王一川，劉小靜，葉 峰，楊雪亮，陳 娜，吳劍華，李彥霖

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院 感染科，陜西 西安 710016)

線粒體提供細胞生命活動的大部分能量，其功能障礙與人類疾病有關，包括神經(jīng)和肌肉退化、心血管疾病、肥胖、糖尿病、衰老和罕見的線粒體疾病。線粒體移植治療是從正常組織細胞分離線粒體，然后注入患者線粒體損傷或缺失的部位，使損傷細胞獲得救治、器官功能得以恢復的全新干預技術。在動物實驗中，線粒體移植作為治療包括心臟、肝臟、肺和大腦在內的各種組織的線粒體損傷的有效性已經(jīng)有報道。在臨床試驗中，這種方法僅在一項改善先天性心臟病的心肌缺血再灌注損傷的研究被報道[1]，尚未廣泛應用。因此，本文總結了線粒體移植的研究現(xiàn)狀，希望能對研究者有所啟發(fā)。

1 線粒體的結構、功能和病理狀態(tài)

線粒體由雙層膜結構套疊而成，將線粒體內部空間分成兩個膜性空間。線粒體外層單位膜光滑平整，由1/2的脂類和1/2的蛋白質組成。線粒體內膜比外膜稍薄，將內膜基質分成膜間腔和基質腔兩個部分，內膜上大量向基質腔凸起的結構形成嵴，這樣的結構擴大了線粒體內膜面積，提高了線粒體內化學反應的效率。線粒體DNA是裸露在基質或附著于內膜的雙鏈環(huán)狀分子，編碼線粒體的少部分RNA和蛋白質。功能上，外膜上有大量物質進出線粒體的通道蛋白和特異性受體負責轉運。內膜的電子傳遞鏈與內膜表面附著的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合酶復合體共同完成氧化磷酸化和ATP的合成。線粒體基質則是各種有機物進行最后氧化過程的場所。只有經(jīng)過三羧酸循環(huán)，有機物才能完全氧化，產(chǎn)生比無氧酵解所提供的更多能量。

線粒體的形態(tài)、大小、數(shù)量和排列分布根據(jù)細胞的類型和生理狀態(tài)而不同。線粒體應對氧化應激損傷時，啟動mtDNA轉錄程序緩解應激、將部分線粒體轉移到線粒體衍生囊泡、激活線粒體自噬[2]以及誘導細胞死亡等機制；在結構上表現(xiàn)為線粒體腫脹破裂，內膜結構液化消失等。這些病理狀態(tài)下線粒體功能異常，導致細胞產(chǎn)生代謝障礙，引起肌肉、神經(jīng)、心肌疾病和凋亡等。現(xiàn)有的治療措施主要基于分子水平，包括補充輔酶，減少對缺陷線粒體的排斥和替代缺陷mtDNA等。

2 線粒體轉移的機制

2.1 線粒體細胞間轉移機制

線粒體起源的內共生學說認為，古線粒體作為一種需氧菌被原始真核細胞吞噬，在長期互利共生中演化成了現(xiàn)在的線粒體細胞器。這個假說提示了細胞具有觸發(fā)細胞器交換的機制，以響應來自受累細胞的損傷信號。然而，啟動這一過程的分子線索仍然不明。以神經(jīng)元為例，當大鼠皮層神經(jīng)元受到缺氧葡萄糖剝奪時，細胞內ATP水平下降，神經(jīng)元活力下降；當添加星形膠質細胞細胞外線粒體顆粒后，神經(jīng)元活力恢復[3]。目前的動物器官缺血再灌注模型大多通過血管輸送或直接注射的方法快速有效地完成移植。經(jīng)腹腔靜脈注射后，外源性線粒體分布于小鼠腦、肝、腎、肌肉、心臟等多種組織。然而細胞間線粒體轉移途徑，外源性線粒體通過生理屏障(如血腦屏障)的機制依然有待研究。

細胞間轉移的機制主要由隧道納米管(tunnel-ing nanotube,TNT)、間隙連接和細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的釋放等發(fā)揮作用。TNT是由與靶細胞相連的絲狀細胞膜突起產(chǎn)生的納米管狀的動態(tài)結構。每個細胞的膜延伸融合在一起，從而形成一個緊密連接的橋，它不是固定在膜上，而是懸浮在細胞外空間。TNT參與肺上皮細胞、心肌細胞和急性髓細胞白血病細胞等的線粒體轉運、修復細胞損傷、激活增強免疫反應和細胞代謝重編程。ROS誘導的氧化應激調節(jié)磷脂肌醇3-激酶也與連接蛋白通道的打開有關[4]。供體細胞釋放的EVs可以與接收細胞融合或吞噬來釋放其中的線粒體，動脈內注射骨髓間充質干細胞來源的EVs可減輕局灶性腦損傷引起的神經(jīng)炎性反應[5]。在糖尿病心肌缺血的大鼠模型中證實了肌動蛋白在線粒體細胞間轉移的重要性[6]。

