張帆 梁清洋 韓超 劉佳* 唐毓金*

1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科，廣西 百色 533000 2.右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與衰老相關(guān)的骨骼疾病，包括骨質(zhì)和骨骼結(jié)構(gòu)的惡化，從而增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。OP是我國(guó)最常見(jiàn)的慢性疾病之一，在老年人的骨疾病中居于首位。社會(huì)老齡化的日益加重，使我國(guó)OP患者數(shù)量突破了1億，預(yù)計(jì)30年后，患者數(shù)量極有可能增長(zhǎng)一倍。流行病學(xué)調(diào)研[1]顯示，年齡超過(guò)50歲的人群OP患病率為19.2 %，其中男性為6.0 %，女性為32.1 %，城市地區(qū)為16.2 %，農(nóng)村地區(qū)為20.7 %，年齡超過(guò)60歲的人群患病率更是超過(guò)30 %?？梢缘贸?，隨著未來(lái)我國(guó)老年人口數(shù)的不斷增加，骨質(zhì)疏松癥將持續(xù)成為一場(chǎng)公共衛(wèi)生和醫(yī)療保健領(lǐng)域的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)起源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，是存在于骨組織中，起到接受刺激和發(fā)揮效應(yīng)作用的細(xì)胞，它最終可以分化為成熟的骨細(xì)胞。各種因素的刺激都可以造成細(xì)胞分化的增殖或凋亡，產(chǎn)生許多骨骼相關(guān)的疾病[2]。破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)，由Kolliker于1873年首次發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于單核-巨噬細(xì)胞系，主要負(fù)責(zé)調(diào)控機(jī)體的骨吸收。破骨細(xì)胞還通過(guò)分泌可溶性因子(包括S1P、CTHRC1和C3)影響成骨細(xì)胞的形成和分化。成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞軸功能異常在OP的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，只有成骨和破骨達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)，才能使機(jī)體骨量維持正常，否則，就容易發(fā)生OP、骨硬化癥等骨病。

1 Wnt信號(hào)通路的組成及細(xì)胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制

自1982年努斯(R Nusse)和瓦爾莫斯(HE Varmus)首次發(fā)表涉及Wnt家族的第一篇文章以來(lái)，對(duì)Wnt信號(hào)的探索逐漸深入，涉及細(xì)胞的分化、維持、免疫、應(yīng)激、癌變和凋亡，機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等多個(gè)方面。Wnt是一大類糖蛋白的統(tǒng)稱，它們多位于細(xì)胞外，以結(jié)構(gòu)中存在大量的半胱氨酸為特征。

Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括經(jīng)典的β-catenin途徑、平面細(xì)胞極性途徑和Wnt/Ca2+途徑等。本文重點(diǎn)關(guān)注依賴β-catenin的經(jīng)典通路。研究[3]發(fā)現(xiàn)組成經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)分子包括Wnt分泌蛋白、跨膜受體卷曲蛋白、松散蛋白、β-連環(huán)蛋白、糖原合成激酶3β、軸蛋白、T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子、酪蛋白激酶1、低密度脂蛋白受體依賴性蛋白5/6等。β-連環(huán)蛋白是重要的功能蛋白之一，早期發(fā)現(xiàn)其具有粘附分子的作用，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定，還涉及重要的細(xì)胞活動(dòng)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它是介導(dǎo)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的關(guān)鍵因子。其中β-catenin的細(xì)胞核內(nèi)含量的變化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟。

Wnt配體是一類分泌型糖蛋白[4]，含有19個(gè)胞外配體的大家族，可以同時(shí)激活Wnt經(jīng)典和非經(jīng)典途徑，從而誘導(dǎo)復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的形成。首先，Wnt蛋白先粘附到細(xì)胞表面，與Frz和LRP5 /6受體復(fù)合物相結(jié)合，再繼續(xù)活化細(xì)胞膜內(nèi)的Dsh蛋白，Dsh蛋白活化后可抑制GSK3β，使β-catenin可以和鈣粘附蛋白E組成復(fù)合體，然后β-catenin不斷地積聚，向細(xì)胞核定向移動(dòng)，主動(dòng)的結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF，形成基因轉(zhuǎn)錄的復(fù)合體，最后在相關(guān)輔助因子的作用下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，調(diào)控靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。這樣，信號(hào)就由Wnt蛋白這一個(gè)位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)導(dǎo)到整個(gè)通路上，然后對(duì)整個(gè)機(jī)體產(chǎn)生網(wǎng)狀的效應(yīng)。

