劉興遠(yuǎn) 白彬

肝纖維化是在多種致病因素作用下引起的肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的異常沉積所致的病理過程。而ECM主要由活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)轉(zhuǎn)化而成的肌成纖維樣細(xì)胞所分泌的。microRNA (miRNA)是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，近些年發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與了HSCs的活化、增殖以及凋亡，并在其中起到了重要的調(diào)控作用。因此研究miRNA在HSCs中的作用可以為尋找診斷和評(píng)估肝纖維化的指標(biāo)，以及為研發(fā)治療肝纖維化的的基因靶向治療藥物提供新的靶點(diǎn)和思路。

一、HSCs的概述

HSCs定位于Disse腔內(nèi)，其胞體緊貼肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。HSCs胞質(zhì)內(nèi)有大量的富含維生素A以及甘油三酯等物質(zhì)的脂滴是其具有特征性的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。HSCs具有視黃醇代謝，肝竇血流調(diào)節(jié)，EPO生成等生理功能，除此之外，作為肌成纖維樣細(xì)胞的主要出處，它還在纖維化中起到重要作用[1]。

當(dāng)受到各種損傷因素的刺激后，靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs被激活，進(jìn)而分化為肌成纖維樣細(xì)胞[2]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道稱衰老的HSCs相對(duì)于增殖狀態(tài)的HSCs的增殖能力和產(chǎn)生膠原蛋白的能力減弱。但是同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道稱由肥胖導(dǎo)致的肝纖維化中，HSCs的衰老和肝纖維化水平無(wú)關(guān)[3]在HSCs的衰老對(duì)于肝纖維化的影響現(xiàn)在還存在爭(zhēng)議。

二、miRNA對(duì)HSCs的調(diào)控

(一)miRNA促進(jìn)HSCs活化的調(diào)控

1.促進(jìn)活化

TGF所介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在HSCs的活化過程中起到重要的作用，miRNA作為重要的調(diào)控因子作用于TGF-β信號(hào)通路。Xia Xie等[4]通過Gene Expression Omnibus(GEO)篩選出MicroRNA-503，并通過靶基因分析以及相關(guān)信號(hào)通路研究發(fā)現(xiàn),MicroRNA-503可以通過SMAD7作用于HSCs。miR-503/SMAD7可以通過TGF-β/SMAD途徑增強(qiáng)HSCs的活化以及纖維化。Xiutao Fu等[5]通 GEO篩選了正常人，輕度肝纖維化以及晚期纖維化肝臟樣本之間差異性表達(dá)的miRNA為miR-20a-5p。之后他們?cè)诰┒蓟虬倏迫珪?https://www.kegg.jp/ KEGG)中發(fā)現(xiàn)12個(gè)目的基因在TGF-β通路中顯著富集。miR-20a-5p在肝纖維化中的下調(diào)導(dǎo)致TGFβRII激活，進(jìn)而TGF-β信號(hào)通路被激活，隨后激活巨噬細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。

2.抑制活化

PI3K/AKT/mTOR作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路同細(xì)胞的休眠、增殖、癌變和壽命直接相關(guān)。Liang H等[6]利用基因芯片分析，觀察到miR-141是在肝星狀細(xì)胞激活過程中上調(diào)最多的miRNA之一。通過功能分析發(fā)現(xiàn)miR-141抑制了靶基因的表達(dá)，降低了肝星狀細(xì)胞的活性，并且抑制了促纖維化標(biāo)志物的表達(dá)水平。此外miR-141的下調(diào)可以影響AKT/mTOR通路的抑制劑-磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)從而抑制肝星狀細(xì)胞的活化。

核激素受體家族中之一的氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)作為配體誘導(dǎo)核受體，調(diào)控多種代謝。Le Tao[7]通過檢測(cè)慢性乙型肝炎肝硬化患者的肝臟組織發(fā)現(xiàn)，miR-942作為配體誘導(dǎo)受體之一，可以通過抑制過PPARs的基因表達(dá)，阻礙肝星狀細(xì)胞活化的發(fā)生。

