李愛云,吳玉秀,郜娜,張建光,武警特色醫(yī)學(xué)中心檢驗科 天津市300162

孟薇,天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院檢驗科 天津市 300300

0 引言

在全球范圍內(nèi),胃癌(gastric cancer,GC)在男性是第3大常見惡性腫瘤,發(fā)病率僅次于肺癌、結(jié)直腸癌占所有腫瘤患者病例數(shù)的7%和死亡人數(shù)的9%[1].2018年,GC新發(fā)103萬人,造成78.3萬人死亡.20世紀(jì)30年代以前,在世界大部分地區(qū),包括大多數(shù)西方發(fā)達國家,GC是最常見的死亡原因[2].然而,近1個世紀(jì)以來,世界上許多地區(qū)的GC發(fā)病率和死亡率都在下降.其原因可能與食品保鮮方法的改進以及食用較少的腌制食品有關(guān).然而目前,GC在東亞尤其是我國和日本等國家仍為常見的惡性腫瘤[3-5].

GC整體預(yù)后較差,晚期患者5年生存率低.大部分患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)展遠處轉(zhuǎn)移的晚期或局部晚期,喪失了手術(shù)機會[6].然而,GC發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機制仍不完全明晰.近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步及大數(shù)據(jù)分析的不斷發(fā)展,GC研究尤其是相關(guān)信號通路在其表型中的相關(guān)性取得了長足的進步.

CMTM為趨化素樣因子家族(CKLFS),是一個新基因家族[7].CMTM3是趨化素樣因子家族主要成員,在多種人體惡性腫瘤中呈現(xiàn)差異表達,并與細胞的惡性表型有關(guān).但其上游靶基因及其相關(guān)分子調(diào)控機制并不十分清楚.在本研究中,我們采用生物信息分析結(jié)合細胞實驗方法探討CMTM3基因在GC中的表達、生物學(xué)功能及其潛在的分子調(diào)控機制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和組織標(biāo)本:正常胃上皮細胞(GES-1)和多個GC細胞系(HGC-27,BGC-823和MKN45)購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心.選取我院手術(shù)治療的15例GC患者,術(shù)中留取患者癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本后立即置入液氮中迅速冷凍,然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存.組織標(biāo)本獲取經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會及家屬知情同意.

1.1.2 儀器與設(shè)備:臺式低速離心機(B160A型);熒光定量PCR儀7500HT;超低溫冰箱;無菌操作臺 Steril CARD Ⅲ Advance;臺式微型離心機(Mierofuge18).

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析:在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[8,9]和TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)[10]數(shù)據(jù)庫中分析CMTM3基因的差異表達情況.CMTM3差異表達選取GEO數(shù)據(jù)庫中2個芯片數(shù)據(jù)集GSE93415和GSE99415,差異篩選條件為表達CMTM3表達上調(diào)或下調(diào)2倍及以上(Log2FC>1),同時P<0.05.采用microRNA靶基因在線預(yù)測軟件Targetscan (http://www.targetscan.org/vert_72/)[11],預(yù)測CMTM3上游靶基因.

1.2.2 實時熒光定量PCR:根據(jù)說明書使用Trizol試劑(Invitrogen)從細胞中提取總RNA.分別用PrimeScriPt RT試劑盒和SYBR Prime-ScriPt-RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)和qRT-PCR.miR125b-5P和CMTM3使GAPDH作為內(nèi)參照物.結(jié)果采用2-△△Ct法進行計算.CMTM3引物序列為:F:5’-TCTTGCGTGTGAATCTCTTACC-3’;R:5’-CAGGATCCACATTGGTGTTACC-3’.

1.2.3 MTT實驗:培養(yǎng)分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后,棄去各孔培養(yǎng)基,PBS清洗3次,加入200 μL新鮮完全培養(yǎng)基,并加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,4 h后棄去上清,每孔加入150 μL DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解后,在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值,上機時設(shè)置調(diào)零孔.以時間梯度為橫坐標(biāo)(X軸),吸光值為縱坐標(biāo)(Y軸)繪制曲線圖.

