楊海成，楊照輝，史康杰，溫鈺鵬，張示杰

泡狀棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)是一種人獸共患病，當(dāng)人誤食多房棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusmultilocularis，E.multilocularis)的蟲(chóng)卵時(shí)，蟲(chóng)卵發(fā)育成六鉤蚴入血，成蟲(chóng)寄生于肝臟可致AE。E.multilocularis的生命周期復(fù)雜，根據(jù)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其終宿主為野生或家養(yǎng)犬科動(dòng)物，如北極狐、豺、狼或狗等，而人類是中間宿主[1]。E.multilocularis的幼蟲(chóng)期是AE的病原體，估計(jì)每年有17 400例感染，其中大多數(shù)發(fā)生在中國(guó)，多聚集在新疆、青海、西藏等地[2]。AE是一種破壞性的臨床病癥，其特征在于寄生蟲(chóng)的進(jìn)行性、浸潤(rùn)性增殖，多似惡性腫瘤[3]。AE主要影響肝臟，若治療不及時(shí)，往往病死率極高[4]。肝臟中最常見(jiàn)的惡性腫瘤為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，隨著社會(huì)進(jìn)入老齡化，我國(guó)HCC的患病數(shù)依然很龐大，5年轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率均高于60%[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴原頭節(jié)無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間在體外培養(yǎng)，直到Hemphill與Gottstein首次提出泡球蚴原頭節(jié)與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著延長(zhǎng)原頭節(jié)在體外的存活時(shí)間[6]。目前雖有原頭節(jié)與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞可作為泡球蚴的飼養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)泡球蚴的生長(zhǎng)發(fā)育，但泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞(hepatoma cells，HepG2)共培養(yǎng)較少見(jiàn)。近年有關(guān)寄生蟲(chóng)感染后導(dǎo)致宿主體內(nèi)感染灶內(nèi)細(xì)胞增殖的研究逐漸增多，多房棘球絳蟲(chóng)[7]、枯氏錐蟲(chóng)(Trypanosomacruzi)[8]、剛第弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)[9]感染后，細(xì)胞內(nèi)ERK信號(hào)通路被激活，促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖。體外實(shí)驗(yàn)表明，泡狀棘球蚴囊液中存在多種促炎細(xì)胞因子。因此我們將人源肝癌HepG2細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞與泡球蚴原頭節(jié)共培養(yǎng)觀察泡球蚴原頭節(jié)的存活及成囊情況，反之再去觀察泡狀棘球蚴原頭節(jié)對(duì)飼養(yǎng)細(xì)胞的作用。基于此想法，我們初步分析E.multilocularis與肝癌HepG2細(xì)胞的相互作用及其機(jī)制，為包蟲(chóng)病合并肝癌的臨床早期診治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1倫理聲明 本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均按照2017年3月1日《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》嚴(yán)格執(zhí)行，并且經(jīng)過(guò)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意(許可證號(hào)：2015-018-01)。

1.2 材 料

1.2.1原頭節(jié)及肝癌細(xì)胞的制備 從新疆維吾爾自治區(qū)疾控中心購(gòu)SPF級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠(Merionesunguiculatus)50只(雌雄各25只)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(新)2017-0021，鼠齡在6～8周之間，體重(40±5)g，用于E.multilocularis的保種與傳代。新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供感染E.multilocularis6個(gè)月以上的長(zhǎng)爪沙鼠(15只)，按照原頭節(jié)提取方法提取原頭節(jié)。肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽公司，使用含1%青鏈霉素(購(gòu)于Gibco公司)及10%胎牛血清(購(gòu)于Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2主要試劑 伊紅染料、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒、CCK8檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂液等。

1.3原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng) 肝癌HepG2細(xì)胞采用10%的胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，隔天換液或傳代。待肝癌細(xì)胞貼壁后，將原頭節(jié)按數(shù)量加入到培養(yǎng)瓶中，換液前提前收集泡狀棘球蚴原頭節(jié)。