Notch信號(hào)通路在脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物大量存在，在進(jìn)化上高度保守，在相鄰細(xì)胞之間發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官的分化和發(fā)育。Juanjuan Li等[8]建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化為體內(nèi)模型以及以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)處理的HSC細(xì)胞系LX-2和HSC-T6為體外模型，發(fā)現(xiàn)，miR-489-3p的過度表達(dá)可以降低JAG1(jagged canonical Notch ligand 1)的表達(dá)，同時(shí)肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)降低，因此得出miR-489-3p的過表達(dá)可以通過JAG1/Notch3通路抑制肝星狀細(xì)胞的活化。

(二)對(duì)HSCs增殖的影響

Wang Z等[9]體內(nèi)外模型中發(fā)現(xiàn)，MiR-203a-p可以直接抑制P66Shc的翻譯，P66Shc的表達(dá)下降可以進(jìn)一步的抑制線粒體中ROS的生成和肝星狀細(xì)胞的增殖。Yong-Zhen Wang等[10]報(bào)道了，TGF-β1通過下調(diào)miR-454的表達(dá)來(lái)促進(jìn)HSC-T6的活化和增殖，從而進(jìn)一步上調(diào)Wnt10a基因的表達(dá)。MiR-454可以通過抑制Wnt10a基因的表達(dá)來(lái)阻止這一過程，從而抑制肝纖維化。

(三)miRNA對(duì)HSCs凋亡的影響

肝纖維化的逆轉(zhuǎn)主要基于HSCs的凋亡。肝細(xì)胞凋亡后，金屬蛋白酶抑制劑的合成減少，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的過程[11]。因此尋找促進(jìn)HSCs凋亡的miRNA是研發(fā)抗纖維化藥物至關(guān)重要的研究。

Xinjie Hao等[12]報(bào)道，經(jīng)過miR-21處理后的LX-2細(xì)胞的IL-6, TNF-a,以及TGF-b1水平升高，α-SMA，I型膠原蛋白的表達(dá)增高，Bax/B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2比率和程序性細(xì)胞死亡4(programed cell death 4,PDCD4)的表達(dá)水平降低。同時(shí)PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)產(chǎn)物減少，PI3K/AKT被促進(jìn)，這表明通過PTEN/PI3K/AKT通路，miR-21可能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。

Xuemin Niu等[13]分析了丙型肝炎病毒誘導(dǎo)的肝硬化患者血清的miRNA的微陣列數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了miR-1273g-3p是上調(diào)最顯著。miR-1273g-3p的表達(dá)上調(diào)可使PTEN的翻譯減少，Col1A1、α-SMA的表達(dá)增加，從而肝星狀細(xì)胞的凋亡減少。

Caspase是可對(duì)天冬氨酸殘基后的肽鍵進(jìn)行特異性切割的蛋白質(zhì)。這一過程可以誘導(dǎo)HSCs凋亡。Jiang Wang等[14]報(bào)道了Caspase-9和PARP通過miR-29b抑制PI3K/AKT通路，從而促進(jìn)HSCs (LX-1, HSC-T6)的凋亡來(lái)預(yù)防肝纖維化。Yang Wang[15]報(bào)道了在非酒精性脂肪性肝病、活化的HSCs和甲硫氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的纖維化小鼠模型中miR-130a-3p低表達(dá)。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)miR-130a-3p的表達(dá)增加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p的過表達(dá)促進(jìn)HSCs的凋亡。

三、基于miRNA靶向HSCs在肝纖維化中的臨床價(jià)值

未經(jīng)治療的肝纖維化最終會(huì)導(dǎo)致肝硬化，并增加患HCC的風(fēng)險(xiǎn)[16]。在7 000人的隊(duì)列中，晚期纖維化的發(fā)生率約為2.8%[17]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA(non-coding RNA)更加豐富的功能。其中，miRNA因其在基因調(diào)控中的作用而成為藥物開發(fā)的可能靶點(diǎn)。