1.2.4 劃痕實驗:取對數(shù)生長期的細胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞,取六孔板,將事先處理好的細胞以50%的細胞密度均勻鋪與六孔板內(nèi),置于37 ℃5%CO2孵箱中培養(yǎng).24 h后將小干擾至細胞,并置于37 ℃5%CO2孵箱中培養(yǎng).細胞轉(zhuǎn)染24 h后,采用1000 μL槍頭在貼壁細胞做垂直的劃痕,然后棄掉培養(yǎng)基并用1×PBS清洗2遍后加入培養(yǎng)基后置于37 ℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng).分別在上述細胞劃痕后0、24、48 h后采用倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況,并隨機記錄3個視野下的細胞遷移距離.

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗:培養(yǎng)GC MKN45細胞,將構(gòu)建的miR-125b-5P mimics與PmiR-GLO-CMTM3-3’UTR共轉(zhuǎn)染至MKN45細胞中,CMTM3基因的3’UTR區(qū)克隆至載體腎熒光素酶基因下游位點.構(gòu)建結(jié)合miR-125b-5P mimics與對照的野生型(WT)報告質(zhì)粒及突變型(MUT)報告質(zhì)粒.采用LiPofectamine 3000試劑盒說明,轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的質(zhì)粒至MKN45細胞.轉(zhuǎn)染48 h后,通過雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)進行檢測.

圖1 CMTM3基因在多種腫瘤及胃癌中的表達及其與患者預(yù)后關(guān)系.A:CMTM3在人體多種實體腫瘤中的表達情況(數(shù)據(jù)來源TCGA數(shù)據(jù)庫);B:CMTM3在胃癌患者癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織,數(shù)據(jù)來源TCGA數(shù)據(jù)庫.T:癌組織.N:癌旁正常組織;C:隨著胃癌分期的增高,CMTM3表達水平增高;D:CMTM3高表達患者總生存降低;E:CMTM3高表達患者無疾病進展生存降低;F:免疫組化顯示胃癌組織中CMTM3高表達;G:正常胃組織中CMTM3低表達.

統(tǒng)計學(xué)處理相關(guān)統(tǒng)計分析采用R軟件完成,計量資料用mean±SD表示,組間比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用相對數(shù)表示,行χ2檢驗,雙側(cè)P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

圖2 下調(diào)CMTM3表達后胃癌細胞的遷移和增殖能力減低.A:不同胃癌細胞系中CMTM3表達水平比較;B:針對CMTM3基因序列,合成3個針對CMTM3的小干擾RNA,轉(zhuǎn)染細胞后判斷其下調(diào)CMTM3基因mRNA表達情況;C:sh-CMTM3-1下調(diào)MKN45細胞系中CMTM3表達后,細胞遷移能力減低;D:sh-CMTM3-1下調(diào)MKN45細胞系中CMTM3表達后,細胞增殖能力減低.

2.1 CMTM3基因表達 TCGA數(shù)據(jù)庫中,CMTM3基因mRNA在多種腫瘤及GC中的表達明顯上調(diào)(圖1A);在GC患者,癌組織中的CMTM3基因mRNA表達水平明顯高于癌旁正常胃組織(圖1B).同時,隨著GC患者分期的升高,CMTM3基因表達水平也增加(圖1C).預(yù)后分析數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫,高低表達組患者各192例,隨訪時間130 mo,根據(jù)CMTM3基因mRNA表達水平分為高和低表達組(CMTM3表達水平≥中位數(shù)為高表達,反之為低表達),CMTM3基因高表達GC患者OS和DFS均低于低表達患者(圖1D,E).免疫組化顯示,CMTM3基因編碼蛋白主要表達于細胞漿和細胞膜,在癌組織中高表達而在正常胃組織中低表達(圖1F,G)

2.2CMTM3基因生物學(xué)功能CMTM3基因mRNA在不同GC細胞系中的表達水平明顯高于正常胃上皮細胞(GES-1),且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),MKN45GC細胞中CMTM3基因標(biāo)的水平最高,圖2A.外源性小干擾RNA(sh-CMTM3-1)可顯著下調(diào)MKN45GC細胞中CMTM3基因表達(P<0.05),圖2B.sh-CMTM3-1下調(diào)MKN45GC細胞中CMTM3基因表達后,細胞的遷移能力明顯減低(P<0.05),圖2C.MTT實驗顯示,sh-CMTM3-1下調(diào)CMTM3表達后,MKN45GC細胞增殖能力明顯下降(P<0.05),圖2D.