1.4原頭節(jié)活性檢測(cè)及成囊情況 將存在飼養(yǎng)細(xì)胞的原頭節(jié)組與無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的原頭節(jié)組重新?lián)Q液時(shí)計(jì)時(shí)，每隔2 d取等量的原頭節(jié)數(shù)量進(jìn)行活性檢測(cè)，使用伊紅染色的方法計(jì)算活性，以抗紅染原頭節(jié)計(jì)算存活量，以紅染原頭節(jié)計(jì)算死亡量，存活率=[存活量/(存活量+死亡量)]×100%。在原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，每隔7 d換液，每次取10 μL培養(yǎng)液計(jì)算成囊率，成囊率=(成囊泡數(shù)/視野下總原頭節(jié)數(shù))×100%。

1.5CCK8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖情況 按5×105/mL密度將HepG2細(xì)胞種植在24孔板中并設(shè)置空白組比較，培養(yǎng)12 h后，以不同濃度(0、3 000、6 000、9 000 個(gè)/孔)的原頭節(jié)加入到肝癌細(xì)胞中，每組設(shè)置3個(gè)對(duì)照組，待共培養(yǎng)48 h與72 h后，將原頭節(jié)從上清中完全取出，每孔加入25 μL CCK-8試劑，避光，37 ℃條件中孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm吸光度時(shí)的吸光度(A)值，以此來(lái)計(jì)算細(xì)胞的增值率。增值率=[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡情況 按5×105/mL密度將HepG2細(xì)胞種植在6孔板中，采用不同數(shù)量(0、3 000、6 000、9 000 個(gè)/孔)的原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，徹底去除原頭節(jié)后，使用預(yù)冷的PBS沖洗干凈后，加入胰酶消化后收集細(xì)胞，分別加入PI和Annexin V-FITC抗體后，設(shè)置對(duì)照組，避光情況下上機(jī)檢測(cè)。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞中caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平

使用上述方法處理后的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，調(diào)平后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存條件：37 ℃ 2 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。將所得cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所用PCR引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。使用2-△△Ct計(jì)算公式得出mRNA的表達(dá)量。

1.8Western Blot方法測(cè)定蛋白表達(dá)量 使用上述處理過(guò)的細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液，獲取肝癌細(xì)胞中總蛋白樣品，用BCA的方法檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后使各組濃度一致，應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，加入一抗、二抗，化學(xué)發(fā)光得出灰度值計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

2 結(jié) 果

2.1肝癌細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以促進(jìn)泡球蚴原頭節(jié)的存活和提高活性 隨著肝癌HepG2細(xì)胞濃度的增加，原頭節(jié)形態(tài)以及活性有著顯著變化。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，原頭節(jié)形態(tài)更穩(wěn)定，成活率更高，使用伊紅染色時(shí)，有飼養(yǎng)細(xì)胞存在的原頭節(jié)抗紅染能力越強(qiáng)，存活率為[(91.42±2.47)%]顯著高于無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞組[(73.10±4.68)%，t=-7.738，P<0.05]，見(jiàn)表2。

表2 飼養(yǎng)細(xì)胞與E.multilocularis共培養(yǎng)后E.multilocularis的存活情況Tab.2 Survival of E. multilocularis after co-culture with feeder cells

2.2肝癌細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以促進(jìn)泡球蚴原頭節(jié)成囊 存在肝癌細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，原頭節(jié)成囊率[(66.72±2.02)%]顯著高于無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞組的成囊率[(30.21±2.25)%，t=11.228，P<0.01]。隨著定期更換飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，囊泡的直徑會(huì)不斷變大。

2.3泡球蚴原頭節(jié)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及抑制凋亡

2.3.1利用CCK8法檢測(cè)泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)48 h和72 h后肝癌細(xì)胞的增殖情況 將泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，與無(wú)原頭節(jié)共培養(yǎng)組比較，實(shí)驗(yàn)組(4.13±0.04,4.43±0.07,3.77±0.04)均促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖(t=-130.912、-89.051、-134.067，P均<0.01)，濃度為9 000個(gè)/孔組較前兩組有所降低，但均高于對(duì)照組。將共培養(yǎng)時(shí)間增加到72 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組(5.24±0.06,5.84±0.04,6.94±0.05)均高于對(duì)照組(t=-125.853、-206.432、-219.405，P均<0.01)。見(jiàn)圖1。

