張俊濤 岳 辰 倘艷鋒 賈宇東 劉又文

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)洛陽(yáng)研究生培養(yǎng)工作部，河南洛陽(yáng) 471002；2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院 河南省骨科醫(yī)院髖部損傷二科，河南洛陽(yáng) 471002

骨與軟骨損傷作為臨床常見(jiàn)病，大多由創(chuàng)傷、退變、感染、遺傳、腫瘤等因素引起。目前治療骨與軟骨損傷的方法主要是同種自體骨/異體骨移植、骨搬運(yùn)、骨膜移植等，此類方法存在手術(shù)創(chuàng)傷大、治療周期長(zhǎng)、免疫排斥反應(yīng)、失敗率高的特點(diǎn)[1-2]。自1987 年組織工程技術(shù)提出以來(lái)，有學(xué)者開(kāi)始嘗試生物學(xué)與工程學(xué)相結(jié)合的方法來(lái)開(kāi)發(fā)受損組織的替代物。但研究發(fā)現(xiàn)[3]，在組織工程中應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）治療時(shí)，只有2%～12%的細(xì)胞可以到達(dá)目標(biāo)區(qū)域。為了更好地治療骨與軟骨損傷，學(xué)者們提出了一種新的、完全不同的概念—原位組織工程技術(shù)，其通過(guò)性能良好的支架材料和自身微環(huán)境的調(diào)節(jié)，向損傷部位募集自體干細(xì)胞/祖細(xì)胞來(lái)對(duì)骨與軟骨損傷進(jìn)行修復(fù)治療，不再需要傳統(tǒng)組織工程技術(shù)所需的外源性種子細(xì)胞，避免了外源性種子細(xì)胞體外長(zhǎng)時(shí)間繁殖、植入體內(nèi)可能產(chǎn)生的免疫排斥等缺點(diǎn)[4]。原位組織工程技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，將工程學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)緊密結(jié)合，在治療骨與軟骨損傷方面取得了顯著的效果，大大縮短治療時(shí)間、降低治療失敗率，為治療骨與軟骨損傷提供了新的思路和方法[5]。但目前因技術(shù)問(wèn)題、成本問(wèn)題及臨床試驗(yàn)的缺乏等，具體將其應(yīng)用于臨床治療骨與軟骨損傷并觀察其長(zhǎng)期效果還需大量研究。

1 原位組織工程技術(shù)的三要素

1.1 種子細(xì)胞

BMSCs 存在于骨髓中，含量在0.01%以下，因其取材方便、最易募集、具有較強(qiáng)的增殖能力和定向分化能力被最早選為種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程[6-7]。當(dāng)組織受到創(chuàng)傷時(shí)，BMSCs 能夠進(jìn)入外周血，自發(fā)的從器官或骨髓定向遷移至受傷組織參與血管生成、組織修復(fù)過(guò)程，這是一種內(nèi)在的自發(fā)性愈合反應(yīng)[8-10]。

有學(xué)者曾研究通過(guò)募集內(nèi)皮細(xì)胞至創(chuàng)傷部位，使支架材料血管化，但內(nèi)皮細(xì)胞具有存活力差、黏附性差且易老化的缺點(diǎn)[11]。隨后學(xué)者們將目光對(duì)向了內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞—內(nèi)皮祖細(xì)胞，其主要分布在骨髓中，具有良好的分化能力和增殖能力，很多研究者將其作為種子細(xì)胞應(yīng)用于原位組織工程技術(shù)中，在趨化因子的誘導(dǎo)下，募集至創(chuàng)傷部位進(jìn)行分化增殖，修復(fù)創(chuàng)傷組織[12]。