2.2 移植線粒體的來源和移植后免疫反應

干細胞有強大的再生潛力，因此被認為是可靠的線粒體來源。不同供體細胞的線粒體也有不同的功能?；诩毎麑Φ脱醯牟煌磻?，將大鼠從股動脈分離出的線粒體與低氧的肺動脈段共孵育培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，低氧時肺動脈平滑肌細胞線粒體產(chǎn)生的ROS要遠遠多于股動脈平滑肌細胞線粒體。股動脈平滑肌線粒體移植能抑制低氧引起的肺循環(huán)阻力升高[7]。

免疫排斥方面，通過觀察小鼠自體和同種異體的線粒體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應發(fā)現(xiàn)，不管是單次注射還是連續(xù)注射，不管是自體細胞還是異體細胞線粒體注射，與空白對照組相比，血清炎性標志物都無明顯差異[8]。結合古線粒體內共生來源學說，外源性線粒體移植不易引起明顯免疫排斥反應的現(xiàn)象有助于擴大線粒體供體源，為推廣異體線粒體移植治療提供可能。

線粒體移植機制的研究為臨床應用提供了理論基礎，也對線粒體移植的應用提供了更多思路。

3 線粒體移植的臨床探索

3.1 線粒體移植改善缺血/再灌注損傷

3.1.1 心臟缺血/再灌注損傷:缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/RI)是導致線粒體損傷最常見的原因，也是大多數(shù)實驗的模型機制。在心肌缺血再灌注動物模型中初步驗證了心肌源性線粒體的治療作用[9]。結扎兔冠狀動脈左前降支，缺血后將供體兔左心室的線粒體直接注射到心臟缺血的部位，發(fā)現(xiàn)心肌梗死標志物水平顯著降低。隨后驗證了自體線粒體移植的策略，即從骨骼肌中提取的健康的自體線粒體移植到損傷的心肌中，觀察到的線粒體移植組梗死范圍比空白對照組顯著減少[10]。超聲心動圖顯示整體功能無明顯差異。組織化學和透射電鏡顯示，在對照組心肌組織受損，而在線粒體組則不明顯。用同樣方法提取的線粒體注入糖尿病大鼠冠狀動脈也被證實能夠改善心肌缺血的損傷[1]。

線粒體移植在再灌注過程中，而不是在再灌注前立即給予冠狀動脈的問題更接近實際[11]。超聲心動圖分析顯示，再灌注時，局部I/RI后接受線粒體移植的心臟射血分數(shù)、左室短軸縮短率和梗死面積/危險區(qū)域(infarct size/area at risk IS/AAR)都有明顯改善。再灌注結束時，兩組在左室舒張末期壓和左室壓升高速率等整體左室功能測量值上存在差異。兩組之間在危險區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。與對照組相比，接受線粒體移植的IS/AAR明顯減小。

循環(huán)死亡后捐獻(donation after circulatory death,DCD)提供了另一種異體心臟移植來源，但由于缺血的影響而受到限制。研究表明線粒體移植增強DCD心臟心肌功能的效果[12]。停止機械通氣使約克豬循環(huán)衰竭，熱缺血20 min后，給予心臟停搏液。然后在離體血液灌注系統(tǒng)進行心臟再灌注，15 min后，心臟接受溶劑或含有自體線粒體的注射液，實驗組在離體心臟灌注2 h后接受第二次線粒體注射。與溶劑組相比，接受線粒體注射液組的左心室/心室峰值發(fā)展壓力、最大左心室/心室壓力升高，左室縮短分數(shù)和心肌耗氧量顯著增加，心肌梗死面積明顯縮小。這一研究表明線粒體移植顯著地保留了DCD心臟的心肌功能和耗氧量，從而為擴大心臟供體池提供了可能的選擇。

