宋小雙，遇文婧，閔 凱，周 琦，鄧 勛，劉艷紅，姜瑞鳳

（1黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱150040；2黑龍江省森林草原火災(zāi)及病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040；3大慶油田礦區(qū)服務(wù)事業(yè)部，黑龍江大慶163000）

0 引言

深色有隔內(nèi)生真菌(Dark Septate Endophytes,DSE)是植物根部重要的內(nèi)生菌類群，具有典型特征，菌絲顏色較深，可形成菌核，與宿主植物互作形成共生體，而不引起植物病變[1-2]。深色有隔內(nèi)生真菌可與幾百種植物形成共生結(jié)構(gòu)[3]，在針葉樹中，主要的深色有隔內(nèi)生真菌種類是子囊菌(Ascomycetes)中的Phialocephala fortiniis.l.—Acephala applanataspecies complex(PAC)類群集合，在針葉樹的根系中占據(jù)主導(dǎo)地位[4-5]。DSE具有多種促生特性，包括提高植物對(duì)土壤養(yǎng)分氮、磷的利用效率[6-8]，DSE對(duì)重金屬[9-11]、干旱[12-13]具有較強(qiáng)的耐受性，定殖植物根部后，可提高宿主的耐受性，部分菌株具有生防價(jià)值，可有效控制土傳病害的發(fā)生[14-15]。

樟子松(Pinus sylvestrisvar.mongolica)是三北地區(qū)主要造林樹種，具有生長快、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，在生態(tài)修復(fù)、城市園林綠化等方面發(fā)揮了重要的作用[16-17]。立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKühn)可引起針葉苗木立枯病，長期過量的化學(xué)農(nóng)藥使用導(dǎo)致病害發(fā)生嚴(yán)重、土壤微生態(tài)環(huán)境破壞[18]。利用土壤益生菌及其代謝產(chǎn)物在有效控制土傳病害的同時(shí)，可以促進(jìn)生長，修復(fù)土壤微生態(tài)環(huán)境[19]。深色有隔內(nèi)生真菌A024(P.bamuru)是從樟子松根部分離得到，對(duì)峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)測定結(jié)果，其對(duì)立枯絲核菌具有較強(qiáng)的抑制作用。代謝組學(xué)在植物、微生物、食品和醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力[20-21]，本項(xiàng)目采用LC-MS分析平臺(tái)研究立枯絲核菌誘導(dǎo)后菌株A024代謝組學(xué)，篩選功能化合物和代謝途徑，為進(jìn)一步研究其抑菌作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

深色有隔內(nèi)生真菌A024(P.bamuru)，分離自黑龍江省帽兒山實(shí)驗(yàn)林場樟子松根部樣品。立枯絲核菌SH(R.solaniKühn)分離自巴彥縣林業(yè)局苗圃。菌株保存于黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 菌絲體收集

采用賽璐玢膜覆膜法進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)[22]。制備90 mm培養(yǎng)皿PDA平板后，覆蓋90 mm無菌的賽璐玢膜，無菌打孔器(7 mm)切取深色有隔內(nèi)生真菌A024(P.bamuru)菌餅接種到距培養(yǎng)皿中心2.5 cm的位置，25℃恒溫培養(yǎng)7天后，在菌株A024對(duì)向5cm位置接種立枯絲核菌SH(R.solani)菌餅(7 mm)，同時(shí)設(shè)定不接種立枯絲核菌的A024培養(yǎng)皿作為對(duì)照，培養(yǎng)5天后，用滅菌刀片分別刮取A024菌絲，每個(gè)1.5 mL離心管100 mg菌絲進(jìn)行分裝，分裝完成后液氮速凍，-80℃冰箱保存，其中立枯絲核菌誘導(dǎo)處理樣品標(biāo)為DSE_SH，對(duì)照處理樣品標(biāo)為DSE，每處理6個(gè)重復(fù)。