目前基于miRNA的治療主要包括兩類。第一類是miRNA的抑制，類似于反義療法。用合成的單鏈RNA作為目標(biāo)miRNA的互補(bǔ)鏈，進(jìn)而目標(biāo)抑制內(nèi)源性miRNA的作用。另一類是miRNA的代替療法。用人工合成的miRNA的類似物來(lái)模擬內(nèi)源性的miRNA,進(jìn)而使目標(biāo)基因降解或者抑制，從而發(fā)揮沉默作用[18]。

miRNA與mRNA的結(jié)合不是完全的互補(bǔ)配對(duì)，只是部分性的，因此miRNA可以與多種mRNA結(jié)合發(fā)揮作用[18]。Friedman等[19]基于生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)了，超過60%的人類蛋白編碼基因可被miRNA所調(diào)控。因此無(wú)論是在尋找肝纖維化的早期具有特異性和敏感性的診斷指標(biāo)上，還是研發(fā)的抗纖維化的藥物上，miRNA都具有廣闊的前景和價(jià)值。

(一)miRNA在診斷中的作用 在肝纖維化的過程中，肝纖維化的程度和進(jìn)展是衡量診治效果的重要指標(biāo)。肝活檢是診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)。然而肝病理學(xué)檢查是一種價(jià)格相對(duì)高昂的，有多種潛在并發(fā)癥的一種有創(chuàng)操作。肝活檢同時(shí)也受到穿刺者的采樣的誤差以及病理醫(yī)生的分期判斷差異而對(duì)技術(shù)水平有較高的要求。目前已經(jīng)開發(fā)了各種非侵入性診斷工具，其中一些已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)踐，包括血清學(xué)評(píng)分工具，如肝纖維化指數(shù)評(píng)估(ELF)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST/ALT)比率、纖維化-4 (Fib-4)評(píng)分和AST與血小板比率指數(shù)(APRI)，以及一些影像學(xué)工具，如瞬時(shí)彈性成像(FibroScan)、剪切波彈性成像(SWE)和聲輻射力脈沖(ARFI)等[20]。但是這些非侵入性的診斷方法由于其早期的敏感性和特異性較差，無(wú)法滿足臨床診斷的要求。因此，尋找一種無(wú)創(chuàng)且可靠的評(píng)估肝纖維化的方式是目前迫切需要的

血清中的miRNA因?yàn)槠浞€(wěn)定性好，簡(jiǎn)單可重復(fù)性高，現(xiàn)在已經(jīng)成為包括炎癥、腫瘤在內(nèi)的多種疾病的生物標(biāo)志[21,22]。miRNA在血清中以RNA結(jié)合蛋白結(jié)合和脂蛋白復(fù)合物結(jié)合兩種方式，形成囊泡，如外泌體。外泌體與其他細(xì)胞膜接觸融合后將利用外泌體內(nèi)的脂質(zhì)雙分子層膜來(lái)保持miRNA結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，并傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)完成細(xì)胞間的信息交換，從而發(fā)揮對(duì)HSCs活化、增殖的調(diào)節(jié)作用。

MicroRNA-122已被鑒定為各種肝損傷的標(biāo)志物，包括肝炎病毒感染，酒精性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。 來(lái)自肝細(xì)胞的細(xì)胞外miR-122可被傳遞至肝星狀細(xì)胞HSCs，以調(diào)節(jié)其增殖和基因表達(dá)[23]。呂金明等[24]在對(duì)多例慢性乙肝，肝硬化以及早期肝癌患者的研究當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)血清miR122單項(xiàng)檢測(cè)在肝硬化、肝癌早期診斷中有一定價(jià)值,血清miR122聯(lián)合AFP,CEA的診斷效能高于單一指標(biāo)檢測(cè)。

