黃龍武,李 雷

黃龍武,李雷,湖州市第三人民醫(yī)院內(nèi)鏡中心 浙江省湖州市 313000

0 引言

慢性胃炎是由飲食、環(huán)境及自身免疫等多種致病因素引起的慢性胃黏膜炎性病變,為常見病、多發(fā)病[1].幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種S形、微需氧的革蘭陰性菌,根據(jù)《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》[2]指出其是慢性活動性胃炎的主要致病菌之一,同時2015年京都會議總結(jié)得出H.pylori感染對患者臨床癥狀具有重要影響[3].但是,并非所有患者經(jīng)根除H.pylori后消化不良癥狀(主要指中上腹癥狀,諸如上腹痛、上腹不適)均可得到改善,研究發(fā)現(xiàn)僅有60%的患者對此完全應(yīng)答[4].對于根除H.pylori的治療,鉍劑四聯(lián)方案作為經(jīng)驗性治療的一線方案得到了普及和推廣,但隨著抗生素耐藥率逐年升高,此方案勢必出現(xiàn)療效降低趨勢,再加之部分患者可能因消化不良癥狀而反復(fù)就診,造成資源浪費[5].因此,尋找殺滅H.pylori的新型制劑或改變應(yīng)對策略仍然是值得深入研究的重點.在抗H.pylori治療方案中,阿莫西林一直是抗生素的首選,而質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPI)是所有抗H.pylori感染治療方案中的必用藥物,因此于上世紀(jì)80年代末有學(xué)者首次提出PPI和阿莫西林的二聯(lián)療法,且取得滿意效果[6].艾司奧美拉唑是奧美拉唑的S異構(gòu)體,已獲得臨床路徑及多個指南/共識的一致推薦,在保護(hù)胃黏膜方面具有顯著效應(yīng)[7].近年來,思連康被廣泛應(yīng)用在諸多胃腸疾病的輔助治療中,亦取得了顯著臨床療效.藥理研究顯示[8],思連康中的有益菌可通過腸壁上的磷壁酸黏附并大量繁殖形成“菌膜”結(jié)構(gòu),形成腸菌群生物屏障,減少細(xì)菌和內(nèi)毒素吸收,增強腸黏膜抵抗力.基于上述認(rèn)識,本課題組在結(jié)合前期研究基礎(chǔ)上,我們觀察了思連康聯(lián)合優(yōu)化二聯(lián)療法治療H.pylori相關(guān)性胃炎患者的治療效果及可能機制,以期判斷其應(yīng)用價值,為臨床提供一線資料.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2018-11/2019-12于我院接受治療的H.pylori相關(guān)性胃炎患者64例臨床資料,所有受試者均符合2015年日本京都會議有關(guān)H.pylori相關(guān)性胃炎共識的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3].納入標(biāo)準(zhǔn):(1)胃鏡檢查提示胃炎,可伴糜爛、萎縮、腸化、異型增生;(2)就診前4 wk內(nèi)未服用過、抗生素、糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥;(3)具有上腹不適癥狀(疼痛或飽脹不適),持續(xù)時間為1 mo以上;(4)快速尿素酶試驗或14C-尿素呼氣試驗提示H.pylori陽性;(5)患者及其家屬同意且簽署知情同意書.

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)胃鏡檢查提示消化性潰瘍、腫瘤等;(2)具有重疊綜合征者,如合并腸易激綜合征或胃食管反流病等;(3)具有心、肝、腎等器質(zhì)性疾病;(4)過敏體質(zhì)或?qū)Ρ狙芯吭囼炈幬锝M成成分過敏者;(5)具有精神疾病,不能決定自己意愿者.按照隨機數(shù)字表法將納入對象分為治療組(32例)與對照組(32例),基線資料分布如下:治療組男18例,女14例;年齡23-70歲,平均年齡46.40歲±5.23歲;病程11.79 mo-8.38年,平均病程3.17年±0.49年;對照組男17例,女15例;年齡24-72歲,平均年齡46.58歲±5.31歲;病程9.28 mo-11.37年,平均病程3.29年±0.60年.兩組研究對象基線資料組間無顯著性差異,具有可比性.本研究由湖州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批件號:2020-076).