對先天性心臟病手術干預和體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)支持沒有改善的患兒從自體腹直肌中分離出線粒體，然后從心外膜注入超聲心動圖提示有缺血再灌注損傷的心肌中[1]。所有患者均無與心外膜注射相關的心律失?；虺鲅?，5例患者中，4例心室功能改善，并成功脫離ECMO支持。注射前和注射后全身炎性反應綜合征的標志物(穩(wěn)定的呼吸和腎臟狀態(tài))無明顯差異，這與動物研究數(shù)據(jù)一致。其中一例患者的尸檢顯示在注射部位沒有炎性或排斥的跡象，白細胞計數(shù)沒有臨床相關變化，提示自體線粒體移植不會引起明顯的炎性反應。然而，選擇這組患者是因為ECMO支持后心肌功能未恢復，而且心室功能的恢復也希望渺茫。評估不同治療時機，確定線粒體的劑量和不同給藥方法仍有待研究。

3.1.2 肺缺血/再灌注損傷：缺血/再灌注損傷是導致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)最常見的原因之一。體外氣體交換、體外循環(huán)和機械通氣均可導致I/RI。I/RI對肺功能和細胞活力有深遠影響，并顯著增加兒童和成人患者的發(fā)病率和病死率。線粒體損傷在ALI中起著重要作用，為肺I/RI的治療提供策略。

用雄性C57BL/6J小鼠研究了線粒體移植在小鼠肺I/RI模型中的效果。通過開胸手術在左肺門部應用微血管鉗夾閉2 h誘發(fā)短暫性缺血[13]。再灌注后，小鼠通過肺動脈血管或吸入氣管氣霧劑給藥，給小鼠注射含有線粒體的載體或空白載體。假對照組小鼠開胸不夾閉肺門。24 h后，評估肺力學參數(shù)并收集肺部組織進行分析。結果表明，再灌注24 h后，與相應的溶媒組相比，線粒體吸入組的動態(tài)順應性和吸氣量顯著增加，阻力、組織阻尼、彈性和吸氣峰壓(僅動脈注射組)顯著降低；與假對照組相比，線粒體移植組中性粒細胞浸潤、間質水腫和凋亡明顯減少。各組間細胞因子和趨化因子無明顯差異。這些結果表明，血管輸送或霧化吸入線粒體移植都可以改善肺機械功能，減少肺組織損傷。

3.1.3 骨骼肌缺血/再灌注損傷:骨骼肌也是富含線粒體的重要器官。在小鼠的左后肢急性缺血模型中，用止血帶引起缺血2 h后，恢復后肢再灌注。將空白對照或線粒體溶液直接注射到后肢的所有肌肉中。線粒體以不同濃度梯度被注射到每塊肌肉。假性對照組不接受缺血或注射，但麻醉2 h后恢復。在后肢再灌注24 h后，線粒體移植組小鼠腓腸肌、比目魚肌和股內側肌的梗死面積比空白對照組明顯減少，后肢的站立能力明顯增強，站立能力與非缺血組無明顯差異[14]。

3.1.4 腎臟缺血/再灌注損傷:腎臟的線粒體含量和耗氧率僅次于心臟。由于線粒體的功能和生存能力依賴于血液輸送的穩(wěn)定氧氣供應，氧氣輸送的中斷或停止以及由此產(chǎn)生的I/RI嚴重損害線粒體的能量生產(chǎn)，導致腎功能不全或衰竭。以豬雙側腎缺血再灌注損傷為模型研究線粒體移植的腎臟作用[15]。用球囊導管對雌性約克郡豬進行經(jīng)皮雙側腎動脈暫時閉塞術，缺血60 min后，將球囊導管放氣，以單次給藥的方式將線粒體輸送至腎動脈。注入的線粒體迅速被腎臟吸收，分布在皮質和髓質的管狀上皮細胞中。再灌注24 h后，與溶劑組相比，線粒體治療組血尿素氮明顯降低。大體解剖、病理組織學分析、急性腎小管壞死評分和透射電鏡顯示，溶劑組的腎皮質主要是近端小管發(fā)生廣泛的凝固性壞死，而線粒體移植腎僅表現(xiàn)為斑片狀輕度急性腎小管損傷。與接受線粒體移植的腎臟相比，溶劑處理的腎臟的腎皮質IL-6表達顯著增加。這些結果表明，動脈內注射線粒體可保護腎臟免受缺血再灌注損傷，顯著增強腎功能，減輕腎損害。

3.2 線粒體移植改善代謝功能

線粒體功能障礙導致肝細胞脂質堆積，是引起非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的一個重要機制。外源性線粒體對高脂肪飲食誘導的小鼠脂肪肝有治療作用[16]。他們用小鼠隨機分為4組(每組12只)。第一組為正常對照組，其余3組灌胃給予高脂高膽固醇飼料，線粒體治療1組小鼠3 d內靜脈注射從肝癌細胞中分離的線粒體，共3次；治療2組小鼠接受線粒體6次。脂肪肝組給予等量0.9%氯化鈉溶液。用GFP標記線粒體，觀察靜脈注射后外源性線粒體在體內的分布。小鼠注射2 h后，肝、肺、腦、肌、腎出現(xiàn)熒光，表明熒光蛋白標記的線粒體可進入小鼠組織細胞。線粒體治療組血清轉氨酶活性和膽固醇水平呈劑量依賴性下降。同時減少了脂肪肝小鼠的脂質積累和氧化損傷，提高能量的產(chǎn)生，從而恢復肝細胞功能。線粒體移植治療策略為NAFLD的治療提供了一種新的潛在的治療途徑。