周興蓓[25]對(duì)比了經(jīng)過肝穿刺的慢性乙型肝炎患者和正常人的血清中的miRNA，找出了miRNA-34a和miRNA-337，miRNA-34a和miRNA-26a兩組miRNA可能作為區(qū)分正常人和肝硬化患者以及監(jiān)測(cè)肝硬化進(jìn)展的指標(biāo)。其中第二組miRNA-337的表達(dá)降低與肝癌TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

然而，這些差異性表達(dá)的miRNA譜通常只是考慮的是促使肝纖維化的單一病理因素。在不同患者群體中識(shí)別肝纖維化早期階段的診斷價(jià)值仍有待證明。Joeri Lambrech等[26]找出了4個(gè)與HSCs相關(guān)的miRNA，Let-7f-5p和miRNA-378a-3p，miRNA-451a, miRNA-142-5p, 建立了miRFIB評(píng)分。miRFIB評(píng)分與PDGFRβ水平的結(jié)合可以顯著提高在異質(zhì)性肝纖維化患者中的診斷效能。

(二)基于miRNA的治療 在肝纖維化的早期，可以通過適當(dāng)?shù)闹委?，如服用抗病毒藥物或顯著的生活方式改變阻止肝纖維化這一過程[27]。盡管有大量文獻(xiàn)報(bào)道了控制或者逆轉(zhuǎn)纖維化的理論和方法，但這都是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究。目前尚且沒有一種被FDA所批準(zhǔn)上市的抗晚期肝纖維化的藥物。因此對(duì)于尋找能夠抗纖維化乃至逆轉(zhuǎn)肝硬化以及尋找早期發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)肝硬化的指標(biāo)是刻不容緩的任務(wù)。

Wu[28]合成并組裝pH敏感性納米膠束(T-PBP)負(fù)載miRNA-29b和miRNA-122， T-PBP膠束以磁共振成像可見方式有效地將miRNA-29b和miRNA-122轉(zhuǎn)運(yùn)至小鼠HSCs，通過下調(diào)纖維化相關(guān)基因(包括I型膠原蛋白α)的表達(dá)，產(chǎn)生協(xié)同抗纖維化作用。Shanshan Zhu等[29]報(bào)道了MiR-29b的過度表達(dá)降低了蝦青素(Astaxanthin AST)處理的LX-2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，沉默它具有相反的效果。這表明AST可能是通過調(diào)節(jié)MiR-29b，抑制Bcl-2表達(dá)水平和升高Bax和Caspase-3表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡。張利芬等[30]通過將miR-484的抑制劑轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞，qPCR提示抑制劑組的Fis1和caspase-3mRNA的表達(dá)量提高，而且肝纖維化的標(biāo)志物降低，這表明miR-484的靶基因?yàn)镕is1，肝纖維化的指標(biāo)降低。此外抑制劑組的細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡明顯高于空白組以及陰性組,這提示miR-484有促進(jìn)HSCs凋亡的作用。

四、展望

miRNA作為一種重要的非編碼RNA，可以在HSCs的活化，增殖以及凋亡多個(gè)方面進(jìn)行正向或者負(fù)向的調(diào)控，影響基因的表達(dá)水平。但是我們應(yīng)當(dāng)同時(shí)看到，盡管miRNA在進(jìn)化上高度保守，但是大量的文獻(xiàn)報(bào)告的miRNA的表達(dá)差異譜也不盡相同，這可能是由于種屬差異引起的，可能是各種導(dǎo)致肝纖維化的病因激活HSCs的方式不同所致。由于主要受到病理活檢有創(chuàng)操作的限制，基于人類肝臟組織作為標(biāo)本作為探尋差異性的文獻(xiàn)報(bào)道較少。目前探尋差異性表達(dá)的miRNA主要是基于體外模型(如HSC-LX2和HSC-T6)，實(shí)驗(yàn)小鼠以及人類血清的外泌體。外泌體miRNA作為一種新型的信息分子，目前對(duì)于其在肝纖維化過程中的基礎(chǔ)機(jī)制的研究仍然較少。這些都是應(yīng)當(dāng)作為肝病學(xué)者今后亟需不斷探尋的問題和方向。