1.2 方法 所有受試者均予以共識首推的療法,即為艾司奧美拉唑鈉腸溶片(重慶萊美藥業(yè)股份有限公司;國藥準(zhǔn)字:H20 130095;規(guī)格:20 mg/片)20 mg,bid,早、晚餐前30 min服用;阿莫西林膠囊(白云山東泰商丘藥業(yè)有限公司;國藥準(zhǔn)字:H20 003350;規(guī)格:0.25 g/粒)1000 mg,bid,早、晚餐前30 min服用.療程為14 d.

在此基礎(chǔ)上,治療組給予雙歧桿菌四聯(lián)活菌片(杭州遠(yuǎn)大生物制藥有限公司;國藥準(zhǔn)字:S20 060010;規(guī)格:0.5 g/片)1500 mg,3次/d,雙歧桿菌四聯(lián)活菌片與抗生素服藥時間間隔2-3 h.療程為14 d.

于治療前后,胃鏡下取胃黏膜進(jìn)行病理活檢及免疫組化,以檢測IL-1β、IL-8、TNF-α,同時采用熒光定量PCR法檢測NF-κB P50、P65 mRNA,并用BCA法進(jìn)行NF-κB P50、P65蛋白定量.

1.3 觀察指標(biāo) 分別于治療前后胃鏡下取胃黏膜組織經(jīng)碾磨、裂解、超聲后離心取上清,采用實時定量熒光PCR法檢測NF-κB P50、P65 mRNA表達(dá),即應(yīng)用Trizol提取上清中的總RNA,在CFX96實時熒光定量PCR儀(美國伯樂BIO-RAD公司產(chǎn)品)上,并參照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.為消除加樣誤差,每個標(biāo)本設(shè)3個重復(fù)管,以β-actin為內(nèi)對照,并用同一樣品的cDNA和同樣的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴增,計算所有標(biāo)本NF-κB P50、P65 mRNA及β-actin 3個重復(fù)孔的平均Ct值.以Primer軟件設(shè)計引物,目的基因mRNA相對表達(dá)水平為2-△△Ct.△△Ct目的基因=每個標(biāo)本的目的基因Ct值-此標(biāo)本的內(nèi)參基因Ct值,引物序列見表1.

于治療前后,同上述方法制備上清,用BCA試劑盒(英國Abcam公司產(chǎn)品)測定蛋白濃度,SDA-PAGE垂直電泳分離,上樣量為30 μg/孔,轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜,10%脫脂奶粉(TTBS配制)的封閉液中,4 ℃封閉過夜.分別加入抗體稀釋液為5%脫脂奶粉的NF-κB P50、P65單克隆抗體(英國Abcam公司產(chǎn)品)孵育,室溫孵育4 h,用TTBS洗滌,然后加入1:3000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔的二抗室溫孵育1 h,用TTBS洗滌.顯色,使用Gel-protein軟件對條帶進(jìn)行半定量分析,測出各條帶IOD值.

表1 Real time-PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

于治療前后收集外周血2 mL后低速離心后留取清液,使用酶聯(lián)免疫吸附法對血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平進(jìn)行測量.

由專職醫(yī)師操作,采用上海維世康醫(yī)用電子有限公司生產(chǎn)的ESE-360型胃鏡,分別于治療前和治療結(jié)束后1 mo,觀察所有受試者胃黏膜充血、水腫、糜爛、出血點情況.

根據(jù)胃鏡檢查結(jié)果及14C呼氣試驗結(jié)果進(jìn)行療效判定[9],具體分為:以14C呼氣試驗轉(zhuǎn)陰,胃鏡下示黏膜恢復(fù)正常者為治愈;以14C呼氣試驗轉(zhuǎn)陰,胃鏡下病變黏膜范圍較前減少2/3者為顯效;以14C呼氣試驗陽性,胃鏡下病變黏膜范圍較前減少1/2者為有效;以,14C呼氣試驗陽性,胃鏡下病變黏膜范圍未較前緩解1/2者為無效.治愈、顯效、有效三者合計為有效,據(jù)此計算有效率.

記錄兩組患者治療期間所出現(xiàn)的藥物相關(guān)不良反應(yīng),并于治療結(jié)束后1 mo采用YH04AS型H.pylori檢測儀(購自安徽養(yǎng)和醫(yī)療器械設(shè)備有限公司)進(jìn)行14C尿素呼氣實驗,以評估H.pylori根除情況,根除率=H.pylori轉(zhuǎn)陰例數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%.