①P<0.01 vs 對(duì)照組 (0個(gè)/孔). 圖1 CCK8法檢測(cè)不同數(shù)量原頭節(jié)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖情況Fig.1 CCK8 method for detecting the proliferation of HepG2 with different numbers of protoscolex

2.3.2Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原頭節(jié)抑制肝癌HepG2細(xì)胞凋亡情況 如圖2所示，檢測(cè)共培養(yǎng)48 h后的肝癌細(xì)胞凋亡情況，流式結(jié)果顯示：對(duì)照組凋亡率為(25.27±0.05)%，濃度為3 000個(gè)/孔組凋亡率為(17.28±0.10)%, 6 000個(gè)/孔組為(9.96±0.03)%, 9 000個(gè)/孔組為(18.78±0.07)%。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中3 000個(gè)/孔、6 000個(gè)/孔和9 000個(gè)/孔組肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例均降低(t=18.829、31.523、11.644，P均<0.01)，但6 000個(gè)/孔組凋亡比例最低，見(jiàn)圖2。

①P<0.01 vs 對(duì)照組(0 個(gè)/孔)圖2 Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Annexin V-FITC/PI flow cytometry detecting HepG2 cell apoptosis

2.3.3泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后肝癌細(xì)胞中mRNA的變化 與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2表達(dá)升高(F=75.801，P<0.01)，而B(niǎo)ax、caspase3、caspase9、P21、P53表達(dá)降低(F=70.206、360.218、240.962、687.871、182.437，P均<0.01)，但發(fā)現(xiàn)濃度6 000個(gè)/孔組的促凋亡基因下降不明顯，而促增殖基因反而升高明顯。見(jiàn)圖3。

2.3.4原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后可降低肝癌HepG2細(xì)胞的Bax、caspase3和caspase9表達(dá)，并促進(jìn)Bcl-2表達(dá) 利用Western-blot檢測(cè)不同數(shù)量原頭節(jié)對(duì)HepG2中Bax、caspase3和caspase9的表達(dá)，均呈現(xiàn)不同程度的降低(F=703.092、48.490、968.834，P均<0.01)，但隨著原頭節(jié)數(shù)量的不斷增加Bcl-2的表達(dá)卻增加(F=103.726，P<0.01)，見(jiàn)圖4。說(shuō)明原頭節(jié)可通過(guò)caspase通路及線粒體通路來(lái)影響HepG2細(xì)胞的凋亡。

①P<0.01 vs 對(duì)照組(0 個(gè)/孔)圖3 Real-Time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)分子caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2、P21、P53的mRNA表達(dá)情況Fig.3 Real-time PCR detection of the mRNA expression of the apoptosis-associated molecules caspase3, caspase9, Bax, Bcl-2, P21 and P53

3 討 論

泡狀棘球蚴病雖是良性病變，但呈現(xiàn)惡性生長(zhǎng)，較易侵襲和轉(zhuǎn)移，故生存率較低。原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的過(guò)程，需要基因改變和表觀遺傳的共同參與。而泡狀棘球蚴的生長(zhǎng)發(fā)育是依賴于宿主環(huán)境而呈現(xiàn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，研究表明不同動(dòng)物種屬之間的細(xì)胞因子如胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等不僅結(jié)構(gòu)上有明顯的同源性，而且在功能上也可以相互替代[10]。因此利用這一點(diǎn)宿主可能提供某些細(xì)胞因子為其生長(zhǎng)提供幫助，而動(dòng)物進(jìn)化及生長(zhǎng)最早是建立在細(xì)胞間通訊的基礎(chǔ)之上。有研究表明EGFR通路可參與泡狀棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞的增殖和存活，抑制EGFR通路可誘導(dǎo)泡球蚴生發(fā)細(xì)胞的caspase3酶活性升高，出現(xiàn)凋亡特征[11]。研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制EGF所誘導(dǎo)的ERK磷酸化，可導(dǎo)致生發(fā)層細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖[12]。泡狀棘球蚴甚至還表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、蛋白酶、鐵離子通道等[13]。本研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴原頭節(jié)的生長(zhǎng)發(fā)育離不開(kāi)飼養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)肝癌HepG2細(xì)胞與之共培養(yǎng)時(shí)，原頭節(jié)存在顯著的高存活率，延長(zhǎng)了泡球蚴原頭節(jié)在體外培養(yǎng)的時(shí)間，且更易成囊成泡，為后期研究生發(fā)層細(xì)胞提供可靠來(lái)源。發(fā)生此現(xiàn)象的原因可能是肝癌HepG2細(xì)胞分泌了某些細(xì)胞因子作用于泡狀棘球蚴原頭節(jié)的對(duì)應(yīng)受體導(dǎo)致相關(guān)通路的激活，以此來(lái)促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。

