沈友進(jìn) 戚曉昆 周宗華 何建文

1.廣東省肇慶市德慶縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東肇慶 526600；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科，北京 100048

腦卒中是一種古老的人類(lèi)疾病，它嚴(yán)重影響了人們的生活[1]。腦卒中是導(dǎo)致人類(lèi)長(zhǎng)期殘疾的主要原因，也是全球第二大死亡原因[2]。腦梗死是腦卒中的最主要類(lèi)型。目前被循證醫(yī)學(xué)證實(shí)有效的腦梗死急性期治療方法只有靜脈溶栓和機(jī)械取栓。然而，這兩種方法只能用于急性期少數(shù)患者的治療，且有時(shí)間窗限制。為了增加時(shí)間窗、減少副作用及提高預(yù)后，迫切需要尋找新的治療腦梗死的方法。由于其具有神經(jīng)保護(hù)、分泌生長(zhǎng)因子及替代受損的神經(jīng)細(xì)胞等多重治療功能，神經(jīng)干細(xì)胞移植治療引起了人們極大的興趣[2]。神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中最原始未分化的細(xì)胞，可以產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中特異性的細(xì)胞。在一定的條件下，神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等，它具有自我更新能力。與傳統(tǒng)藥物治療不同，神經(jīng)干細(xì)胞可以對(duì)環(huán)境變化作出持續(xù)反應(yīng)，分泌適當(dāng)數(shù)量和類(lèi)型的信號(hào)分子，故可以對(duì)不同的腦損傷作出相應(yīng)的反應(yīng)[3]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床前試驗(yàn)均顯示神經(jīng)干細(xì)胞在腦梗死的治療中具有巨大的潛力。因此，本文從神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源、治療腦梗死的機(jī)制、目前存在的問(wèn)題等新進(jìn)展方面進(jìn)行綜述。

1 神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源

目前神經(jīng)干細(xì)胞主要來(lái)源于胎兒腦組織、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。自從Thomson 于1998 年從人類(lèi)囊胚中建立了胚胎干細(xì)胞系以來(lái)，很多機(jī)構(gòu)也陸續(xù)從人類(lèi)、鼠類(lèi)和其他靈長(zhǎng)類(lèi)的胚胎中成功分離、培養(yǎng)并建立了胚胎來(lái)源的可長(zhǎng)期繁殖的神經(jīng)干細(xì)胞系[2]。胚胎干細(xì)胞來(lái)源于囊胚的內(nèi)部細(xì)胞群，可以產(chǎn)生能分化為任何體細(xì)胞類(lèi)型的前體細(xì)胞。理論上，胚胎干細(xì)胞可以無(wú)限增殖，因而人們可以獲得大量的神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)滿足臨床干細(xì)胞移植治療的需要，這是比胎兒來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)的地方。但是，需要大量的操作才能使胚胎干細(xì)胞完全分化為神經(jīng)干細(xì)胞。

胎兒來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞是進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦梗死的一種重要來(lái)源。胚胎來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞從受孕后7 至21 d 胎兒的腦皮質(zhì)、中腦、脊髓組織中分離產(chǎn)生[4]。這些神經(jīng)干細(xì)胞可以通過(guò)在含有堿性成纖維生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)傳代[5]。

最近發(fā)現(xiàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)，成年體細(xì)胞能夠被重新編程逆分化為多能干細(xì)胞[6]。同胚胎干細(xì)胞類(lèi)似，這些逆分化的多能干細(xì)胞具有可塑性和神經(jīng)分化潛能[7]，被稱作誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。而相應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞被稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞。許多體細(xì)胞類(lèi)型（包括容易從活組織檢查中獲得的成纖維細(xì)胞）都已經(jīng)被重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。因而，由于能夠直接從患者自身的體細(xì)胞中獲得，避免同種異體移植相關(guān)的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞具有治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的巨大潛力。

2 神經(jīng)干細(xì)胞的作用機(jī)制

神經(jīng)干細(xì)胞移植可以通過(guò)多種機(jī)制治療腦梗死。神經(jīng)干細(xì)胞能夠保護(hù)受損的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖與遷移，促進(jìn)突觸重塑，刺激新生血管形成，以及整合到主神經(jīng)回路（同提高認(rèn)知和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)），從而恢復(fù)受損的神經(jīng)功能，達(dá)到治療腦梗死的目的[8]。然而，究竟是哪一種機(jī)制在有效恢復(fù)神經(jīng)功能中起主要作用尚需進(jìn)一步研究。

2.1 免疫調(diào)節(jié)

