郭怡寧，楊振清，朱炳祺

浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053

在傳統(tǒng)中醫(yī)藥不斷為當(dāng)今醫(yī)療事業(yè)做出貢獻(xiàn)的同時(shí)，劣質(zhì)、摻假、不規(guī)范生產(chǎn)加工等中藥質(zhì)量問題層出不窮[1]。中藥的質(zhì)量與其臨床療效有著密不可分的聯(lián)系，因此，尋求快速準(zhǔn)確的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法已是當(dāng)務(wù)之急。

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，中藥的指紋圖譜研究得到不斷深入和完善[2]?，F(xiàn)行的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)是以1 種或幾種有效成分、活性成分或指標(biāo)成分的含量作為某一中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并依此評(píng)價(jià)中藥及中成藥的質(zhì)量[3]。與其他現(xiàn)代分析技術(shù)（如色譜、質(zhì)譜等）相比，熒光光譜分析在化合物的定性鑒定中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]。三維熒光技術(shù)具有靈敏度較高、選擇性良好、能快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，且可以將熒光信息描述得更為全面，可提供比常規(guī)熒光光譜更加完整的指紋圖譜特征信息，較好地反映中藥的全貌，能夠?qū)崿F(xiàn)在中藥復(fù)雜體系中對(duì)多個(gè)組分同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性與定量分析，彌補(bǔ)了當(dāng)前色譜法選擇1 種或幾種成分進(jìn)行測(cè)定的不足[5]，在中藥質(zhì)量控制中具有潛在的重要價(jià)值，為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新途徑。

1 三維熒光技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

熒光光譜是目前一種重要且有效的光譜分析手段（ATLD），其具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好、動(dòng)態(tài)線性范圍寬、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[6]，可對(duì)熒光組分進(jìn)行定性與定量分析。

三維熒光技術(shù)是20世紀(jì)80年代在熒光光譜分析的基礎(chǔ)上發(fā)展衍生出來的一種新分析技術(shù)[7]。三維熒光圖譜包含激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度3 種信息，描述了熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化的關(guān)系，可以直觀地表示熒光強(qiáng)度、熒光峰位置及熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)，能提供比常規(guī)熒光圖譜更為豐富的信息，更加完整地描述熒光物質(zhì)的熒光特性。

三維熒光圖譜在速度快、成本低、專屬性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，能夠更加全面地反映一個(gè)復(fù)雜物質(zhì)的光譜信息，并且具有較高的測(cè)量靈敏度，對(duì)分子的結(jié)構(gòu)也具有較好的選擇性[8]，這些優(yōu)點(diǎn)都使其應(yīng)用范圍越來越廣[9]。

2 三維熒光技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法

三維熒光技術(shù)雖能獲得豐富的化合物光譜信息，但要實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜分析體系中的多組分同時(shí)定性定量分析和動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)解析等作用，則需將其與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，通過解析測(cè)量數(shù)據(jù)最大限度地獲取有效信息，提高對(duì)復(fù)雜體系的分析能力[10]，這也是目前一個(gè)重要的發(fā)展方向[11]。

2.1 平行因子分析法（PARAFAC）

PARAFAC是基于三線性分解理論，采用交替最小二乘算法實(shí)現(xiàn)的一種數(shù)學(xué)模型，結(jié)合三維熒光圖譜進(jìn)行分析可有效地對(duì)重疊的化合物光譜信息進(jìn)行識(shí)別和分離[12-13]。

楊莉等[14]采用三維熒光并結(jié)合PARAFAC對(duì)絞股藍(lán)中的槲皮素含量和回收率進(jìn)行測(cè)定，實(shí)際質(zhì)量濃度與相對(duì)質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)為0.999 2，平均回收率達(dá)到96.3%。結(jié)果說明PARAFAC 具有快速、簡(jiǎn)便、高效及成本低等特點(diǎn)，適用于復(fù)雜成分的定性及定量分析。楊莉等[15]采用三維熒光并結(jié)合PARAFAC 對(duì)蛇床子中蛇床子素進(jìn)行定性及定量分析，測(cè)得蛇床子中蛇床子素的回收率為103.6%，所得蛇床子素解析光譜和真實(shí)光譜幾乎完全重合。結(jié)果顯示，三維熒光技術(shù)結(jié)合PARAFAC 可以在有未知干擾組分共存的情況下對(duì)特定組分進(jìn)行準(zhǔn)確而有效的定性及定量分析。

