王揚 鄭素軍 段鐘平

核苷(酸)類似物(NAs)作用于HBV聚合酶區(qū)，抑制HBV復制，廣泛應用于慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒治療，長期治療可以改善肝臟組織學病變并降低肝癌發(fā)生風險。但是，由于cccDNA在感染肝細胞核內的持續(xù)存在，HBV感染并不能被完全清除[1]。然而，相關研究表明[2]，NAs長期治療可能減少含pgRNA的衣殼進入肝細胞核對cccDNA儲存庫進行補充，cccDNA會逐步耗竭，NAs每治療一年可能使cccDNA定量下降約1 log值，因此長期治療最終實現(xiàn)停藥具有理論可行性。臨床實踐中，部分患者停藥后發(fā)生病毒反彈，監(jiān)測cccDNA水平可以為NAs安全停藥提供有益的幫助。但是，一方面由于肝組織活檢的侵襲性，肝內cccDNA定量檢測作為常規(guī)檢測并不現(xiàn)實，另一方面，cccDNA檢測缺乏標準化的量化方法，而且操作過程復雜繁瑣，因此有必要開發(fā)無創(chuàng)性的替代標記物來監(jiān)測cccDNA的數(shù)量或活性。越來越多的研究表明，血清HBV RNA可以作為反映cccDNA轉錄活性的一個新的生物標記物，尤其在HBV DNA檢測不出的CHB患者更是彰顯了其優(yōu)越性。本文就血清HBV RNA在CHB患者NAs治療停藥中的潛在應用價值作一綜述。

一、HBV RNA在病毒生命周期中的來源及功能

HBV生命周期開始于病毒與肝細胞表面牛磺膽酸鈉協(xié)同轉運多肽(NTCP)受體結合，將含有松弛環(huán)狀DNA(viral relaxed circular DNA, rcDNA)的核衣殼釋放到肝細胞內，rcDNA進一步被運輸?shù)郊毎?，進而被轉化成核小體修飾的cccDNA。cccDNA作為病毒轉錄模板，產(chǎn)物包括3.5 kb的PreC mRNA(pcRNA)和前基因組RNA(pgRNA)，2.4 kb和2.1 kb的S mRNA以及0.7 kb的X mRNA。

pgRNA是乙型肝炎病毒逆轉錄的模板。在衣殼內，聚合酶將pgRNA反轉錄為rcDNA，然后在內質網(wǎng)膜上由包膜蛋白包裹后，分泌病毒顆粒至細胞外，或重新進入細胞核補充cccDNA儲存池。除rcDNA外，病毒反轉錄還可以產(chǎn)生雙鏈線性DNA，這種DNA可以作為病毒DNA分泌，也可以進入細胞核形成cccDNA。有研究表明，雙鏈線性DNA可以隨機整合到宿主基因組中，致使染色體不穩(wěn)定性增加、HBV基因和HCC相關宿主基因發(fā)生插入性突變，促進HCC的發(fā)生[3-4]。整合的HBV DNA雖然不能產(chǎn)生具有病毒復制能力的pgRNA，但是可以作為S mRNA的轉錄來源，增加HBsAg的表達水平[5]。

血清和配對肝組織中HBV RNA深度測序結果表明，病毒準種之間的復雜性和平均遺傳距離非常相近[6]，提示血清中的HBV RNA可能來自受感染的肝細胞，但是HBV RNA進入循環(huán)的機制尚未完全清楚。為了確認外周檢測到RNA的種類，Wang等[7-8]設計的RT-PCR分別檢測總HBV RNA和3.5kb RNA，結果提示二者拷貝數(shù)近似，進一步設計3.5kb HBV RNA和pcRNA特異性引物后擴增，排除pcRNA后結果與此類似，證實外周檢測到的HBV RNA主要來源于pgRNA，并進一步證實pgRNA主要以片段化或剪接體形式存在。同時也有研究結果顯示[9-10]，感染HBV的離體細胞可以分泌大量無包膜蛋白的裸衣殼，其中包括有pgRNA在內所有類型的復制中間產(chǎn)物。pgRNA反轉錄為rcDNA，包被表面蛋白后以Dane顆粒的形式分泌到外周血中，但同時也有研究發(fā)現(xiàn)[11]，部分含pgRNA的衣殼能夠在成熟前釋放到外周血中，可能是宿主對抗HBV感染的防御機制之一。因此，需要更多的研究來描述HBV RNA病毒顆粒在慢性HBV感染中的生物學機制。