腦卒中后腦損傷是通過(guò)激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫和炎癥反應(yīng)來(lái)傳播的。激活的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上的單核細(xì)胞趨化蛋白-1 及細(xì)胞因子配體-1 等細(xì)胞因子的表達(dá)，通過(guò)血腦屏障促進(jìn)外周單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而加劇炎癥損傷[9]。腦梗死患者進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植，可以抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高患者的治療效果[10]。新近研究表明，促炎因子S100A9 有助于克服急性炎癥反應(yīng)，提高神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的效果[11]。

2.2 神經(jīng)可塑性與神經(jīng)重構(gòu)

多年以來(lái)，人們認(rèn)為成年腦細(xì)胞無(wú)再生潛能，腦損傷或患病后損傷的神經(jīng)元不能再生。然而，近年來(lái)人們?cè)诔赡瓴溉閯?dòng)物腦內(nèi)室管膜下區(qū)和海馬齒狀回發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞存在[12]。腦卒中后室管膜下區(qū)和海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生明顯增加，但這些再生的神經(jīng)細(xì)胞仍然較少，不足以恢復(fù)損傷的神經(jīng)組織功能。雖然有證據(jù)表明這些新生的神經(jīng)細(xì)胞可以整合進(jìn)內(nèi)源神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮功能，但是大約80%的新生神經(jīng)母細(xì)胞和神經(jīng)元在形成后2 周內(nèi)死亡[13]。因而，增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生以代替丟失的神經(jīng)細(xì)胞一直是腦卒中治療的一個(gè)令人興奮的治療靶點(diǎn)[14]。

腦卒中后1 個(gè)月內(nèi)患者表現(xiàn)出肢體功能、語(yǔ)言和認(rèn)知功能方面不同程度的自發(fā)恢復(fù)。這種現(xiàn)象在很大程度上歸因于神經(jīng)回路的重新建立，在遠(yuǎn)離腦梗死區(qū)的其他腦區(qū)運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)回路的活動(dòng)得到增強(qiáng)。這種神經(jīng)重構(gòu)通過(guò)改變軸突、樹(shù)突和突觸的結(jié)構(gòu)以及增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的活性來(lái)調(diào)節(jié)。一些臨床前動(dòng)物模型已經(jīng)證明，腦卒中后神經(jīng)干細(xì)胞移植可以增強(qiáng)突觸重構(gòu)[15]。一項(xiàng)研究中，小鼠神經(jīng)干細(xì)胞系移植到腦實(shí)質(zhì)后，腦卒中患者腦中的突觸發(fā)生標(biāo)志物突觸素和突觸生長(zhǎng)錐蛋白GAP-43 表達(dá)增加，其中部分是由移植細(xì)胞本身所表達(dá)的[16]。

神經(jīng)干細(xì)胞移植促進(jìn)血管生成，幫助腦卒中患者恢復(fù)功能。腦卒中后，局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞之間的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及再生因子進(jìn)行交換，刺激血管生成。神經(jīng)和血管部分進(jìn)行交互反應(yīng)，促進(jìn)臨床前期腦卒中模型和人類(lèi)卒中患者的血管生成，改善腦卒中患者的神經(jīng)功能[17]。總之，神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦梗死引起新血管形成，這是腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞移植介導(dǎo)神經(jīng)組織和功能恢復(fù)的一個(gè)主要機(jī)制。

2.3 神經(jīng)細(xì)胞替代

通過(guò)腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞移植，以健康個(gè)體腦中的神經(jīng)細(xì)胞代替損傷壞死的神經(jīng)細(xì)胞，是一個(gè)非常有吸引力的治療方法。干細(xì)胞移植后，健康的神經(jīng)干細(xì)胞植入受損區(qū)，分化成神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，重新建立突觸聯(lián)系[18]。研究證明，腦梗死損傷后腦中移植的神經(jīng)干細(xì)胞最終分化為神經(jīng)元，這些神經(jīng)元表達(dá)NeuN、HuD、MAP-2 及β3 微管蛋白等神經(jīng)元標(biāo)志物[19-21]。然而，神經(jīng)干細(xì)胞植入受損神經(jīng)組織后，整合進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞少、壽命短，需要反復(fù)多次移植，都是目前需要解決的問(wèn)題。