2.2 交替三線性分解（ATLD）算法

ATLD 算法是基于交替最小二乘原理提出的多維校正方法[16]。ATLD 算法在PARAFAC 的基礎(chǔ)上，引入切尾奇異值分解的Moore-Penrose 廣義逆計(jì)算，彌補(bǔ)了PARAFAC 對(duì)組分?jǐn)?shù)敏感的缺陷[17]。ATLD 算法簡(jiǎn)便、高效，且可以在復(fù)雜體系中對(duì)多個(gè)特定組分同時(shí)進(jìn)行快速且準(zhǔn)確的定性與定量分析[16]。

曹津津[18]用ATLD 算法解析白屈菜提取液的系列溶液與白屈菜紅堿對(duì)照溶液的三維熒光數(shù)陣，得到的白屈菜紅堿的相對(duì)光譜與真實(shí)光譜幾乎完全吻合。結(jié)果表明，在中藥提取液的復(fù)雜組分中，可通過ATLD 算法得到目標(biāo)組分準(zhǔn)確的相對(duì)光譜及有效的數(shù)學(xué)分離。趙佳佳等[19]采用三維熒光技術(shù)結(jié)合ATLD 算法在有未知熒光干擾物存在的情況下，有效分辨出陳皮中辛弗林的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜，并快速測(cè)定其含量，經(jīng)高效液相色譜法驗(yàn)證后，2 種方法測(cè)得結(jié)果較為一致，由此說明ATLD 算法準(zhǔn)確可靠。

2.3 其他算法

樊鳳杰等[20]采用局部線性嵌入（LLE）算法對(duì)補(bǔ)虛類中藥三維熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取，結(jié)果表明，采用LLE 算法提取特征時(shí)，通過尋找高維數(shù)據(jù)中所隱藏的低維流形結(jié)構(gòu)進(jìn)行特征提取，能夠使降維后的數(shù)據(jù)保持原有的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在選擇合理的近鄰點(diǎn)數(shù)和本征維數(shù)的基礎(chǔ)上，可以得到較好的嵌入結(jié)果。

馬帥[21]采集不同產(chǎn)地純葛根的三維熒光光譜數(shù)據(jù)，采用多維主成分分析（M-PCA）及N 維偏最小二乘法-辨別分析（N-PLS-DA）2種多維模式識(shí)別方法分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。結(jié)果顯示，M-PCA 和N-PLS-DA 能夠較為準(zhǔn)確地對(duì)不同產(chǎn)地純葛根進(jìn)行分類識(shí)別。

軒鳳來[22]采用總體平均經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解（EEMD）算法對(duì)人參溶液的三維熒光光譜進(jìn)行降噪處理，并將該方法與小波分解與重構(gòu)、經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解算法進(jìn)行比較，驗(yàn)證了EEMD算法的優(yōu)越性。

三維熒光技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜體系中多組分目標(biāo)物的直接、快速、精準(zhǔn)的定量分析，已取得了較大進(jìn)展。2 種方法的結(jié)合為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域提供了一種快速且“綠色”的方法，在今后的分析領(lǐng)域必將有重要的應(yīng)用價(jià)值[15]。

3 三維熒光技術(shù)在中藥定性鑒定與定量分析中的應(yīng)用

三維熒光技術(shù)為中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)檢測(cè)提供了一種新的途徑，在中藥材定性定量分析中發(fā)揮了巨大優(yōu)勢(shì)。魏永巨等[23]采用三維熒光技術(shù)研究了一些中草藥或中成藥，通過比較中藥粉末或提取液的三維熒光指紋圖譜的形狀、熒光強(qiáng)度、熒光峰位置等信息，可以鑒別中藥中的不同組分。實(shí)驗(yàn)表明，三維熒光技術(shù)測(cè)定結(jié)果可靠，所得圖譜可比性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，適用于中藥的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)。近年來，已有越來越多研究者開始重視三維熒光技術(shù)已在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