1.3 菌絲體樣品提取方法

取裝有菌株A024菌絲體100 mg的1.5 mL離心管，加入20 μL內(nèi)標(biāo)（用甲醇配制0.3 mg/mL濃度的L-2-氯苯丙氨酸），用冰浴的甲醇:水(4:1=v:v)總共1 mL，移液槍吸打均勻后，分2次轉(zhuǎn)移到玻璃小瓶中；加入200 μL氯仿，用移液槍吹散；冰浴超聲破碎（500 W，6 min，6 s開，4 s關(guān)）；將全部的液體轉(zhuǎn)移到離心管中，超聲20 min；離心15 min(13000 r/min，4℃)；取提取液1 mL裝入1.5 mL離心管中揮發(fā)干凈；加250 μL甲醇-水(7:3，v/v)溶液，渦旋30 s，超聲2 min復(fù)溶；4℃低溫13000 r/min離心15 min，取處理好的180 μL上清液，裝入LC-MS進(jìn)樣小瓶中上機(jī)測定。

1.4 LC-MS檢測條件

LC-MS分析平臺(tái)為Waters公司超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜UPLC-Q-TOF/MS系統(tǒng)。色譜條件：色譜柱為 BEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm；Waters，Milford，USA)；制備2種含0.1%甲酸的流動(dòng)相，A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序?yàn)?～2 min：5%～20%B，2～8 min：20%～60%B，8～12 min：60%～100%B，100%B維持2 min，14～14.5 min：100%到5%B，5%B維持1 min。流速為0.40 mL/min，進(jìn)樣量為3 μL，柱溫為45℃。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜信號(hào)采集采用正負(fù)離子掃描模式，進(jìn)樣電壓和碰撞電壓分別為：1.0 kV，40 V和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為：120℃和500℃，載氣流量：900 L/h，質(zhì)譜掃描范圍：50～1000 m/z，掃描時(shí)間和間隔時(shí)間分別為：0.1 s和0.02 s。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入ProgenesisQI(Waters Corporation，Milford,USA)中，自動(dòng)進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊等，將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成包含保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣。使用數(shù)據(jù)庫 http://www.hmdb.ca/、http://www.lipidmaps.org/等鑒定代謝物。

1.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度采用峰面積歸一化法來進(jìn)行規(guī)格化，得到歸一化的數(shù)據(jù)矩陣，將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+14.0軟件包，用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA)來區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，尋找組間的差異代謝物。OPLS-DA分析中，變量權(quán)重值(Variable important in projection,VIP)大于1的變量被認(rèn)為是差異變量。為防止模型過擬合，200次置換檢驗(yàn)的方法來考察模型的擬合效果。

1.7 深色有隔內(nèi)生真菌A024代謝物注釋分析

通過質(zhì)譜鑒定的全部代謝物與KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得數(shù)據(jù)庫注釋信息，將代謝物與KEGG Compound數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲得分類信息和KEGG功能通路。

1.8 差異代謝物篩選及代謝通路分析

采用T檢驗(yàn)結(jié)合OPLS-DA分析方法，篩選立枯絲核菌誘導(dǎo)處理和對(duì)照組間差異代謝物（同時(shí)滿足VIP＞1，p value＜0.05）。通過比對(duì)HMDB、KEGG compound和LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫，查找差異代謝物的KEGG ID，再進(jìn)行代謝通路注釋和富集(p＜0.05)分析，獲得代謝通路圖，并分析通路功能。

1.9 數(shù)據(jù)分析

代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)分析采用Excel進(jìn)行，并計(jì)算相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，代謝組分析在上海美吉生物云平臺(tái)上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 深色有隔內(nèi)生真菌A024代謝產(chǎn)物KEGG化合物分類

通過對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，A024代謝產(chǎn)物包括9大類，按照數(shù)量多少分別是：脂類（114種）、肽類（22類）、核酸（16種）、激素（16種）、類固醇（15種）、維生素和輔酶因子（14種）、有機(jī)酸（13種）、碳水化合物（2種）、抗生素（1種）。

表1 菌株A024代謝產(chǎn)物KEGG化合物分類

續(xù)表1

2.2 深色有隔內(nèi)生真菌A024主要代謝通路類別

第一層級(jí)代謝通路包括：代謝Metabolism、組織系統(tǒng)Organismal Systems、環(huán)境信息過程Environmental Information Processing、人類疾病 Human Diseases、遺傳信息過程Genetic Information Processing、細(xì)胞過程Cellular Processes、藥物開發(fā) Drug Development。檢測到的化合物個(gè)數(shù)分別為318個(gè)、90個(gè)、63個(gè)、45個(gè)、13個(gè)、23個(gè)和6個(gè)。