統(tǒng)計學(xué)處理利用SPSS 20.0軟件分析,計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)性分布,在文字?jǐn)⑹鰰r平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示為mean±SD.進(jìn)行兩兩比較時采用Dunnet-t檢驗,組間各指標(biāo)比較采用單因素方差分析.計數(shù)資料采用率(%)表示,應(yīng)用χ2檢驗分析,P<0.05提示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 兩組NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白表達(dá)比較 治療前兩組NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(1.95±0.46vs1.98±0.49,1.70±0.40vs1.66±0.38,3.28±0.70vs3.35±0.68,2.96±0.64vs3.03±0.59);治療后,兩組NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白均呈下降趨勢,同時治療組較對照組更低(1.42±0.33vs1.10±0.24,1.27±0.26vs0.87±0.17,2.51±0.52vs1.94±0.28,2.33±0.37vs1.77±0.23)(P<0.01),見圖1.

2.2 兩組炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較 治療前,兩組IL-1β、IL-8、TNF-α比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(19.29±4.40vs19.71±4.18,356.41±39.61vs354.52±39.70,30.62±4.40vs29.88±4.49);治療后,兩組IL-1β、IL-8、TNF-α均呈下降趨勢,同時治療組較對照組更低(11.50±3.40vs7.30±2.16,237.70±27.72vs193.68±19.88,19.30±3.41vs10.87±2.18)(P<0.01),見圖2.

2.3 兩組胃鏡下黏膜情況比較 治療組胃黏膜充血、水腫、糜爛和出血點好轉(zhuǎn)例數(shù)均明顯多于對照組,組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3.

2.4 兩組臨床療效比較 治療組治愈、顯效、有效、無效分別為8例、10例、13例、1例,其治療總有效率為96.88%,而對照組分別為4例、9例、12例、7例,治療總有效率為78.13%,治療組顯著高于對照組(χ2=5.14,P=0.02),見圖4.

2.5 兩組H.pylori根除率比較 治療組H.pylori根除率高于對照組(93.75%vs75.00%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.27,P=0.04).

2.6 兩組不良反應(yīng)比較 64受試者全部完成試驗,且所有患者未曾出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng).

3 討論

第五次全國幽門螺桿菌感染共識亦提出將H.pylori相關(guān)性胃炎作為一種獨立的疾病,建議H.pylori感染者即便無消化不良癥狀亦應(yīng)根除H.pylori[10].目前臨床中多采用含鉍劑的四聯(lián)殺菌方法,其在中國的根除率可達(dá)85%-94%[11].但這種方案臨床療效仍不盡如人意,鉍劑、四環(huán)素、呋喃唑酮等藥物在某些地區(qū)不可獲得,且四聯(lián)療法中需口服兩種廣譜抗生素,在推薦用于根除治療的6種抗菌藥物中,部分患者存在不同程度的雙重、三重、甚至四重耐藥,再加之我國H.pylori感染人口基數(shù)量大,H.pylori菌株的變異及抗生素濫用等因素的影響,傳統(tǒng)治療H.pylori方法受到挑戰(zhàn)[12].因此,尋求安全、高效的抗H.pylori方案已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點.

圖1 兩組NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白表達(dá)比較.A:兩組NF-κB P50 mRNA水平的比較;B:兩組NF-κB P50蛋白水平的比較;C:兩組NF-κB P65 mRNA水平的比較;D:兩組NF-κB P65蛋白水平的比較.NF-κB P50:核因子κB P50;NF-κB P65:核因子κB P65.

圖2 兩組炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較.A:兩組IL-1β水平的比較;B:兩組IL-8水平的比較;C:兩組TNF-α水平的比較.IL-1β:白細(xì)胞介素-1β;IL-8:白細(xì)胞介素-8;TNF-α:腫瘤壞死因子-α.