3.1 中藥材的真?zhèn)纹疯b定

不同的物質(zhì)具有不同的三維熒光指紋特性，可對(duì)比待測(cè)中藥材與對(duì)照藥材的三維熒光圖譜，區(qū)分中藥材是否摻雜偽品。陳立弟等[24]建立了β-環(huán)糊精增敏三維熒光法鑒定五指毛桃的方法。在優(yōu)化β-環(huán)糊精敏化條件下，將三維熒光圖譜特征、特征熒光峰位置、熒光強(qiáng)度作為五指毛桃指紋圖譜鑒定的參考依據(jù)，發(fā)現(xiàn)某一品種沒有五指毛桃的特征峰，表明是一種偽品，與生藥學(xué)鑒定的結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)表明，三維熒光技術(shù)可應(yīng)用于五指毛桃真?zhèn)纹返目焖勹b別。李雷等[5]提出基于三維熒光技術(shù)的丹參及其偽品的鑒別方法。實(shí)驗(yàn)通過三維熒光技術(shù)對(duì)丹參溶液與含有1 種或多種偽品的丹參溶液進(jìn)行測(cè)定，所得三維熒光光譜圖具有顯著的區(qū)分度，充分說明三維熒光技術(shù)可以有效鑒定丹參粉是否摻雜偽品。實(shí)驗(yàn)表明，三維熒光技術(shù)適用于多組分復(fù)雜體系的檢測(cè)與分析，能夠?yàn)橹兴幉牡恼鎮(zhèn)纹疯b定提供參考。白雪梅等[25]采用三維熒光光譜結(jié)合ATLD 算法測(cè)定了徐長(zhǎng)卿藥材中丹皮酚的含量，經(jīng)過高效液相色譜法驗(yàn)證后，2 種方法所得結(jié)果基本一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三維熒光結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法相對(duì)傳統(tǒng)方法更為快速、簡(jiǎn)單，可用于復(fù)雜體系中特定組分的定性與定量分析。

3.2 中藥材的商品等級(jí)鑒別

中藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，目前對(duì)不同商品等級(jí)中藥材的區(qū)分還停留在“辨狀論質(zhì)”的階段，但其性狀差異并不大。利用三維熒光技術(shù)可對(duì)中藥材不同商品等級(jí)進(jìn)行定性鑒別。穆希瓊等[26]采用三維熒光技術(shù)對(duì)不同商品等級(jí)紋黨參的固體粉末進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)其進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果表明，不同商品等級(jí)的紋黨參固體粉末三維熒光光譜圖中只出現(xiàn)1 個(gè)熒光峰，熒光峰的激發(fā)波長(zhǎng)相似，發(fā)射波長(zhǎng)均為550 nm，但熒光強(qiáng)度有明顯區(qū)別，即熒光強(qiáng)度與商品等級(jí)呈正相關(guān)，由此可利用三維熒光技術(shù)區(qū)分紋黨參的不同商品等級(jí)數(shù)。

3.3 中成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)

中成藥是以中藥材為原料制成的一定劑型的中藥制品，可利用三維熒光技術(shù)和結(jié)合聚類分析法建立中成藥的三維熒光圖譜，用于中成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)。朱丹丹等[27]采用三維熒光技術(shù)對(duì)清熱散結(jié)膠囊的熒光性質(zhì)進(jìn)行研究，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定了不同廠家、不同批號(hào)的56 個(gè)清熱散結(jié)膠囊樣本的三維熒光圖譜，采用聚類分析法對(duì)其一致性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，56 個(gè)清熱散結(jié)膠囊樣本的三維熒光圖譜一致性良好，為清熱散結(jié)膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。喬淞汾[28]對(duì)健脾和胃類、祛風(fēng)濕類和清熱類中成藥的三維熒光圖譜進(jìn)行研究，結(jié)合聚類分析和主成分分析技術(shù)考察了各類中成藥的一致性，并采用平均值法分別建立了各類中成藥的三維熒光圖譜，為中成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種方便、快捷、可靠的方法。