①P<0.01 vs 對(duì)照組(0 個(gè)/孔)圖4 Western-blot 檢測(cè)HepG2中Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9的表達(dá)Fig.4 Western-blotting detection of the expression of Bax, Bcl-2, caspase3 and caspase9 in HepG2 cells

Romic B等[14]對(duì)肝細(xì)胞癌(HCC)合并肝包蟲(chóng)病的研究進(jìn)行了系統(tǒng)回顧，分析了HCC癌變的性質(zhì)，以了解肝癌變的診斷特征并作出合適的治療。Kübeck M等[15]報(bào)告了目前肝癌合并AE的病例，闡述了泡狀棘球蚴可導(dǎo)致慢性肝實(shí)質(zhì)性改變，以此來(lái)促進(jìn)肝癌的發(fā)生。上述研究?jī)H局限于通過(guò)臨床病例進(jìn)行分析，并未有明確的分子機(jī)制來(lái)闡明發(fā)生的原因。Stadelnan B等[16]發(fā)現(xiàn)E.multilocularisPGI與人類的PGI在核酸序列上有86%的同源性，這種酶可作為一種生長(zhǎng)因子在肝癌發(fā)生上起重要作用。另有研究人員發(fā)現(xiàn)AE可影響人類的免疫系統(tǒng)，以此來(lái)增加惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。caspase3對(duì)于腫瘤的凋亡是一個(gè)重要分子，剪切的caspase3是促進(jìn)凋亡的主要裂解酶，而B(niǎo)cl-2可抑制caspase3的活性，Bax與Bcl-2同源為一種水源性相關(guān)蛋白，Bax的過(guò)度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)原頭節(jié)存在時(shí)，CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示共培養(yǎng)時(shí)肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出活躍增殖現(xiàn)象，且流式結(jié)果與CCK8一致表現(xiàn)出凋亡減少，顯著低于對(duì)照組，但濃度6 000 個(gè)/孔組的凋亡率低于3 000 個(gè)/孔組與9 000 個(gè)/孔組，發(fā)生這種原因的可能是9 000 個(gè)/孔組原頭節(jié)密度較大，影響了肝癌HepG2細(xì)胞的代謝。實(shí)驗(yàn)組的P21、P53、caspase3、caspase9及Bax低于對(duì)照組，Bcl-2高于對(duì)照組，隨著原頭節(jié)數(shù)量的增加，增殖呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明無(wú)論從caspase家族或線粒體通路都是原頭節(jié)抑制肝癌細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)增殖，這說(shuō)明原頭節(jié)可能分泌某些促增殖因子例如EGF、OPN等，它們作用于肝癌細(xì)胞表面受體導(dǎo)致此現(xiàn)象的出現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)是研究泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細(xì)胞的相互作用，可為后期體外培養(yǎng)原頭節(jié)及生發(fā)層細(xì)胞提供依據(jù)，也可為預(yù)防泡球蚴病合并肝癌患者復(fù)發(fā)或惡化提供理論依據(jù)。研究證實(shí)了泡球蚴原頭節(jié)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖而抑制其凋亡，這可為后期研究提供理論依據(jù)以及組織損傷修復(fù)的新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。但本研究對(duì)具體分泌了哪些因子導(dǎo)致該現(xiàn)象的產(chǎn)生尚無(wú)定論，機(jī)制尚未闡明。因此需要進(jìn)一步探索以解釋更深的機(jī)制，也需進(jìn)一步加強(qiáng)泡球蚴原頭節(jié)生物制劑的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究。

利益沖突：無(wú)