1.2 趨化因子

趨化因子是干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢的有效因子，誘導(dǎo)種子細(xì)胞遷移的同時(shí)促進(jìn)干細(xì)胞增殖分化，并通過(guò)與細(xì)胞表面相應(yīng)抗體特異性結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞黏附，通過(guò)募集種子細(xì)胞歸巢修復(fù)損傷的骨與軟骨，達(dá)到原位組織再生的目的[13]?？刂期吇蜃拥倪f送、延長(zhǎng)其效應(yīng)時(shí)間，在損傷部位增加特異性趨化因子的濃度來(lái)增強(qiáng)內(nèi)源性干細(xì)胞募集以達(dá)到放大原位組織的再生策略是目前研究的一個(gè)方向[13]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體自身具有引導(dǎo)種子細(xì)胞向損傷部位聚集并對(duì)損傷部位進(jìn)行修復(fù)的作用，但低“歸巢”率、低存活率和低分化率嚴(yán)重影響了損傷部位的修復(fù)[14]。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）是目前研究應(yīng)用最多的趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)[7]，SDF-1 在BMSCs 的歸巢、作用時(shí)間以及分化方面都有至關(guān)重要的作用。SDF-1 也被稱為CXCL12，與其受體CXCR4（C-X-C chemokine receptor 4）可以特異性結(jié)合，兩者相互作用后不僅對(duì)BMSCs 具有明顯定向趨化作用，還有效抑制BMSCs 的凋亡，增加其存活率和增殖活性[7,14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]，BMSCs 的歸巢與一定范圍內(nèi)SDF-1 的濃度呈正相關(guān)，濃度100 ng/mL 為分界點(diǎn)，當(dāng)高于這個(gè)點(diǎn)時(shí)，BMSCs 的遷移量逐漸減少，當(dāng)?shù)陀?00 ng/mL 時(shí)，隨著濃度的增加，遷移量逐漸增加。此外，還有許多具有趨化作用的細(xì)胞因子在原位組織工程發(fā)揮其作用，如單核細(xì)胞趨化蛋白1、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胸腺表達(dá)趨化因子等[17]。

1.3 支架材料

支架材料是原位組織工程技術(shù)的關(guān)鍵部分，其作為細(xì)胞的載體在募集種子細(xì)胞的同時(shí)能夠引導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。支架材料良好的生物降解性、無(wú)害代謝產(chǎn)物是組織修復(fù)成功的重要影響因素[18]。另外，支架材料能夠黏附細(xì)胞同時(shí)將細(xì)胞存留在受損部位，防止其隨著血液的流動(dòng)而流失。支架材料的功用大小與其微觀結(jié)構(gòu)和孔隙率有著至關(guān)重要的關(guān)系，支架的微觀結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)是控制細(xì)胞局部遷移的有效工具，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥反應(yīng)，因此對(duì)支架材料的關(guān)注點(diǎn)多在通過(guò)多種技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)支架材料的結(jié)構(gòu)和孔隙率，以期能夠更好地調(diào)節(jié)適應(yīng)細(xì)胞和體內(nèi)微環(huán)境[19]。

目前對(duì)支架材料的關(guān)注點(diǎn)在于：通過(guò)相關(guān)技術(shù)（如納米技術(shù)、低溫技術(shù)、3D 生物打印技術(shù)和基因工程等）將不同的生物材料相結(jié)合來(lái)制備高性能的復(fù)合材料，來(lái)克服以往材料的缺陷，以期能夠更好適應(yīng)體內(nèi)微環(huán)境的同時(shí)，又能夠?qū)p傷部位起到更好的修復(fù)作用[20-21]。

2 原位組織工程技術(shù)在治療骨損傷方面的應(yīng)用

骨缺損一直以來(lái)都是臨床醫(yī)生面對(duì)的一大困難，目前臨床上治療骨缺損的方法主要有骨移植技術(shù)、llizarov 骨搬運(yùn)技術(shù)、Masquelet 誘導(dǎo)膜技術(shù)、鈦網(wǎng)cage技術(shù)、基因治療和組織工程技術(shù)等，這些治療方法雖在一定方面具有成效，但其治療存在局限性（如大面積骨缺損）[22]。隨著原位組織工程技術(shù)的研究不斷深入，將其應(yīng)用于治療骨損傷取得了良好的效果。運(yùn)用原位組織工程技術(shù)修復(fù)骨損傷的關(guān)鍵問(wèn)題在于尋找一種具有良好的機(jī)械性能、最小的炎癥和免疫反應(yīng)、能夠募集種子細(xì)胞遷移至損傷部位并促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的特異性支架。

目前用于治療骨損傷的常用種子細(xì)胞和趨化因子為BMSCs 和SDF-1，BMSCs、SDF-1 聯(lián)合支架材料修復(fù)骨缺損成為了目前研究的熱點(diǎn)[4,23]。研究顯示[24]，將支架材料與趨化因子或種子細(xì)胞相結(jié)合治療骨缺損具有良好效果。Hibi 等[25]將支架材料聯(lián)合BMSCs和富血小板血漿成功修復(fù)牙槽裂骨缺損。Redondo 等[26]應(yīng)用BMSCs 聯(lián)合支架材料修復(fù)上頜囊性骨缺損，并取得良好的治療效果。Niu 等[27]將膠原支架材料與SDF-1 合并植入小鼠體內(nèi)，6 周后觀察骨損傷部位，發(fā)現(xiàn)有毛細(xì)血管和骨質(zhì)生成。因此，將支架材料、趨化因子及種子細(xì)胞相結(jié)合，能對(duì)骨損傷起到良好的修復(fù)作用。