目前，三維熒光技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用仍不夠廣泛，但由上述研究看來，三維熒光技術(shù)有望發(fā)展為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的常規(guī)方法。

4 三維熒光技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的局限性

三維熒光技術(shù)雖具有前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、信息全面等優(yōu)點(diǎn)，但也具有一定局限性：第一，三維熒光技術(shù)所檢測(cè)的物質(zhì)受到一定的限制，待測(cè)組分須具有熒光特性，其產(chǎn)生的熒光信息必須足以被儀器捕捉，即待測(cè)組分的分子必須具有較高的熒光效率。第二，被測(cè)組分的熒光強(qiáng)度在一定程度上受環(huán)境因素的影響，如溫度、溶液pH、溶液中離子等。第三，對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)十分相似的組分，單純的三維熒光圖譜難以分辨，無法實(shí)現(xiàn)其定量分析。

針對(duì)以上局限性，可以采用相應(yīng)手段來彌補(bǔ)三維熒光技術(shù)的缺陷。

首先，熟悉目標(biāo)組分的自身理化特性，對(duì)于產(chǎn)生熒光較弱的組分，可利用某些金屬離子與其形成絡(luò)合物，以達(dá)到增強(qiáng)熒光效率的效果。楊菲[29]通過比較中藥活性成分丹皮酚、原兒茶酸和沒食子酸與硼砂或鋁離子反應(yīng)前后的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)在一定條件下，這3 種中藥活性成分可以與硼砂或鋁離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，使反應(yīng)體系的熒光顯著增強(qiáng)。

其次，通過實(shí)驗(yàn)探索中藥材有效組分的最佳測(cè)定條件，可運(yùn)用緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH，以減小環(huán)境因素的影響。崔香等[30]將青海大黃作為實(shí)驗(yàn)材料，在不同pH 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中加入一定質(zhì)量濃度的青海大黃水浸液后對(duì)其進(jìn)行熒光掃描。結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度隨大黃水浸液質(zhì)量濃度的減小而減小，熒光強(qiáng)度與其質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系。當(dāng)緩沖溶液的pH 為2.6～4.2 時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著pH的增大而增大；當(dāng)緩沖溶液的pH 為4.2～5.8 時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著pH 的增大而減??；當(dāng)緩沖溶液的pH為4.8～5.2 時(shí)，熒光強(qiáng)度幾乎不變。該實(shí)驗(yàn)確定了大黃水浸液三維熒光圖譜的測(cè)定條件，為其有效成分的定量分析提供了新方法。

第三，結(jié)合并改進(jìn)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，提高對(duì)復(fù)雜物質(zhì)的解析能力。三維熒光技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法避免了繁瑣的物理分離步驟，有助于改善復(fù)雜體系中存在的干擾和組分光譜重疊引起的難以分辨和定量分析問題，在中藥材的定性定量分析中具有廣闊的前景。

5 三維熒光技術(shù)的前沿應(yīng)用及對(duì)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的指導(dǎo)

三維熒光技術(shù)檢測(cè)快速、預(yù)處理簡(jiǎn)單、靈敏度較高、選擇性良好，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、能源、環(huán)境、食品等各個(gè)領(lǐng)域，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的應(yīng)用中起指導(dǎo)作用。

5.1 能源利用

通過對(duì)油氣和煤炭等重要能源物質(zhì)進(jìn)行光譜信息采集和分析，對(duì)能源勘探和利用提供了科學(xué)支持。沈海東等[31]利用三維熒光技術(shù)對(duì)不同類型樣品進(jìn)行光譜分析，發(fā)現(xiàn)熒光光譜強(qiáng)度與芳烴含量成正比，對(duì)此可在鉆井剖面連續(xù)進(jìn)行三維熒光光譜分析，根據(jù)熒光強(qiáng)度的逐漸變強(qiáng)與變?nèi)跽页鲇蜌獬墒於冉缑?，展現(xiàn)了三維熒光光譜技術(shù)在油氣勘探中具有良好的應(yīng)用前景。范俊佳等[32]通過三維熒光技術(shù)分析采自沁水盆地及淮北煤田的煤巖樣品的光譜特征，研究了煤巖三維熒光光譜特征與鏡質(zhì)體反射率之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明，三維熒光技術(shù)可以高效快速地評(píng)價(jià)煤巖成熟度，而且不受煤巖中鏡質(zhì)組分含量限制，在煤巖成熟度的確定方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