3 存在的問(wèn)題

目前，在神經(jīng)干細(xì)胞移植被廣泛應(yīng)用于臨床腦卒中治療之前，仍有許多問(wèn)題需要解決。在腦卒中環(huán)境中，血腦屏障受到損害，其通透性發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，導(dǎo)致全身免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。這就提出了腦卒中異體神經(jīng)干細(xì)胞移植的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的問(wèn)題。為克服免疫反應(yīng)，同種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞更具有潛在優(yōu)勢(shì)。然而，如果需要大量的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，使用目前的技術(shù)生產(chǎn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行安全測(cè)試，需要大量的時(shí)間。而這很可能超過(guò)了疾病治療最佳效果的時(shí)間窗。目前還不清楚其他因素如卒中類(lèi)型、卒中部位及嚴(yán)重性對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞移植成功的影響程度。另外，腦卒中患者常見(jiàn)的共患?。ū热缣悄虿『透哐獕翰〉龋?、年齡及性別因素對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦卒中的影響尚沒(méi)有或僅有有限的評(píng)估[22-23]。

盡管許多腦卒中神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的臨床前期研究取得了良好的效果，一些安全問(wèn)題也必須得到妥善處理。一項(xiàng)研究中，研究者在小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后24 h 將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植到同側(cè)紋狀體，發(fā)現(xiàn)了移植細(xì)胞的腫瘤發(fā)生[24]。

為了使臨床前期神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦卒中的成功進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)，必需對(duì)移植途徑、移植劑量和治療時(shí)間窗等臨床因素進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.1 移植途徑

神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦梗死有多種移植方式，如立體定向直接移植到腦實(shí)質(zhì)、經(jīng)穿刺移植到腦室或椎管中、經(jīng)鼻腔途徑，以及經(jīng)靜脈或動(dòng)脈途徑輸入等。目前以立體定向經(jīng)腦實(shí)質(zhì)移植和經(jīng)靜脈途徑移植最常見(jiàn)。在臨床前期腦卒中動(dòng)物模型中，立體定向經(jīng)腦實(shí)質(zhì)多點(diǎn)注射是最常用的移植方式。它有很多優(yōu)點(diǎn)，如注射位點(diǎn)特異、直接移植的神經(jīng)干細(xì)胞不通過(guò)血腦屏障，可以保證大量的神經(jīng)干細(xì)胞到達(dá)損傷部位，限制治療目標(biāo)外的潛在影響（例如阻塞非靶器官的微血管導(dǎo)致缺血事件）。其最大障礙是需要高度侵襲性的顱骨切除術(shù)，這可能導(dǎo)致已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷的腦卒中患者出現(xiàn)額外的并發(fā)癥。然而，另外兩個(gè)臨床試驗(yàn)測(cè)試了神經(jīng)干細(xì)胞和成人干細(xì)胞經(jīng)腦實(shí)質(zhì)移植的安全性及有效性。結(jié)果表明，這種移植方式不良反應(yīng)少，一般是安全的，患者耐受性好，值得進(jìn)一步臨床研究[3,25]。

另一種常用移植方式是經(jīng)靜脈途徑輸入。這種方式一般侵襲性小，不需較高的技術(shù)要求。在腦卒中急性期，患者病情尚不穩(wěn)定而不能進(jìn)行經(jīng)腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療，這時(shí)經(jīng)靜脈輸入神經(jīng)干細(xì)胞治療就成為可能。因此，醫(yī)務(wù)人員可以在急救車(chē)去醫(yī)院的路上給予神經(jīng)干細(xì)胞靜脈輸入治療。在一些神經(jīng)外科技術(shù)欠發(fā)達(dá)的偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)也可以采用這種方式治療。然而，經(jīng)靜脈輸入移植由于細(xì)胞在非靶器官（如肺部和肝臟等）中聚集的傾向，導(dǎo)致腦中的移植細(xì)胞非常少[26]。靜脈輸入神經(jīng)干細(xì)胞可以起到神經(jīng)保護(hù)作用，提高神經(jīng)功能，但沒(méi)有腦卒中患者腦中移植細(xì)胞存活的依據(jù)。這表明抗炎和再生營(yíng)養(yǎng)因子的釋放是經(jīng)靜脈輸入干細(xì)胞移植治療策略的主要機(jī)制[27]。

經(jīng)鼻腔移植是另外一種極具潛力的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦卒中的方法[28]。經(jīng)鼻腔移植操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)患者損傷較小，神經(jīng)干細(xì)胞可以繞過(guò)血腦屏障，極大地提高了進(jìn)入腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量。

神經(jīng)干細(xì)胞移植的其他方式，如經(jīng)穿刺移植到腦室或椎管中、經(jīng)動(dòng)脈途徑輸入等，目前使用相對(duì)較少，有些還處在探索階段。總之，發(fā)展有效的、可應(yīng)用于臨床的腦卒中后神經(jīng)干細(xì)胞治療方式必須考慮到安全問(wèn)題和臨床療效等問(wèn)題。