2.3 CMTM3上游靶基因預(yù)測 GEO數(shù)據(jù)庫中下載GCvs正常胃黏膜差異表達芯片GSE93415和GSE99415,篩選出差異表達micro12個(圖3A,B).同時采用miRNA靶基因下線預(yù)測軟件,篩選出與上述12個差異表達基因重合的microRNA 3個,分別為miR-375,miR-125b-5P和miR-135b-5P(圖3C,D).其中miR-125b-5P下調(diào)CMTM3基因在GC細胞中的表達最為明顯(P<0.05)(圖3E).

2.4 miR-125b-5P和CMTM3表達相關(guān)性 miR-125b-5P在正常胃粘膜細胞系中表達水平明顯高于GC細胞系(P<0.05),圖4A.GC患者癌組織中miR-125b-5P表達水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05),圖4B.CMTM3基因在GC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05),圖4C.GC組織中CMTM3與miR-125b-5P表達呈負相關(guān)(rPearson=-0.58,P<0.05).MKN45細胞中,miR-125b-5P可顯著下調(diào)CMTM3基因表達(P<0.05),圖4E.熒光素報告酶實驗顯示miR-125b-5P基因與CMTM3基因3’UTR靶向結(jié)合,圖4F.

2.5 miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達抑制GC細胞增殖和遷移 在GCMKN45細胞中,miR-125b-5P可顯著下調(diào)CMTM3表達(P<0.05),圖5A.MTT實驗,下調(diào)CMTM3表達后GCMKN45細胞增殖能力明顯減低(P<0.05),圖5B.劃痕實驗顯示,miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達后GCMKN45細胞遷移能力也明顯下降(P<0.05),圖5C.

3 討論

圖3 CMTM3上游靶基因預(yù)測.A:GSE93415胃癌差異表達microRNA火山圖;B:GSE99415胃癌差異表達microRNA火山圖;C:GSE93415、GSE99415數(shù)據(jù)集和Targetscan預(yù)測CMTM3上游靶基因的Venn圖;D:篩選出的3個共差異表達micrRNA,分別為miR-375,miR-125b-5P和miR-135b-5P;E:miR-125b-5P下調(diào)CMTM3基因在胃癌細胞中的表達最為顯著.

GC是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,也是癌癥相關(guān)死亡的重要原因,在所有癌癥死亡原因中排第三位置[12].盡管患者接受了外科手術(shù)或放化療,GC患者的預(yù)后仍不理想,晚期患者遠期生存率極低.晚期GC患者化療及放療效果十分有限,大多數(shù)患者僅能從放化療中獲益很少,其主要原因為其腫瘤細胞增殖、侵襲的分子機制未能完全明晰[4,13,14].因此,這里迫切需要更好地了解GC發(fā)生發(fā)展及增殖等生物學(xué)功能的分子機制及其相關(guān)信號通路.

CMTM3是趨化素樣因子家族主要成員,在多種人體惡性腫瘤中呈現(xiàn)差異表達,并與細胞的惡性表型有關(guān)[15,16].已有研究顯示CMTM家族蛋白在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[17,18].依據(jù)既往文獻報道,CMTM不同家族成員在不同的腫瘤中的生物學(xué)功能并不完全相同,甚至在不同的腫瘤中呈現(xiàn)出相反的生物學(xué)功能[19].有文獻報道,CMTM3在前列腺癌中表達水平較低,進一步下調(diào)細胞CMTM3表達水平后,其增長和侵襲能力增強,提示CMTM3在前列腺癌中可能發(fā)揮了抑癌基因的作用[20].然而在本研究中,我們通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),CMTM3基因mRNA在大多數(shù)人體腫瘤組織中表達水平是上調(diào)的,提示其在人實體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用.我們設(shè)計并合成了針對CMTM3的外源性小干擾RNA,轉(zhuǎn)讓GC細胞MKN45后,細胞的增殖和遷移能力減低,提示CMTM3在GC的增殖和遷移生物學(xué)功能方面具有重要作用.進一步我們對相關(guān)GC差異表達micorRNA基因芯片數(shù)據(jù)進行了分析,并結(jié)合microRNA靶基因在線預(yù)測軟件證實了miR-125b-5P為CMTM3上游重要的靶基因,并能夠下調(diào)CMTM3在GC細胞中的表達,并抑制細胞的增殖和遷移能力.