2 對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控作用

成骨細(xì)胞的功能主要是分泌膠原纖維和蛋白多糖，在骨形成階段發(fā)揮作用。在骨骼受到損傷時(shí)，機(jī)體首先反應(yīng)是成骨細(xì)胞增殖、成熟，形成新生的骨組織，這個(gè)過(guò)程受到各種因素的調(diào)控，如果成骨受到影響就可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)Wnt3a可以激活β-catenin，在體外Wnt3a等蛋白可以抑制成骨細(xì)胞的凋亡。彭?xiàng)钴缱拥萚5]發(fā)現(xiàn)Wnt3a可以促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)的增殖、提高ALP的活性和加強(qiáng)骨保護(hù)素的表達(dá)，最終促進(jìn)成骨?；蜓芯縖6]發(fā)現(xiàn)KLF14在BMSC中高表達(dá)，抑制KLF14表達(dá)可促進(jìn)BMSC的成骨分化，Wnt3a啟動(dòng)子與KLF14相互作用，導(dǎo)致Wnt3a和Wnt信號(hào)通路中下游成骨相關(guān)靶基因的表達(dá)下降。也有研究[7]認(rèn)為Wnt3a與骨形態(tài)發(fā)生蛋白9具有協(xié)同作用，共同加強(qiáng)堿性磷酸酶在間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。Wnt3a也可以調(diào)控雌激素受體的表達(dá)，雌激素正向調(diào)節(jié)BMSC向成骨方向分化。

Bennett等[8]培育人骨鈣素啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)股骨骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)較野生型小鼠顯著增高，而成骨細(xì)胞凋亡或破骨細(xì)胞數(shù)量和活性無(wú)明顯變化，得出Wnt10b主要通過(guò)刺激成骨細(xì)胞的生成來(lái)增加骨量。Wnt16被認(rèn)為是皮質(zhì)骨的重要調(diào)節(jié)蛋白，可以增加體內(nèi)皮質(zhì)骨骨小梁的質(zhì)量和強(qiáng)度。魏雙雙等[9]研究發(fā)現(xiàn)將Wistar雌性大鼠切除雙側(cè)卵巢后，雌激素分泌減少，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，補(bǔ)充外源性雌激素4個(gè)月后，檢測(cè)Wntl6mRNA表達(dá)升高，說(shuō)明雌激素也可能通過(guò)Wnt16進(jìn)一步調(diào)節(jié)成骨。Wnt5a是Wnt家族的非典型成員，既往研究?jī)H涉及非經(jīng)典Wnt途徑。實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建Wnt5a-/-基因小鼠，發(fā)育成熟后小鼠表現(xiàn)出低骨密度，骨礦化減少[10]。Wnt5a還可以抑制β-catenin信號(hào)，降低特異性周期蛋白-D1的水平進(jìn)而抑制Wnt3a。新的一項(xiàng)研究[11]表明它也可以影響ROCK的活性來(lái)促進(jìn)ALP活性升高，提高RUNX2和骨鈣素基因的表達(dá)，下調(diào)成脂標(biāo)志物等，可能影響經(jīng)典Wnt通路。同時(shí)，Wnt信號(hào)在成骨超過(guò)正常時(shí)，自身的促進(jìn)成骨作用減弱以維持機(jī)體的骨平衡[12]。

3 對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控作用

破骨細(xì)胞是一種非傳統(tǒng)意義的多核巨噬細(xì)胞，通過(guò)單核前體細(xì)胞融合形成，與骨吸收、骨重建密切相關(guān)。破骨細(xì)胞分化成熟的過(guò)程受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后，可以調(diào)控破骨細(xì)胞的表達(dá)。細(xì)胞研究[13]表明β-catenin和TCF蛋白一樣，都可以調(diào)節(jié)存在于成骨細(xì)胞中具有抑制破骨細(xì)胞分化作用的骨保護(hù)素的表達(dá)。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，將β-catenin基因敲除后，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞表達(dá)增加，小鼠表現(xiàn)重度骨質(zhì)疏松，提示W(wǎng)nt信號(hào)可能是負(fù)向調(diào)控破骨細(xì)胞的分化來(lái)維持骨穩(wěn)態(tài)。