3 原位工程技術(shù)在治療軟骨損傷方面的應(yīng)用

軟骨是特化的致密結(jié)締組織，沒(méi)有血管和神經(jīng)，當(dāng)受到創(chuàng)傷后很難自發(fā)修復(fù)，當(dāng)人軟骨損傷達(dá)到3 mm時(shí)，很難自發(fā)修復(fù)[28]。原位組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨的機(jī)制是：通過(guò)植入可降解多孔支架材料，其能夠模擬體內(nèi)微環(huán)境，在趨化因子的引導(dǎo)下，使種子細(xì)胞歸巢至受損軟骨區(qū)域并定向分化為軟骨細(xì)胞來(lái)達(dá)到修復(fù)作用。Chen 等[29]制備一種具有良好機(jī)械性能的膠原支架材料，該支架材料本身具有誘導(dǎo)BMSCs 在支架中遷移的能力，將其與SDF-1 結(jié)合植入兔軟骨缺損模型中，于術(shù)后6、12 周取出標(biāo)本觀察軟骨修復(fù)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該支架材料能夠促進(jìn)軟骨再生和修復(fù)。

近年來(lái)有學(xué)者將支架材料與細(xì)胞因子相結(jié)合，引導(dǎo)種子細(xì)胞歸巢至受損軟骨進(jìn)行修復(fù)。李祥全等[30]應(yīng)用微骨折聯(lián)合自體BMSCs 外基質(zhì)支架來(lái)修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，制備雙側(cè)雙膝股骨髁、股骨滑車部全層軟骨缺損模型，采用自體對(duì)照；運(yùn)用交聯(lián)、冷凍技術(shù)將收集的基質(zhì)膜制備成三維多孔支架。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：術(shù)后6 個(gè)月，試驗(yàn)組股骨滑車和股骨髁處均見(jiàn)修復(fù)后表面光滑的軟骨，對(duì)照組股骨滑車修復(fù)組織表面較平整，而股骨髁未見(jiàn)明顯修復(fù)。孟慶陽(yáng)等[18]采用豬腹膜脫細(xì)胞基質(zhì)（pig peritoneum-derived acellular matrix，PPAM）支架聯(lián)合微骨折治療軟骨損傷，PPAM 支架具有良好的生物相容性，含有致密層和疏松層等特殊結(jié)構(gòu)，可以有效在黏附細(xì)胞的同時(shí)將細(xì)胞留存于損傷軟骨部位來(lái)修復(fù)軟骨組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PPAM 支架對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有良好的支持作用。綜上可見(jiàn)，原位組織工程技術(shù)治療損傷的軟骨能達(dá)到良好的效果，但選取何種支架材料能達(dá)到更好的治療效果，尚缺乏研究。

4 展望

骨與軟骨損傷在作為臨床常見(jiàn)病，如何有效治療骨與軟骨損傷成為了學(xué)者們一直探索的問(wèn)題。目前對(duì)其治療方法也是多種多樣，但存在治療時(shí)限長(zhǎng)、失敗率高、費(fèi)用較大的缺點(diǎn)。原位組織工程技術(shù)的提出在很大程度上解決了傳統(tǒng)治療手段存在的不足，其通過(guò)支架材料的理化性質(zhì)模擬體內(nèi)微環(huán)境，結(jié)合趨化因子募集大量的種子細(xì)胞歸巢，對(duì)受損部位進(jìn)行有效、及時(shí)的修復(fù)。有大量研究顯示，原位組織工程技術(shù)在治療骨與軟骨損傷方面具有良好的效果，這為以后將其應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。但原位組織工程技術(shù)目前也存在相關(guān)缺陷，臨床應(yīng)用研究尚不深入，還需要進(jìn)行更多的臨床相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)，原位組織工程技術(shù)的相關(guān)機(jī)制還尚需進(jìn)一步證實(shí)。相信在不斷的堅(jiān)持和努力下，該項(xiàng)技術(shù)能更好的應(yīng)用于臨床，使更多患者受益。