圖4 胃癌細胞系及胃癌組織、正常胃組織中CMTM3、miR-125b-5P相對表達水平及相關(guān)性.A:miR-125b-5P在各胃癌細胞系中的表達;B:miR-125b-5P在胃癌和正常胃組織中的表達;C:CMTM3胃癌和正常胃組織中的表達;D:miR-125b-5P和CMTM3在胃癌組織中表達呈負相關(guān);E:miR-125b-5P可顯著下調(diào)MKN45胃癌細胞中CMTM3表達水平;F:熒光素報告酶實驗顯示miR-125b-5P基因與CMTM3基因3’UTR靶向結(jié)合.

圖5 miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達抑制胃癌細胞增殖和遷移.A:miR-125b-5P可顯著下調(diào)MKN45細胞中CMTM3表達;B:MTT實驗下調(diào)CMTM3表達后胃癌MKN45細胞增殖能力明顯減低;C:劃痕實驗顯示miR-125b-5P下調(diào)CMTM3表達后胃癌MKN45細胞遷移能力明顯下降.

CMTM3基因在GC組織及GC細胞株中高表達,并與GC患者的預(yù)后有關(guān).時miR-125b-5P可靶向抑制CMTM3的表達,并影響MKN45 GC細胞的增殖和遷移.miR-125b-5P和CMTM3相關(guān)信號通路望成為GC預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點.然而,CMTM3在不同腫瘤中的高低表達有差異,其大多數(shù)情況下作為抑癌基因發(fā)揮作用并在腫瘤組織中低表達.但CMTM3在不同腫瘤中也呈現(xiàn)高表達,可能作為癌基因發(fā)揮.因此,其確切分子機制并不完全清楚,在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用.我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù),顯示期在GC中均為高表達.但由于CMTM3不同腫瘤組織中的表達水平存在差異,該基因在其他腫瘤中的作用及生物學(xué)功能有待進一步研究.

4 結(jié)論

miR-125b-5P靶向調(diào)控CMTM3基因表達影響GC增殖和遷移能力,并有望成為GC預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點.

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer,GC)是臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,然而其發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機制仍不完全明晰.CMTM3是趨化素樣因子家族主要成員,在多種人體惡性腫瘤中呈現(xiàn)差異表達,并與細胞的惡性表型有關(guān).但其上游靶基因及其相關(guān)分子調(diào)控機制并不十分清楚.

實驗動機

本研究目的在于采用生物信息分析結(jié)合細胞實驗方法探討CMTM3基因在GC中的表達、生物學(xué)功能及其潛在的分子調(diào)控機制,為后續(xù)靶向藥物的研發(fā)提供新的潛在靶點.

實驗?zāi)繕?biāo)

探尋CMTM3基因在GC細胞系及組織中的表達、及其對GC細胞增殖、遷移和穿膜能力的影響,同時探討其潛在的分子調(diào)控機制.

實驗方法

生物信息法分析CMTM3基因的差異表達情況,并比較CMTM3基因在上皮細胞和多個GC細胞系中表達情況.在GC細胞中轉(zhuǎn)染外源性小干擾下調(diào)細胞中CMTM3基因表達后評價細胞增殖和遷移能力.預(yù)測CMTM3上游靶基因,雙熒光素酶報告實驗驗證miR-125b-5P與CMTM3靶向調(diào)控關(guān)系.轉(zhuǎn)染外源性miR-125b-5P-mimic,評價GC細胞增殖和遷移能力的變化.

實驗結(jié)果

GC組織中的CMTM3基因mRNA表達水平明顯高于癌旁正常胃組織(P<0.05),并于預(yù)后有關(guān).miR-125b-5p可顯著下調(diào)GC細胞CMTM3表達,并影響細胞的增殖和遷移能力(P<0.05).

實驗結(jié)論

miR-125b-5p靶向調(diào)控CMTM3基因表達影響GC增殖和遷移能力,并有望成為GC預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點.

展望前景

miR-125b-5p靶向抑制CMTM3基因的表達,并影響GC患者的預(yù)后,有望成為GC靶向藥物開發(fā)的新靶點及信號通路.