)間（confidence interval，CI）值為87.13%。因此，以上6 個(gè)有效成分為 “人參-鹿茸”藥對(duì)治療阿爾茨海默癥的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論

人參和鹿茸皆為名貴中藥，被歷代醫(yī)家所選用，基于二者“扶正固本，生精益血”的特性，常被組成具有調(diào)神養(yǎng)身、益智抗衰功效的方劑。目前人口老齡化問題較為嚴(yán)峻，阿爾茨海默癥作為一種嚴(yán)重影響中老年人工作和生活的疾病，已引起生物醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。由于阿爾茨海默癥的致病機(jī)制較為復(fù)雜，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未明確，故本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的角度闡明“人參-鹿茸”在治療阿爾茨海默癥上的分子協(xié)同作用。將利用ADME法則篩選出的29個(gè)有效成分進(jìn)行文獻(xiàn)加權(quán)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[13-17]人參和鹿茸中的有效成分治療阿爾茨海默癥的生物活性，表明ADME 篩選標(biāo)準(zhǔn)的可信度。通過CTP 網(wǎng)絡(luò)圖可發(fā)現(xiàn)，“人參-鹿茸”中的有效成分與阿爾茨海默癥相關(guān)的核心靶點(diǎn)之間具有密切聯(lián)系，其中Cholesterol、17-Beta-Estradiol、β-sitosterol和 Kaempferol 等有效成分可通過AChE 靶點(diǎn)作用于cAMP信號(hào)通路；Ginsenoside Rb1、Girinimbin、Frutinone A 和Vitamin B1 等有效成分可通過PTRS2 靶點(diǎn)作用到PI3K-Akt 信號(hào)通路上，PI3K -AKT 信號(hào)通路作為細(xì)胞生存信號(hào)通路之一，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡均有重要意義。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果可知，“人參-鹿茸”中的三萜類化合物、黃酮類化合物和甾類化合物等藥效成分可通過減輕炎癥反應(yīng)、降低乙酰膽堿酯酶活性、通過PI3K-Akt 信號(hào)通路抑制 tau 蛋白過度磷酸化，穩(wěn)定鈣離子濃度減少神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮治療阿爾茨海默癥的作用，其中AChE 靶點(diǎn)和PI3K-Akt 信號(hào)通路在阿爾茨海默癥復(fù)雜的病理機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中起到重要作用，與目前文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道的情況基本相符。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出“人參-鹿茸”藥對(duì)中治療阿爾茨海默癥的活性成分及相關(guān)作用靶點(diǎn)，并進(jìn)一步建立成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，分析生物過程注釋及信號(hào)通路，從系統(tǒng)上研究“人參-鹿茸”藥對(duì)治療阿爾茨海默癥的內(nèi)在規(guī)律，確定了人參、鹿茸在機(jī)體分子層面的核心靶點(diǎn)，闡釋了其治療阿爾茨海默癥潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，同時(shí)也為中藥研究阿爾茨海默癥復(fù)雜的應(yīng)用提供了參考。