二、血清HBV RNA在NAs停藥中作用研究

國際主流的HBV管理指南對于NAs停藥的推薦建議包括[12-14]：無肝硬化HBeAg陰性患者治療至少2～3年，達到持續(xù)的病毒抑制；對于HBeAg陽性者發(fā)生血清學轉換、HBV DNA持續(xù)監(jiān)測陰性且經(jīng)至少12個月鞏固治療，停藥后均需密切監(jiān)測隨訪。但是，這些推薦建議并不一致并且遠未滿足臨床實踐需求。

HBV RNA是從cccDNA轉錄而來，所以理論上HBV-RNA的水平可能可直接反映cccDNA水平。既往的小隊列研究結果表明[7,15-17]，外周循環(huán)HBV RNA與肝細胞中的cccDNA存在正相關，可被視為cccDNA的替代標志物，有可能用于預測治療后的應答及指導NAs的安全停藥。Masataka等在36例患者的隊列研究中[18]，應用NAs平均治療時間36周，停藥24周后，52.8%(19/36)的患者出現(xiàn)病毒學反彈，多變量分析結果表明，治療第3個月的HBV DNA+RNA滴度與病毒學反彈獨立相關(OR：9.474，P=0.043)。國內Wang等在33例患者的隊列研究中[7]，所有患者治療結束時HBV DNA檢測不出，停藥后隨訪24周，HBV RNA陽性患者發(fā)生病毒學反彈比率顯著高于HBV RNA陰性患者,且二者差異具有統(tǒng)計學意義(21/21, 100%比3/12, 25%;P=0.001)，推測HBV RNA水平可能與NAs停藥后的病毒學反彈相關并且可能成為安全停藥的生物學標志物。

Fan等[19]多中心、前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，在評估隊列中，HBeAg(+)患者在NAs治療結束4年后，HBV DNA和HBV RNA(DNA-/RNA-)雙陰性的患者臨床復發(fā)(定義為HBV DNA>2 000 IU/mL并且ALT>2 ULN)風險，顯著低于HBV DNA或HBV RNA單陽性的患者(分別為2/35, 8%和32/102, 31.4%,P=0.018)。在驗證隊列，隨訪5.5年，DNA-/RNA-雙陰性的患者臨床復發(fā)風險仍然低于HBV DNA或HBV RNA單陽性的患者(分別為2/13, 15.4%和9/27, 33.3%,P=0.286)，但差異無統(tǒng)計學意義。這些結果提示，HBV RNA陰性患者復發(fā)風險明顯低于HBV RNA陽性患者人群。進一步多變量分析發(fā)現(xiàn)，HBV DNA和RNA水平是臨床復發(fā)的獨立預測因子，HBV DNA或HBV RNA任一陽性患者的臨床復發(fā)風險為DNA-/RNA-雙陰性患者的4.54倍(95%CI：1.09～19.00,P=0.038)。這些分析表明，非肝硬化HBeAg(+)患者HBV核酸雙重陰性是指導NAs停藥的有效生物標記物。作者同時比較了停藥時HBV RNA、HBV DNA和HBsAg定量預測臨床復發(fā)的ROC曲線下面積，發(fā)現(xiàn)HBV RNA分別高于HBV DNA和HBsAg定量(三者分別為0.732、0.630和0.543)，故作者建議未來研究使用HBV總核酸水平(總HBV DNA和RNA)作為指導HBeAg(+)患者NAs停藥的生物標志物。

三、血清HBV RNA與其他NAs停藥潛在標志物的相關性

目前認為有潛在價值的停藥標志物包括cccDNA、HBV DNA、HBsAg、HBcrAg、anti-HBc等。理論上，初治患者血清中HBV DNA和RNA均可反映cccDNA轉錄活性，然而CHB患者在NAs治療后，pgRNA反轉錄被抑制，HBV DNA水平下降，而RNA卻長期持續(xù)存在，這使其成為比HBV DNA更有效、更直接反映cccDNA活性的標志物。Wang等的體外研究中，血清HBV RNA與cccDNA水平顯著相關，而Allweiss等使用PegIFN降低cccDNA活性后發(fā)現(xiàn)，二者不具有顯著的相關性，作者認為二者相關性可能受到HBeAg狀態(tài)的影響[16,20]。國內張文宏等[6]的研究中，患者血清HBV RNA與cccDNA水平無顯著相關，但與肝內HBV RNA/cccDNA比值顯著相關，推測血清HBV RNA水平更多反映cccDNA的轉錄活性，而非數(shù)量上的相關。