第二層級(jí)代謝通路包含代謝物數(shù)量從多到少排序，前20位的代謝通路及化合物數(shù)量：氨酰tRNA生物合成 Aminoacyl-tRNA biosynthesis（11個(gè)）、酪氨酸代謝 Tyrosine metabolism（13個(gè)）、血清素突觸Serotonergic synapse（13個(gè)）、中心碳代謝 Central carbon metabolism in cancer（13個(gè)）、萜類和類固醇的生物合成 Biosynthesis of terpenoids and steroids（13個(gè)）、色氨酸代謝Tryptophan metabolism（14個(gè)）、嘌呤代謝Purine metabolism（14個(gè)）、苯丙醇類的生物合成Biosynthesis of phenylpropanoids（15個(gè)）、嘧啶代謝Pyrimidine metabolism（16個(gè)）、植物激素的生物合成Biosynthesis of plant hormones（16個(gè)）、不飽和脂肪酸的生物合成Biosynthesis of unsaturated fatty acids（17個(gè)）、莽草酸途徑生物堿的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway（17個(gè)）、類固醇激素生物合成Steroid hormone biosynthesis（18個(gè)）、蛋白質(zhì)消化吸收Protein digestion and absorption（18個(gè)）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝Glycine,serine and threonine metabolism（18個(gè)）、花生四烯酸代謝Arachidonic acid metabolism（18個(gè)）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用Neuroactive ligand-receptor interaction（20個(gè)）、膽汁分泌 Bile secretion（26個(gè)）、ABC運(yùn)輸ABC transporters（21個(gè)）、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成Biosynthesis of plant secondary metabolites（45個(gè)）。

多條次生代謝產(chǎn)物合成途徑在菌株A024中檢測到，分別是：類黃酮(Flavonoid)、單酰胺菌素(Monobactam)、異喹啉生物堿(Isoquinoline alkaloid)、哌啶和吡啶生物堿(piperidine and pyridine alkaloid)、青霉素與頭孢菌素(Penicillin and cephalosporin)、吲哚生物堿(Indole alkaloid)、碳青霉烯(Carbapenem)、新生霉素 (Novobiocin)、葡 萄 孢 菌 素 (Staurosporine)、吩 嗪(Phenazine)、吖啶酮生物堿(Acridone alkaloid)。

2.3 立枯絲核菌誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)處理A024樣品總離子流比較

通過比較立枯絲核菌誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)A024樣品的總離子流圖，可以看出在早期階段(3～6 min)檢出的小分子、中期階段(6～8 min)和后期(8～11 min)檢出的大分子均存在差異（圖1）。

圖1 立枯絲核菌誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)處理A024樣品的總離子流比較

2.4 立枯絲核菌誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)處理A024樣品的差異分析

采用正交偏最小二乘法判別(OPLS-DA)分析（圖2），結(jié)果表明，不同處理組DSE_SH組和DSE組明顯分開，立枯絲核菌誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的A024代謝組存在差異。

圖2 立枯絲核菌誘導(dǎo)(DSE_SH)和非誘導(dǎo)(DSE)的OPLS-DA圖

2.5 篩選鑒定A024組間差異代謝物

對(duì)處理組DSE-SH和DSE樣本進(jìn)行基于代謝物峰面積的t檢驗(yàn)，得到峰面積具有顯著差異的代謝物（差異倍數(shù)＞1.1倍，且P＜0.05），與KEGG匹配的化合物共52個(gè)（表2），同對(duì)照相比，誘導(dǎo)后上調(diào)的31個(gè)，下調(diào)的21個(gè)。上調(diào)的化合物包括：木犀草素3'-(3'-乙酰葡萄糖醛酸)、L-絲氨酸、5-羥基鮑迪木醌、磷酸鳥苷、L-蘋果酸、絲氨酸內(nèi)酯、煙酸等。下調(diào)的化合物包括：2E,6Z-金合歡醛、13-酮-9Z,11E,15Z十八碳三烯酸、C16鞘氨醇、地高辛、視黃酯、5,6-環(huán)氧-8,11,14-二十碳三烯酸、谷胱甘肽、煙酰胺等。

表2 經(jīng)立枯絲核菌誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)處理A024主要差異代謝物