5.2 環(huán)境監(jiān)測(cè)

水體中由于不同有機(jī)污染物存在而產(chǎn)生特征熒光光譜，成為了判斷水體污染情況的重要依據(jù)。王彥青[33]引進(jìn)三維熒光技術(shù)輔助水資源的污染檢測(cè)工作，并采用三維熒光光譜法與傳統(tǒng)方法針對(duì)同一污水進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三維熒光光譜法針對(duì)污水的有害物質(zhì)檢測(cè)正確率平均值可達(dá)到86.3%，而傳統(tǒng)檢測(cè)正確率的平均值為78.0%，三維熒光光譜法檢測(cè)正確率明顯高于傳統(tǒng)方法，因此，驗(yàn)證了該方法的有效性。左兆陸等[34]基于三維熒光技術(shù)，以土壤中常見石油類制品為研究對(duì)象，分別提取不同土壤樣本中石油類制品的三維熒光光譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)土壤中石油制品進(jìn)行分類，綜合識(shí)別率達(dá)到95.6%。實(shí)驗(yàn)證明了基于三維熒光技術(shù)直接從油污土壤中識(shí)別污染油的可行性，為識(shí)別土壤中油類污染物提供了技術(shù)支持。

5.3 食品安全

熒光靈敏的響應(yīng)和快速無損的測(cè)定過程，為食品安全快速監(jiān)測(cè)提供了有效途徑。叢琳[35]研究了蜂蜜的三維熒光光譜特性，基于三維熒光光譜的蜂蜜摻假智能檢測(cè)算法，構(gòu)建了蜂蜜摻假智能檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，為實(shí)現(xiàn)蜂蜜摻假的快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了有力的手段。劉雪茹等[36]將三維熒光技術(shù)應(yīng)用于黃瓜表面微生物數(shù)量的快速檢測(cè)，有助于實(shí)現(xiàn)黃瓜貯藏過程中品質(zhì)變化的快速監(jiān)控，并為預(yù)判黃瓜腐敗提供了依據(jù)。

三維熒光技術(shù)在其他領(lǐng)域的成功應(yīng)用可為中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供借鑒，其在中藥研究領(lǐng)域的巨大作用也得到不斷的發(fā)掘和應(yīng)用。

6 研究前景展望

三維熒光技術(shù)已經(jīng)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方面得到了重視，這說明其在中藥研究領(lǐng)域具有巨大發(fā)展?jié)摿蛷V闊應(yīng)用前景。目前來看，三維熒光技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方面的發(fā)展主要體現(xiàn)在以下3 個(gè)方面：1）三維熒光技術(shù)與其他分析技術(shù)聯(lián)用，用于中藥制品的檢測(cè)。聯(lián)用技術(shù)已成為檢測(cè)的一種必然趨勢(shì)，有文獻(xiàn)報(bào)道三維熒光技術(shù)與紅外光譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等分析技術(shù)聯(lián)合用于中藥注射劑的檢測(cè)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，便于對(duì)復(fù)雜體系進(jìn)行分析[37]。2）利用三維熒光技術(shù)進(jìn)行中藥藥性模式識(shí)別。中藥中大部分分子能夠產(chǎn)生熒光，因此，針對(duì)中藥三維熒光光譜特征，從中藥藥性的角度出發(fā)，可構(gòu)建各類中藥熒光光譜分類模型，對(duì)中藥進(jìn)行分類識(shí)別研究[38]。先進(jìn)儀器技術(shù)的引入將極大助力中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究，進(jìn)一步促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。3）三維熒光技術(shù)硬件與軟件的開發(fā)。在保證準(zhǔn)確性和可靠性的前提下，研發(fā)新的化學(xué)儀器，以提高檢測(cè)效率；構(gòu)建中藥三維熒光指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，開發(fā)相應(yīng)軟件，集數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)擬合和處理于一體，更加簡(jiǎn)便、直觀地獲得并篩選所需信息，以便推廣使用。