在既往研究報道中,二聯(lián)療法的臨床價值可能被低估,現(xiàn)階段除了美國胃腸病學(xué)院(ACG)2017年臨床指南[13]中提到二聯(lián)療法可以用于首次標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法根除H.pylori失敗的補救治療,其他共識如中國H.pylori共識[14]、多倫多共識[15],均未提及二聯(lián)療法.韋麗秋等[16]進(jìn)行一項單中心、開放、隨機對照的非劣效性研究,發(fā)現(xiàn)基于藥理學(xué)和藥物遺傳學(xué)的優(yōu)化的PPI-阿莫西林二聯(lián)療法不僅與含鉍劑的四聯(lián)殺菌方法療效相當(dāng),依從性好,安全性好且不良反應(yīng)更少.近年來益生菌在輔助抗H.pylori治療中的作用也日益受到臨床關(guān)注,其中思連康是一種對宿主有益的口服四聯(lián)活菌制劑,制劑中的雙歧桿菌、乳酸菌等能與腸黏膜上皮表面特異性受體結(jié)合,拮抗致病菌的生長,恢復(fù)胃內(nèi)微生物生態(tài)平衡,有利于有害菌、毒素等物質(zhì)排出體外[17].目前有關(guān)思連康聯(lián)合優(yōu)化二聯(lián)療法治療H.pylori相關(guān)性胃炎的相關(guān)研究臨床涉及較少,為了給后續(xù)同類患者的診療奠定實踐基礎(chǔ),本文在下文中進(jìn)一步從治療效果及可能作用機制展開論述.

圖3 兩組胃鏡下黏膜情況比較.不同字母間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05.

圖4 兩組臨床療效比較.不同字母間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05.

本課題組經(jīng)過臨床觀察發(fā)現(xiàn):治療組較對照組在H.pylori改善根除率及胃鏡下黏膜情況等方面均具有優(yōu)勢,且前者在整體治療效果方面更具有優(yōu)勢,筆者分析原因可能是思連康能夠通過免疫調(diào)節(jié)及信號通路調(diào)節(jié)等多條途徑改善H.pylori相關(guān)性胃炎,但仍需進(jìn)一步擴大樣本量進(jìn)行驗證.近年來諸多研究學(xué)者從不同角度分析了H.pylori相關(guān)性胃炎的發(fā)病機制,多數(shù)認(rèn)為NF-κB信號通路的激活在該病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[18,19].魏茜等[20]就對H.pylori感染后NF-κB具體活化及調(diào)控機制進(jìn)行了闡明,其結(jié)果顯示H.pylori感染相關(guān)胃粘膜癌變早期NF-κB信號通路異?；罨?可能參與了胃黏膜癌變過程.陳新怡等[21]的研究亦表明,NF-κB信號通路與藥物治療H.pylori相關(guān)性消化疾病密切相關(guān).據(jù)相關(guān)研究表明[22],NF-κB介導(dǎo)的信號通路是應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞,不僅可維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,又可介導(dǎo)病原特異性應(yīng)答,其家族成員包括c-Rel、RelB、P65、P50、P52.正常生理條件下,NF-κB在細(xì)胞漿中以P50/P65二聚體形式存在,這一異源二聚體亦是其發(fā)揮生物學(xué)功能的主要形式,可與其抑制蛋白IκB結(jié)合,滯留于細(xì)胞漿中且無轉(zhuǎn)錄活性[23].當(dāng)病毒或細(xì)菌等外界刺激因素作用于細(xì)胞后,局部組織內(nèi)炎癥介質(zhì)含量增多,可導(dǎo)致NF-κB的激活,而源于炎癥反應(yīng)激活的NF-κB可使得炎癥持續(xù)和放大,從而引起H.pylori胃炎,同時二者又可反饋激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物IKKs,后者可磷酸化IκB氨基末端的2個絲氨酸殘基(Ser32、Ser36),IκB蛋白從三聚體解離下來,使P50及P65暴露,繼而NF-κB被釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與目的基因結(jié)合,啟動TNF-α、IL-8、IL-1β、Bcl-2等靶基因轉(zhuǎn)錄[24].Feige等[25]通過H.pylori感染胃上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)NF-κB下游炎癥相關(guān)因子如TNF-α、IL-8、IL-1β水平隨病情進(jìn)展不斷升高,形成“瀑布樣效應(yīng)”,加重胃黏膜組織損傷,進(jìn)一步表明NF-κB信號通路參與H.pylori感染過程.本研究通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),思連康聯(lián)合優(yōu)化二聯(lián)療法能夠顯著抑制NF-κB信號通路的活化且下調(diào)其下游炎癥因子的表達(dá),這可能也是該方案改善H.pylori相關(guān)性胃炎患者臨床癥狀的重要因素之一.分析原因可能為思連康可使益生菌在腸道內(nèi)定植、生長及繁殖,以維持腸道正常結(jié)構(gòu)及生理功能,進(jìn)一步增加巨噬細(xì)胞的活性、殺傷性細(xì)胞及T細(xì)胞的數(shù)量,從而顯著改善機體免疫機制失衡以及促炎因子/抗炎因子失衡.