3.3 線粒體移植改善神經(jīng)功能

神經(jīng)元和膠質細胞通過不同的細胞內和細胞間信號機制維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),線粒體的跨細胞轉移已經(jīng)成為這種交流的一個重要例子。大量證據(jù)表明線粒體功能的損傷對于帕金森的疾病進展有重要作用[17]。然而由于線粒體蛋白和DNA結構的不穩(wěn)定，線粒體靶向藥物只能提供有限的神經(jīng)保護。在小鼠強迫游泳試驗中，補充線粒體組的小鼠耐力增強;而在帕金森病模型小鼠中，線粒體移植通過增加電子傳遞鏈的活性、降低活性氧水平、防止細胞凋亡和壞死來阻止帕金森病的實驗進展[17]。

在一種短暫局部腦缺血模型中，用星形膠質細胞來源的細胞外線粒體，注射到局灶性腦缺血小鼠模型的梗死周圍區(qū)域后，可被神經(jīng)元獲取，這表明線粒體注射可能是治療卒中的一種新的治療方法[3]。從進一步研究發(fā)現(xiàn)，在接受高壓氧預處理從星形膠質細胞中轉移線粒體可以減輕大鼠神經(jīng)元的缺血死亡[18]。腦脊液mtDNA減少是神經(jīng)退行性疾病的一個特征，如帕金森病、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和多發(fā)性硬化癥[19]。一項阿爾茨海默病生物標志候選物的蛋白質組學篩選中發(fā)現(xiàn)的潛在AD信號中59%是線粒體蛋白，強調了線粒體功能障礙在AD中的重要地位[20]。然而，線粒體功能障礙是否存在于所有神經(jīng)退行性疾病中，以及它與神經(jīng)退行性病變的關系有待進一步研究。

小膠質細胞活化和線粒體功能障礙是膿毒癥引起腦功能障礙的兩個主要因素。線粒體功能障礙可改變小膠質細胞的免疫特性，使其趨向促炎性表型。線粒體治療通過增強從M1表型到M2表型的小膠質細胞極化和抑制小膠質來源的炎性細胞因子的釋放來提供神經(jīng)保護，改善了膿毒癥幸存者的認知障礙，支持了外源性線粒體移植療法的潛在應用。

3.4 線粒體移植對腫瘤細胞的影響

癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)能重塑癌細胞的線粒體網(wǎng)絡和基因組表達，從而使癌細胞產(chǎn)生耐藥性。在前列腺癌[21]和急性淋巴細胞白血病[22]中，初級CAFs已經(jīng)被證明通過TNT將線粒體轉移到癌細胞。從CAFs水平轉移功能性線粒體可提高前列腺癌細胞線粒體的質量和活性，從而進一步促進惡性腫瘤的發(fā)生[21]。在骨髓微環(huán)境中，抗腫瘤藥物可以刺激胞吞作用的線粒體轉移，黏附于骨髓基質細胞的急性髓細胞白血病細胞的ATP含量增加，從而產(chǎn)生阿糖胞苷藥物的抗性[23]。線粒體轉移相關信號分子可能成為新的化療藥物作用靶點。

從星形膠質細胞中提取的線粒體移植入人神經(jīng)膠質瘤細胞中能有效地加劇輻射誘導的細胞核DNA 損傷，通過對mtDNA缺失的細胞模型的構建，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞內移植的外源線粒體能夠在增強X線損傷腫瘤細胞核DNA 的過程中起到至關重要的作用[24]。

4 問題與展望

隨著研究的深入，對線粒體的認識已經(jīng)不局限于產(chǎn)生能量維持細胞功能，在清除自由基，延緩衰老，促進代謝方面的作用也逐漸得到重視，但機制還不明確。線粒體移植為許多疾病開辟了新的視野，相關的動物模型和臨床研究還有待完善。線粒體功能障礙威脅細胞的穩(wěn)態(tài)，干擾能量生產(chǎn)，最終導致細胞死亡和疾病。為了治療更多的患者，強烈需要相關藥物開發(fā)以擴大線粒體移植治療的使用范圍。