血清HBV RNA與多個病毒學標志物均存在不同程度的相關性。多個研究表明，未經(jīng)治療患者血清HBV RNA與HBV DNA之間存在高度的線性正相關[21-23]。van Bommel等[24]同時證明，NAs治療后血清HBV RNA與HBV DNA仍然相關，但相關性較前減弱。在未經(jīng)治療患者中，有研究顯示HBeAg陰性患者血清HBV RNA和DNA的相關系數(shù)高于HBeAg陽性患者(r=0.741和r=0.532，P<0.001)[25]。但van Campenhout等[26]認為HBV RNA與DNA之間的相關性在HBeAg陽性和陰性患者中類似。這種差異可能是樣本量、患者臨床特征差異或采用的HBV RNA定量方法不同導致。

血清中HBV RNA與HBsAg定量之間的相關性，目前研究結果尚存在分歧。有研究表明，HBV RNA與HBsAg之間存在顯著的線性正相關，但在HBeAg陰性患者亞組分析中，這種線性相關性未得到進一步確認[22]。而在新近的研究中，HBV RNA與HBsAg之間的線性相關性未能得到進一步的證實[27]，這種差異可能是由于樣本量或是患者異質性導致。一項納入11項研究、含1 716例患者來研究HBsAg定量在NAs停藥中的作用，薈萃分析結果表明[28]，NAs中位治療時間及鞏固治療時間分別為56.12個月和36.7個月，停藥12月后，HBsAg定量<100 IU/mL和>100 IU/mL患者的病毒學反彈率分別為9.1%～19.6%和31.4%～63.6%，隨訪39個月后，HBsAg陰轉比率分別為21.1%～58.8%和3.3%～7.4%。

新近有研究表明[29]，外周循環(huán)中HBcrAg水平可以作為指導NAs停藥的新型生物標志物。究其原因，一方面HBcrAg檢測包含核心抗原、HBeAg和22 kDa截斷的前核心蛋白的總和，有研究認為其與cccDNA的相關性優(yōu)于HBV RNA和HBsAg[30]，另一方面，有研究表明NAs治療過程中，血清HBcrAg和HBV RNA水平顯著正相關并且具有類似的下降特征[27]，同時在HBeAg陰性患者中，停止治療時HBcrAg>3.7 log IU/mL患者，停藥1年病毒學復發(fā)風險較低水平患者增加3.7倍(95%CI：1.187～11.856; P =0.024)[31]。Ivana等[1]研究19例NAs長期治療達到HBsAg陰轉后停藥患者的隨訪顯示，11%(2/19)患者停藥后出現(xiàn)病毒學反彈，停藥前及停藥后2例患者均檢測不出HBcrAg，但在停藥時仍可檢測到pgRNA，停藥后pgRNA水平進一步升高，提示HBV RNA指導停藥較HBcrAg可能更有優(yōu)勢，但樣本量明顯較少?？?HBc定量在停藥中的研究較少，Heng等研究顯示[32]，100例患者NAs停藥后隨訪1.0～3.5年，39例患者發(fā)生臨床復發(fā)，高滴度抗-HBc患者的復發(fā)風險比是低滴度患者的0.31倍(95%CI：0.15～0.65,P=0.002)?？傊?，究竟哪一個標志物對停藥后的應答預測更優(yōu)、現(xiàn)有標志物如何聯(lián)合使用及其價值有待于進一步研究確認。

NAs安全停藥是CHB管理中的研究熱點之一。雖然完全清除cccDNA的療法可能會在不久的將來出現(xiàn)，但目前的臨床實踐中同樣需要簡單易行、安全的停藥標準。目前的臨床研究提出了包括HBV RNA在內等潛在可能用于臨床實踐的生物學標志物，然而，目前尚無統(tǒng)一標準的檢測方法或可用的商品化檢測試劑盒，其次，盡管決定HBV RNA水平的主要因素是cccDNA水平，但血清中HBV RNA水平仍然可能受HBV感染階段、病毒基因型和pgRNA剪接變異體等因素的影響[10]。聯(lián)合檢測HBcrAg、HBsAg、抗-HBc和HBV RNA定量，并優(yōu)化其組合方案來指導安全停藥仍需要進一步研究。