Wnt3a間接調(diào)控破骨細(xì)胞。研究[14]證實(shí)Wnt3a可以通過(guò)成骨細(xì)胞調(diào)控RANKL的表達(dá)，來(lái)抑制破骨細(xì)胞生成。RANKL/OPG/RANK信號(hào)途徑是破骨細(xì)胞形成和活化的主要調(diào)控系統(tǒng)。RANKL是破骨細(xì)胞分化和骨吸收的關(guān)鍵介質(zhì)[15]。成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞(包括成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞)表達(dá)RANKL，RANKL受多種不同因素的調(diào)節(jié)，包括激素，細(xì)胞因子和機(jī)械力等。RANK的化學(xué)本質(zhì)是一種跨膜蛋白，在單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。OPG是一種腫瘤壞死因子受體(TNFR)，一種糖蛋白，存在形式有分子質(zhì)量為60 ku的單體和分子質(zhì)量為120 ku的同源二聚體。OPG的作用是直接抑制RANK/RANKL復(fù)合體的活性，也可通過(guò)與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，間接抑制骨吸收。Kondo等[16]發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素通過(guò)下調(diào)OPG的表達(dá)，抑制Wnt信號(hào)通路從而造成骨量下降。人工敲除小鼠OPG基因，小鼠會(huì)發(fā)生骨質(zhì)疏松癥，如果該基因過(guò)度表達(dá)，將可能導(dǎo)致石骨癥。目前人工重組OPG、RANKL單克隆抗體已應(yīng)用于臨床[17]。

Wnt5a可以激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，也可以直接作用于破骨細(xì)胞[18]，成骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞分泌的Wnt5a與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中Ror2結(jié)合，共同激活JNK，進(jìn)而c-Jun被招募到RANK啟動(dòng)子Sp1，促進(jìn)RANK的表達(dá)，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞生成。Wnt16通過(guò)非經(jīng)典途徑抑制T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated Tcells 1，NFAT1)激活，實(shí)驗(yàn)中如果將已被特異性敲除Wnt16(Wnt16-/-)的成骨細(xì)胞在1α,25-二羥維生素D3誘導(dǎo)條件下與破骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，可以發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的分化增強(qiáng)，這進(jìn)一步證實(shí)Wnt16負(fù)向調(diào)控破骨細(xì)胞的形成[19]。另外，Wnt16也可以激活MC3T3-E1細(xì)胞(小鼠前成骨細(xì)胞)中的Wnt/β-catenin信號(hào)，誘導(dǎo)OPG的表達(dá)，進(jìn)而抑制RANK-RANKL相互作用間接抑制破骨細(xì)胞分化。由此，推斷Wnt蛋白在破骨細(xì)胞不同階段可能都具有調(diào)控功能。

4 Wnt信號(hào)異常對(duì)OP發(fā)生發(fā)展的作用

人體骨骼系統(tǒng)持續(xù)不斷的進(jìn)行著骨吸收與骨重建，這個(gè)動(dòng)態(tài)循環(huán)中，破骨細(xì)胞分化成熟后進(jìn)行骨吸收，成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)形成新生的骨質(zhì)。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞通過(guò)直接的細(xì)胞間接觸或分泌蛋白相互溝通，以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為、存活和分化。成骨細(xì)胞發(fā)生退變或破骨細(xì)胞過(guò)度活躍都會(huì)導(dǎo)致骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)的改變，從而導(dǎo)致OP[20]。Wnt/β-catenin信號(hào)的兩個(gè)抑制劑Dickkopf-1(DKK-1)和SOST在骨穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，其不僅是藥物調(diào)節(jié)的潛在靶標(biāo)，還是可溶性的生物標(biāo)志物。

DKK的研究主要涉及骨代謝和腫瘤等領(lǐng)域。研究最成熟是DKK-1[21]，它是含有2個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的一種分泌性糖蛋白，通過(guò)與Wnt競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LRP5/6受體，來(lái)阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制骨形成。一項(xiàng)國(guó)外大數(shù)據(jù)臨床研究發(fā)現(xiàn)OP患者血清DKK-l顯著高于正常組。Li等[22]發(fā)現(xiàn)用表達(dá)BMP9的腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠卵泡干細(xì)胞后，給予高濃度的DKK-1可以減少BMP9轉(zhuǎn)導(dǎo)的大鼠卵泡干細(xì)胞的成骨分化，而低濃度的DKK-1則促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的骨形成，這是通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路共同作用的。基因研究[23]表明，小鼠DKK-1基因的表達(dá)水平與其本身的的骨量呈負(fù)相關(guān)，DKK-1水平越高，越使骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)被破壞，骨強(qiáng)度減低，骨量減少，提示我們DKK-1檢測(cè)可以用于評(píng)估骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度。新的研究[24]揭示骨質(zhì)疏松也與鐵的過(guò)載有關(guān)，通過(guò)小鼠動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，在正常情況下經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的β-catenin與下游TCF/LEF家族中TCF4/TCF7L2分子結(jié)合促進(jìn)骨形成。在鐵蓄積情況下β-catenin與下游TCF4/TCF7L2分子結(jié)合減少，與FOXO3a結(jié)合增多，因此會(huì)抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，抑制骨形成進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。所以，在臨床上可以使用鐵螯合劑，例如去鐵胺、乳鐵蛋白等改善骨質(zhì)疏松。