差異代謝物聚類分析（圖3），誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)處理不同生物重復(fù)之間聚類效果顯著，聚集的主要的幾類代謝物上調(diào)和下調(diào)變化規(guī)律與處理方式緊密相關(guān)。結(jié)果表明為應(yīng)對(duì)立枯絲核菌的誘導(dǎo)處理，菌株A024的次生代謝產(chǎn)物同對(duì)照相比，發(fā)生顯著變化。

圖3 差異代謝產(chǎn)物聚類分析Heatmap

2.6 組間差異代謝物KEGG通路富集分析

富集程度前20的差異代謝物代謝途徑包括：逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)Retrograde endocannabinoid signaling、花生四烯酸代謝Arachidonic acid metabolism、組氨酸和嘌呤類生物堿的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from histidine and purine、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成Biosynthesis of plant secondary metabolites。此外萜類和聚酮類生物堿的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from terpenoid and polyketide、鳥氨酸、賴氨酸和煙酸生物堿的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from ornithine,lysine and nicotinic acid、萜類和類固醇的生物合成Biosynthesis of terpenoids and steroids、苯丙醇類的生物合成Biosynthesis of phenylpropanoids、植物激素的生物合成Biosynthesis of plant hormones、莽草酸途徑生物堿的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway（圖 4）。

圖4 富集程度前20的差異代謝物代謝途徑

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于深色有隔內(nèi)生真菌的其生物防治作用，主要集中在高效菌株分離篩選，生物防治潛力等方面，Narisawa利用誘餌植物分離篩選出兩株生防菌P.fortiniiC.J.K.Wang&H.E.Wilcox和Heteroconium chaetospira(Grove)M.B.Ellis，可有效控制大白菜病害，包括由Plasmodiophora brassicaeWoronin引起的根腫病和輪枝孢屬真菌Verticilliumspp.引起的輪枝孢黃萎病[23-25]。Christoph T從P.europaea的代謝產(chǎn)物中分離得到4種主要成分，核盤菌素sclerin，菌核內(nèi)酯sclerolide，菌核素A sclerotinin A和菌核素B sclerotinin B，可顯著抑制疫霉菌Phytophthora citricola的生長[26]。TellenbachE研究發(fā)現(xiàn)P.sphareoides可以通過產(chǎn)生多樣的生物活性物質(zhì)可以有效抑制Heterobasidion parviporum對(duì)挪威云杉的侵染[27]。Ivo[28]利用生態(tài)位的競爭作用，通過接種低毒性的PAC菌株可有效控制高毒性PAC菌株對(duì)植物的危害，對(duì)代謝組的研究較少。本研究重點(diǎn)聚焦深色有隔內(nèi)生真菌的代謝組分析，采用LC-MS分析平臺(tái)，研究立枯絲核菌誘導(dǎo)條件下的深色有隔內(nèi)生真菌A024非靶向代謝組，結(jié)果表明A024代謝產(chǎn)物包括9大類，27小類，此外A024還檢測到包括類黃酮、單酰胺菌素、喹啉生物堿、青霉素與頭孢菌素、新生霉素、吩嗪等多條次生代謝產(chǎn)物合成途徑。通過DSE_SH、DSE組樣本t檢驗(yàn)，得到峰面積具有顯著差異的代謝物，與KEGG匹配的化合物共52個(gè)，同對(duì)照相比，誘導(dǎo)后上調(diào)的31個(gè)，下調(diào)的21個(gè)。其中包括部分黃酮類化合物以及L-蘋果酸、磷酸鳥苷、煙酸等顯著上調(diào)。差異代謝物聚類分析，誘導(dǎo)和對(duì)照處理差異代謝物的上調(diào)和下調(diào)變化與不同處理緊密相關(guān)，立枯絲核菌處理對(duì)菌株A024的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了影響。差異代謝產(chǎn)物的KEGG富集分析中花生四烯酸代謝、組氨酸和嘌呤類生物堿的生物合成、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、萜類和聚酮類生物堿的生物合成，但是差異代謝物和KEGG富集的代謝通路具體的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究。綜上，本研究利用LC-MS平臺(tái)對(duì)立枯絲核菌誘導(dǎo)條件下深色有隔內(nèi)生真菌A024的非靶向代謝組進(jìn)行分析，篩選得到多個(gè)差異顯著性代謝產(chǎn)物及其富集的代謝通路，為進(jìn)一步研究其對(duì)立枯絲核菌的抑制作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。