4 結(jié)論

綜上所述,思連康聯(lián)合優(yōu)化二聯(lián)療法治療可顯著緩解H.pylori相關(guān)性胃炎癥狀,療效顯著,其機制可能與抑制NF-κB炎癥信號通路的活化及炎性因子釋放有關(guān).但是,本研究也有一定的局限性,如醫(yī)院條件有限使得樣本量不夠充足,未對觀察指標(biāo)進(jìn)行動態(tài)觀察,這些都可能是結(jié)果的潛在影響因素,因此,我們下一步的工作方向是大力提升實驗室檢測能力,擴大樣本量行分層分析,以期對本文實驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的論證與支持.

文章亮點

實驗背景

當(dāng)前,幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染的治療,面臨著耐藥率高、根除率低的困境,14 d的鉍劑四聯(lián)療法作為經(jīng)驗治療的首選方案,仍存在藥物相關(guān)的副作用較多、方案較復(fù)雜、服藥依從性差、藥物成本較高等局限性,因此探索一種根除率高、副作用較小、依從性較好的治療H.pylori相關(guān)性胃炎的方案成為臨床急需解決的問題.

實驗動機

本研究為臨床治療H.pylori相關(guān)性胃炎提供一種新的方案,即在質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPI)和阿莫西林的二聯(lián)療法基礎(chǔ)上,加用益生菌進(jìn)行治療,同時研究結(jié)果也為臨床探討這一方案的治療效果以及其可能作用機制提供了重要數(shù)據(jù)參考.

實驗?zāi)繕?biāo)

探究思連康聯(lián)合優(yōu)化二聯(lián)療法治療H.pylori相關(guān)性胃炎的治療效果及對NF-κB炎癥信號通路的影響.

實驗方法

前瞻性的選取符合入選標(biāo)準(zhǔn)H.pylori相關(guān)性胃炎患者,并采用隨機數(shù)字表法分為兩組,比較兩組臨床療效、胃黏膜改變情況、H.pylori根除率及藥物相關(guān)不良反應(yīng)情況,同時測定兩組治療前后的IL-1β、IL-8、TNF-α以及NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白水平.

實驗結(jié)果

思連康聯(lián)合優(yōu)化二聯(lián)療法治療可顯著緩解H.pylori相關(guān)性胃炎癥狀,療效顯著,其機制可能與抑制NF-κB炎癥信號通路的活化及炎性因子釋放有關(guān).

實驗結(jié)論

結(jié)合前人經(jīng)驗,艾司奧美拉唑+阿莫西林可作為根除H.pylori的經(jīng)驗性治療的一線方案,本研究提出在此優(yōu)化二聯(lián)療法基礎(chǔ)上加用思連康治療H.pylori相關(guān)性胃炎,不僅證實了此方案治療效果確切高效,且分析了其可能作用機制,治療H.pylori相關(guān)性胃炎提供了新的策略,部分解決了目前一線治療方案的不足,盡可能避免了繼發(fā)性耐藥.

展望前景

我們下一步的工作方向可能分為幾個方面:(1)確定二聯(lián)療法聯(lián)合益生菌中每種藥物的最佳劑量、給藥頻率以及療程,以達(dá)到最大療效,制定最優(yōu)方案;(2)優(yōu)化二聯(lián)療法中PPI的選擇,可以根據(jù)患者的CYP2C19基因或其他基因的不同基因型,而個體化定制;(3)可以使用新型制酸劑沃諾拉贊,在二聯(lián)療法中替代傳統(tǒng)PPI用于治療H.pylori;(4)進(jìn)行多中心研究,擴大樣本量,減少偏倚.