硬化蛋白(Sclerostin)是骨骼中的天然激素，一種由骨細(xì)胞合成的抗合成蛋白。在骨骼中起分解代謝作用，并通過(guò)增加破骨細(xì)胞的骨吸收參與骨代謝的調(diào)節(jié)。硬化蛋白水平隨年齡增長(zhǎng)而增加，其可用性增加的結(jié)果可能是Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)的破壞。研究[25]發(fā)現(xiàn)，SOST基因小鼠的皮質(zhì)骨中硬化蛋白的表達(dá)比小梁骨中的表達(dá)更明顯。用抗RANKL抗體治療C57BL/6小鼠后，小梁骨中硬化蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，而小梁骨中β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和骨形成減少，說(shuō)明骨小梁中硬化蛋白的表達(dá)受抑制可以促進(jìn)骨轉(zhuǎn)換。Miyatake等[26]發(fā)現(xiàn)，IL-1β在OA晚期誘導(dǎo)軟骨形成分化，并促進(jìn)終末鈣化。硬化蛋白在晚期可以恢復(fù)IL-1β誘導(dǎo)的β-catenin信號(hào)的上調(diào)，在維持關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。Ohsugi等[27]發(fā)現(xiàn)，激光的生物刺激作用抑制了原代成骨細(xì)胞中SOST的表達(dá)。激光通過(guò)抑制硬化蛋白表達(dá)而不引起炎癥，可能成為骨質(zhì)疏松癥的一種新治療方法。羅莫珠單抗(Romosozumab)是一種人源化單克隆抗體，可特異性地結(jié)合骨硬化蛋白，拮抗其對(duì)骨代謝的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，保證Wnt/β-catenin信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)。

5 小結(jié)與展望

骨質(zhì)疏松癥的藥物按原理不同可分為骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑等[28]。雙膦酸鹽類是傳統(tǒng)的一線用藥，較常見(jiàn)的是阿侖膦酸鈉，用藥后破骨細(xì)胞活性受到抑制，骨形成增加，機(jī)體骨量升高，但也有研究表明其有導(dǎo)致骨折不愈合的風(fēng)險(xiǎn)。甲狀旁腺素(PTH)[29]是目前較新的骨形成促進(jìn)劑，PTH給藥后可提高血清鈣水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTH可通過(guò)β-catenin信號(hào)阻斷糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)對(duì)大鼠BMSC的負(fù)性成骨作用，顯著增加骨量[30]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與安慰劑和替代性骨質(zhì)疏松療法相比，使用Romosozumab后，骨礦物質(zhì)增加，新發(fā)椎體骨折顯著減少[31]。Romosozumab使用后短期就有促進(jìn)骨形成的作用，長(zhǎng)期應(yīng)用還可以減少骨吸收，可能為臨床上治療骨質(zhì)疏松提供新的方向。另外，Denosumab一種新的RANKL中和抗體的出現(xiàn)，表明應(yīng)用Wnt通路靶點(diǎn)的抑制劑和中和抗體在治療OP方面具有嶄新的前景[32]。動(dòng)物研究[33]中，構(gòu)建骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型后，發(fā)現(xiàn)BMSC組大鼠骨密度恢復(fù)快、力學(xué)負(fù)荷明顯改善和骨折線愈合良好，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植也可能治療骨質(zhì)疏松。Li等[34]對(duì)比糖尿病骨質(zhì)疏松癥和對(duì)照組C57BL/6小鼠高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)AGEs可以通過(guò)激活DNA甲基化并抑制β-catenin途徑來(lái)抑制脂肪干細(xì)胞的成骨分化能力，證實(shí)DNA甲基化可以增強(qiáng)骨修復(fù)和促進(jìn)骨再生。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)與骨相關(guān)的生物信息信號(hào)傳遞，還有更多的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的潛在藥物靶標(biāo)尚未被發(fā)現(xiàn)。