3.2 治療時(shí)間窗和劑量

在嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型中，人們對(duì)廣泛的神經(jīng)干細(xì)胞治療時(shí)間窗進(jìn)行了評(píng)估，時(shí)間窗范圍從再灌注后立即移植至腦卒中后4 周。在這些臨床前期研究中，治療時(shí)間窗通常由預(yù)期的治療作用模式?jīng)Q定。如果主要目的是最大化移植的神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用，移植常常選擇在腦卒中急性期進(jìn)行，這時(shí)腦梗死尚未完全形成，組織尚可以被挽救[29]。一項(xiàng)在慢性腦卒中患者中進(jìn)行成人干細(xì)胞移植的臨床試驗(yàn)中，這些慢性腦卒中患者在移植前神經(jīng)功能評(píng)分穩(wěn)定，移植后，通過(guò)成人干細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)和再生機(jī)制，其平均評(píng)分顯著改善[25]。這表明，腦卒中幾個(gè)月后，神經(jīng)組織重構(gòu)仍可能處于活躍狀態(tài)，干細(xì)胞治療可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)加強(qiáng)組織重構(gòu)。相反，為達(dá)到細(xì)胞替代的目的，把細(xì)胞毒性較弱的亞急性期至慢性期作為時(shí)間點(diǎn)或許對(duì)干細(xì)胞移植更有利，可以提高移植細(xì)胞的長(zhǎng)期存活率[30]。另一個(gè)值得臨床進(jìn)一步研究的技術(shù)考慮是最佳的神經(jīng)干細(xì)胞移植劑量。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物研究中，腦實(shí)質(zhì)移植的細(xì)胞劑量范圍是1.0×105個(gè)至4.5×105個(gè)細(xì)胞，移植1 至3 個(gè)位點(diǎn)；靜脈輸入移植的細(xì)胞劑量范圍是3.0×106個(gè)至4.0×106個(gè)細(xì)胞，一次性輸入。沒(méi)有證據(jù)表明移植方案之間存在結(jié)果差異。同時(shí)研究表明，移植更多的神經(jīng)干細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致腦中出現(xiàn)更多的移植細(xì)胞，也不會(huì)增加神經(jīng)細(xì)胞分化[30]。

3.3 局部微環(huán)境的影響

局部微環(huán)境在干細(xì)胞移植治療腦梗死中起著非常關(guān)鍵的作用。為了研究腦梗死亞急性及慢性期干細(xì)胞移植后的微環(huán)境變化，研究人員將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)介入方式從大腦中動(dòng)脈移植到腦梗死部位。干細(xì)胞移植后糖代謝明顯升高，且神經(jīng)功能評(píng)分明顯提高。蛋白組學(xué)分析顯示，共有39 個(gè)在亞急性和慢性期差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)參與了包括神經(jīng)元存活、軸突重塑、抗氧化應(yīng)激和線粒體功能恢復(fù)等各種缺血性卒中相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程[31]。一項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)局部低溫的方式提供一種微環(huán)境來(lái)研究對(duì)干細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，治療性低溫上調(diào)了Micro 1 蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了缺血性卒中干細(xì)胞移植后的神經(jīng)保護(hù)作用[32]。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)輸注干細(xì)胞分泌的胞外囊泡（也叫外泌體）是一種很有希望治療腦卒中的方法。胞外囊泡通過(guò)細(xì)胞通訊、調(diào)節(jié)微環(huán)境等方式促進(jìn)腦神經(jīng)的恢復(fù)[33]。雖然人們對(duì)腦梗死干細(xì)胞移植時(shí)局部微環(huán)境的研究較多，但最佳的局部微環(huán)境尚未知。

4 小結(jié)

神經(jīng)干細(xì)胞移植為腦梗死提供了一種很有前景的治療方法。通過(guò)抗炎、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)形成、促進(jìn)血管新生、促進(jìn)突觸重構(gòu)、細(xì)胞替代等作用機(jī)制，腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞移植發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，減少繼發(fā)性損傷，繼而促進(jìn)神經(jīng)組織及功能的恢復(fù)。雖然腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞移植治療在臨床前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了可喜的效果，但仍存在很多問(wèn)題有待解決。未來(lái)我們應(yīng)從增強(qiáng)腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的效果、提高治療安全性、減少不良反應(yīng)、尋找最佳治療時(shí)間窗等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究。